Name: Imágenes en vivo de los receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra durante las respuestas de la herida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Aprende a visualizar la dinámica de receptores de quimioquinas en neutrófilos de pez cebra durante la respuesta inflamatoria a heridas. Este protocolo utiliza microscopía confocal de disco giratorio para analizar el comportamiento de CXCR1 y CXCR2 in vivo.

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Agradecemos a Christine Holt y Bill Harris por su ayuda con la microscopía confocal. Agradecemos a Darren Gilmour por las construcciones de la columna vertebral del temporizador fluorescente y a Anna Huttenlocher por el vector de la columna vertebral Tol2-Lyz. Agradecemos a Steve Renshaw por la línea Tg(mpx:GFP)i114 . Esta labor contó con el apoyo del MRC (MR/L019523/1), el Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] y una subvención de Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. contó con el apoyo de una beca de MRC DTP y en parte del Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subvención. H.W. fue apoyado por un MRC DTP Studentship. H.P. fue apoyado por una beca de doctorado de Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) y en parte por un Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Subvención del Isaac Newton Trust [12.21(a)i] y el MRC (MR/L019523/1).

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Los autores declaran no tener conflicto de intereses

El método descrito permite obtener imágenes en vivo de la dinámica de los receptores en respuesta a ligandos endógenos in situ durante una respuesta inflamatoria al daño tisular. El uso de reporteros de neutrófilos Cxcr1/Cxcr2 podría ampliarse a otros entornos fisiológicos, como infecciones, modelos tumorales u otros tipos de daño tisular 14,25,26,27. Además, las líneas de rescate transgénico, en las que el receptor endógeno es suprimido y rescatado por un receptor mutante exógeno, podrían proporcionar herramientas útiles para diseccionar la importancia de los patrones específicos de migración de neutrófilos en las respuestas inmunes. Por ejemplo, los mutantes del receptor Cxcr1 que tienen una desensibilización deteriorada causan agrupamiento de neutrófilos más prominente en los sitios inflamatorios14. Esta ganancia de fenotipo de función podría usarse para comprender el papel de la congregación de neutrófilos en diferentes procesos fisiológicos, por ejemplo, reparación de heridas, enfermedades infecciosas o evolución tumoral, y experimentos de derribo / eliminación de receptores del complemento. La metodología también proporciona una base para ampliar la gama de reporteros disponibles. La elección del reportero fluorescente es importante de considerar y depende de la cuestión biológica. Encontramos que el recambio constitutivo de estos receptores de quimiocinas en neutrófilos fue alto, en comparación con las células epiteliales, y que los reporteros con maduración rápida (p.ej., sfGFP) debían informar los niveles de membrana en estado estacionario y resolver las diferencias tras la estimulación de neutrófilos 8,14. Por lo tanto, las proporciones de membrana de sfGFP / tagRFP no son aplicables para medir la internalización inducida por ligandos en este tipo de célula, pero el patrón de tagRFP permite el seguimiento de los destinos intracelulares del receptor, lo que podría ser útil en algunos estudios. También encontramos que la señal intracelular más concentrada de tagRFP es útil para la detección de larvas individuales. Un enfoque alternativo para medir los niveles de receptores en la membrana plasmática sería coexpresar un marcador de membrana fluorescente en neutrófilos, ya sea en el mismo transgén9 o en un transgén14 independiente. En el primer escenario, el transgén proporcionaría un medio adicional para examinar a los peces y los niveles de expresión serían comparables entre el marcador y el receptor. Este último enfoque sería más modular, ya que una línea de pez cebra con un reportero receptor podría combinarse con diferentes líneas de reportero. En cualquier caso, vale la pena señalar que la cuantificación de la membrana de los niveles del receptor es un desafío en los neutrófilos agrupados (ver más abajo). Finalmente, observamos que una posible extensión de este protocolo sería hacer un seguimiento de las imágenes en vivo por inmunohistoquímica para análisis de localización más detallados.
El sistema de transgénesis Tol2 está bien establecido7 y el promotor de lisozima C se ha utilizado ampliamente para la expresión de neutrófilos11,15. El enfoque de transgénesis es, por lo tanto, relativamente sencillo y el nivel de expresión alcanzado con este promotor es lo suficientemente alto como para proporcionar suficiente contraste para el análisis de la dinámica del receptor. Una posible limitación es que el nivel de expresión no recapitula los niveles de expresión del receptor endógeno. Se podrían implementar nuevas tecnologías CRISPR para establecer líneas de llamada para receptores de particular interés28. Estas tecnologías siguen siendo engorrosas y pueden no garantizar los niveles de expresión requeridos para las imágenes subcelulares, pero su desarrollo exitoso sería un avance importante para comprender la dinámica de señalización endógena. Las validaciones funcionales son importantes para interpretar los datos con construcciones de receptores transgénicos. Por ejemplo, los ensayos de reconocimiento de ligandos se pueden utilizar para establecer que la proteína de fusión fluorescente es funcional y el rescate de fenotipos knockout podría utilizarse para establecer que los niveles de expresión de neutrófilos transgénicos son compatibles con la funcionalidad14. Finalmente, una forma más directa de validar la fusión del receptor sería utilizar un ensayo funcional in vitro con receptor etiquetado junto con las versiones no marcadas14.
El enfoque de cuantificación aborda dificultades específicas en la segmentación precisa de la membrana en neutrófilos in vivo. En células de naturaleza epitelial, la cuantificación de los niveles de receptores se puede ejecutar automáticamente normalizando los niveles de receptores de membrana a un marcador de control, que se puede expresar en tándem o por separado9. De hecho, hemos aplicado este enfoque, al utilizar el ensayo de reconocimiento de ligandos en embriones gastrulatantes14. Sin embargo, los neutrófilos experimentan cambios complejos y rápidos en la forma de la célula in vivo, lo que dificulta la segmentación de la membrana tanto en 2D como en 3D14. Esto es aún más difícil cuando los neutrófilos se agrupan, lo que ocurre en muchos entornos fisiológicos29. La métrica de contraste supera esta limitación, ya que no requiere segmentación de membrana, sino que refleja el estado general de distribución del receptor en la célula (membranoso / liso vs vesicular / puntiagudo). Es importante tener en cuenta que la métrica de contraste puede verse afectada por el contraste general de la imagen, por lo que se requiere la normalización de los valores celulares individuales a una referencia interna para tener en cuenta la variabilidad de la señal en diferentes embriones / muestras. Por ejemplo, utilizamos el valor medio de contraste celular de neutrófilos no sensibles en la CHT (es decir, neutrófilos que permanecen estacionarios y no migran a la aleta ventral)14. Una posibilidad adicional sería normalizar con valores de contraste de un marcador de control en la misma celda. Esto proporcionaría una solución cuando no se dispone de una referencia interna de células que no responden y es probable que resuelva diferencias cuantitativas más finas en la dinámica del receptor entre diferentes afecciones.
La ubicación de las imágenes es otra variable a considerar. La razón para elegir la herida de la aleta ventral aquí, a diferencia del modelo de herida de la aleta caudal más comúnmente utilizado16,30, es porque el sitio de la herida está cerca del sitio de residencia de neutrófilos / origen migratorio. Esto acelera la línea de tiempo del ensayo, ya que los neutrófilos tardan relativamente poco tiempo en llegar. Además, brinda la oportunidad de capturar el comportamiento celular tanto en el origen de la migración (CHT) como en la ubicación objetivo de interés (herida). Esto es relevante aquí, porque la resolución espacial y temporal requerida para las imágenes subcelulares es difícil de combinar con un gran campo de visión o escaneo de múltiples posiciones. Así, el ensayo de herida de aleta ventral permite rastrear la evolución de la respuesta migratoria desde el origen migratorio y la captura simultánea de fluctuaciones inespecíficas del receptor en células que no responden. Como se mencionó anteriormente, este último es útil para fines de cuantificación, ya que proporciona una referencia interna para dinámicas inespecíficas. En otros sistemas, puede que no sea posible disponer de una referencia interna de este tipo, en cuyo caso los valores de contraste de un marcador de membrana coexpresado proporcionarían un control alternativo.
En resumen, anticipamos que la metodología es aplicable a otros sistemas y se puede implementar para una variedad de propósitos. Por ejemplo, los mismos reporteros podrían utilizarse en otros entornos inflamatorios, como entornos de infección u otros modelos de enfermedad. El repertorio de líneas reporteras de receptores de pez cebra podría ampliarse a otros receptores de señalización, para comprender los mecanismos de señalización o informar sobre la dinámica del ligando in vivo. El enfoque se puede combinar con técnicas de derribo / nocaut para interrogar la base mecanicista de la dinámica observada. Por ejemplo, la perturbación de la expresión del ligando puede indicar la dependencia del ligando para la dinámica del receptor observada. En el futuro, prevemos que el sistema podría perfeccionarse aún más para incorporar la inserción de reporteros. En última instancia, los hallazgos que utilizan esta metodología proporcionarían nuevos conocimientos valiosos más allá de la comunidad del pez cebra, dada la conservación de estos receptores de señalización en mamíferos y el desafío relativo de realizar estos estudios en organismos más grandes.

La migración de leucocitos es de suma importancia para las respuestas inmunes. Las células inmunes son células migratorias prototípicas, que son notablemente capaces de atravesar tejidos y vasos sanguíneos y detectar una serie de señales de guía química para migrar direccionalmente hacia microbios u otras células huésped de importancia. La orientación correcta se basa en el reconocimiento de quimioatrayentes, entre los cuales las quimiocinas representan la categoría1 más prominente. Las quimiocinas son reconocidas por receptores altamente específicos acoplados a la proteína G de siete transmembranas. Tras la unión a quimiocinas, los receptores de quimiocinas cambian la conformación, lo que lleva a la activación de las proteínas G triméricas asociadas y su disociación en subunidades de señalización funcional que promueven cambios citoesqueléticos y migración dirigida1. Secundariamente, los receptores de quimiocinas están fosforilados, y esta modificación conduce a la desensibilización al atrayente, que puede ser seguida por una rápida resensibilización / reciclaje o degradación intracelular y regulación descendente de la superficie celular2. Esta dinámica de los receptores influye en la duración y la dosis de señalización recibida por las células, pero la forma en que afectan el comportamiento de migración de leucocitos ha sido difícil de dilucidar in vivo.
El seguimiento de la dinámica de los receptores en leucocitos vivos en sistemas tradicionales de mamíferos se enfrenta a varios desafíos. Para los estudios en vivo, las fusiones de receptores con proteínas fluorescentes deben expresarse en las células. Esto es un desafío en los leucocitos primarios, particularmente en neutrófilos, y los estudios hasta ahora han utilizado líneas celulares de neutrófilos sustitutos para expresar los receptores de quimiocinas 3,4. La generación de modelos de ratón transgénico, en los que los leucocitos expresan un receptor fluorescente o receptores mutantes con defectos de tráfico informativos 5,6, conlleva una considerable inversión de tiempo y recursos. Incluso en estos casos, la resolución de imágenes y el contraste para la dinámica de los receptores de imágenes en el animal vivo pueden ser limitados y los estudios han utilizado inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo5. Dados estos desafíos técnicos, nuestra comprensión de cómo la dinámica de los receptores quimioatrayentes afecta el comportamiento celular en un entorno de tejido vivo es actualmente limitada.
Aquí proporcionamos una metodología para monitorear el tráfico de receptores en neutrófilos de pez cebra. Los peces cebra son genéticamente tratables, como los ratones, pero la transgénesis es relativamente más sencilla mediante el uso de sistemas de transposones eficientes y la manipulación directa decigotos 7. La larva transparente es idealmente susceptible de imágenes. La dinámica del receptor de quimiocinas se ha visualizado en células germinales primordiales y en la línea lateral primordium mediante la expresión de fusiones correspondientes con reporteros fluorescentes 8,9,10. Las larvas de pez cebra están equipadas con neutrófilos maduros que tienen propiedades genéticas y celulares altamente conservadas con respecto a los neutrófilos de mamíferos. La dinámica de señalización subcelular como la dinámica citoesquelética y los reguladores de polaridad se han visualizado en estas células mediante la generación de las líneas transgénicas correspondientes 11,12,13. Recientemente, visualizamos y analizamos funcionalmente la dinámica de los receptores de quimiocinas en neutrófilos durante el curso de las respuestas inflamatorias al daño tisular14. Aquí, describimos la generación de líneas reporteras transgénicas para la señalización de quimiocinas en neutrófilos, la preparación de embriones para imágenes en vivo, un ensayo de heridas para el estudio de la señalización de neutrófilos y el protocolo para la adquisición y análisis de imágenes. También proporcionamos un protocolo lateral para probar las respuestas de los receptores de quimiocinas a los ligandos candidatos, que es útil cuando se trata de establecer patrones de reconocimiento de ligandos en receptores no caracterizados. Estas técnicas se pueden utilizar en combinación con otras manipulaciones genéticas, como la inhibición de la expresión endógena de quimiocinas o la generación de receptores mutantes con tráfico alterado inducido por ligandos, para interrogar cómo la dinámica de señalización específica afecta el comportamiento de los leucocitos in vivo. Las líneas transgénicas que expresan receptores de quimiocinas marcados fluorescentemente también se pueden usar como reporteros para gradientes endógenos de quimiocinas, que de otro modo son difíciles de detectar por tinción directa de anticuerpos. La metodología descrita proporciona un margen para ampliar la generación de reporteros a otros receptores de inmunocopuntía.

<table><tbody><tr><td>1-fenil-2-tiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL Tubo de centrífuga</td><td>CellStar Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Clark vidrio capilar</td> Harvard <td>Apparatus</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline Thin</td><td>Bleach Suministros de laboratorio científico</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>Visor de disección</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de bloque Dri</td><td>Techne FDB02AD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas, Joyeros Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Platos de micropocillos con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta pasteur de vidrio</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripción</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Leica SP8</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azul</td> <td>de metilenoSigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microinyección</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta con microcargador</td><td>Eppendorf</td><td></td> Micromanipulador 5242956003 <td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Disco giratorio UltraVIEW ERS, Olympus IX81 Disco giratorio Microscopio confocal</td><td>Olympus</td><td>N/A Placa</td><td></td></tr><tr>de<td>Petri (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Rojo de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Tailing Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prisma</td><td>Software</td><td></td><td></td>GraphPad</tr><tr><td>Pincel pequeño</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Applied Research Módulo</td><td></td> láser LMM5 <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí quirúrgico Nº 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Software Volocity</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU10 escáner confocal de disco giratorio</td><td>Yokogawa N</td><td>/A</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo de los receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra durante las respuestas de la herida

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

La guía de leucocitos por gradientes químicos es esencial para las respuestas inmunes. Los neutrófilos son las primeras células en ser reclutadas en sitios de daño tisular donde ejecutan funciones antimicrobianas cruciales. Su tráfico a estos loci está orquestado por varios quimioatrayentes inflamatorios, incluidas las quimiocinas. A nivel molecular, la señalización quimioatrayente está regulada por el tráfico intracelular de los receptores correspondientes. Sin embargo, no está claro cómo los cambios subcelulares en los receptores de quimiocinas afectan la dinámica de migración de leucocitos a nivel celular y tisular. Aquí describimos una metodología para imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores de quimiocinas en neutrófilos durante las respuestas inflamatorias al daño tisular. Estas herramientas han revelado que el tráfico diferencial de receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra coordina la agrupación y dispersión de neutrófilos en sitios de daño tisular. Esto tiene implicaciones para nuestra comprensión de cómo las respuestas inflamatorias se auto-resuelven. Las herramientas descritas podrían utilizarse para comprender los patrones de migración de neutrófilos en una variedad de entornos fisiológicos y patológicos y la metodología podría ampliarse a otros receptores de señalización.

La herida de la aleta ventral es seguida por una rápida movilización de neutrófilos desde el CHT hacia la aleta ventral y la agrupación en el margen de la herida, dentro de los 30-60 min (Figura 1). Visualizamos la distribución de dos receptores de quimiocinas, Cxcr1 y Cxcr2, que son expresados por los neutrófilos de pez cebra24 y reconocen Cxcl8a y Cxcl8b14, utilizando microscopía confocal de disco giratorio. Generamos dos líneas transgénicas correspondientes, Tg(lyz:Cxcr1-FT) y Tg(lyz:Cxcr2-FT), en las que los neutrófilos expresan un constructo de temporizador fluorescente (FT) del receptor, es decir, una fusión con un tándem de sfGFP y tagRFP (Figura 2 y referencia14). El uso de los dos fluoróforos estaba destinado a permitir el monitoreo de una amplia gama de destinos de receptores y proporcionar estimaciones del tiempo de renovación de proteínas en la membrana plasmática, ya que los receptores recién sintetizados fluorescen en verde y progresivamente se volverían rojos a medida que envejecen 8,14. Sin embargo, se encontró que estos receptores tenían un rápido recambio constitutivo en la membrana plasmática de neutrófilos y que el tiempo de residencia era más corto que el tiempo de maduración de tagRFP, con sfGFP mostrando localización de membrana y tagRFP mostrando localización vesicular en estado estacionario (Video suplementario 1 y ref14). Por lo tanto, nos centramos en la distribución de sfGFP para monitorear la internalización inducida por ligandos en sitios de daño tisular. El patrón de distribución del receptor se cuantificó utilizando la métrica de contraste, que informa las diferencias de intensidad entre los píxeles vecinos. La razón es que cuando la distribución del receptor es membranosa y suave, el valor de contraste es bajo. Cuando la distribución del receptor es vesicular y más punteada, entonces el valor de contraste es alto (Figura 3).
Un método alternativo es cuantificar la relación entre los niveles de receptores (intensidad de sfGFP) sobre los niveles de un marcador de membrana de control, por ejemplo, CFP de membrana (mCFP) (Figura 3). Ambos métodos podrían detectar la internalización del receptor, como lo indica un patrón de distribución de receptores vesiculares más globalmente en la célula (mayor valor de contraste) o niveles más bajos de receptores en la membrana (menor relación sfGFP / mCFP). Sin embargo, la métrica de contraste también pudo detectar la internalización del receptor en grupos de neutrófilos en la herida, en los que la segmentación de la membrana fue menos precisa y no aplicable (Figura 3). Utilizando esta métrica, pudimos cuantificar las diferencias visibles entre el tráfico de Neutrófilos en las heridas de Cxcr1 y Cxcr2 (Figura 4 y Video Complementario 2). Cxcr1-FT internalizado en células localizadas en la herida, mientras que Cxcr2-FT permaneció membranoso en neutrófilos en la herida (Figura 4A-C, Video Suplementario 2 y Video Suplementario 3). La supresión de Cxcl8a y Cxcl8b, mediante tratamiento con morfolino, afectó diferencialmente la internalización de Cxcr1-FT en las heridas (Figura 4C,D). Para validar aún más que Cxcr1-FT responde a Cxcl8a, realizamos ensayos de respuesta de quimiocinas en embriones tempranos. Encontramos que Cxcr1-FT se interiorizó marcadamente en embriones en los que Cxcl8a fue coexpresado (Figura 5). En conjunto, estos resultados indican que los métodos descritos se pueden implementar para medir la internalización del receptor inducida por quimiocinas en neutrófilos y establecer la identidad del ligando que media estos efectos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figura 1: Migración de neutrófilos a heridas de aleta ventral. (A) (Izquierda) Caricatura de larva de 3 dpf que muestra la ubicación del tejido hematopoyético caudal (CHT), la circulación de venus (VC, azul), la aleta ventral (VF) y el sitio de la herida. (Derecha) Caricatura que representa el área de la herida (W) con neutrófilos que se movilizan desde el CHT y se agrupan en la herida. El plexo de la vena caudal (CVP) del tejido CHT se dibuja en azul. (B) Imagen de campo brillante (izquierda) y proyección confocal (derecha) que muestra la herida de la aleta ventral y la distribución de neutrófilos en larvas de Tg (mpx: GFP) a las 2 h después de la herida. Las líneas discontinuas muestran los contornos vf y CHT. Barra de escala = 25 μm. Caricatura e imagen fluorescente modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes en vivo del tráfico de receptores de quimiocinas en neutrófilos. (A) Constructos utilizados para la expresión transgénica específica de neutrófilos de Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) y Cxcr2-FT. Proyecciones confocales de neutrófilos en la cabeza de una larva transgénica de 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), arriba; Tg(lyz:Cxcr2-FT), abajo) mostrando los canales tRFP (magenta) y sfGFP (verde). Barra de escala = 20 μm. (B) Esquema anatómico de larva de 3 dpf como en la Figura 1A. Debajo de la larva hay esquemas que representan el área de la herida (W) con neutrófilos que se movilizan desde el CHT (parte superior) o realizan quimiotaxis al ingresar a la aleta ventral (abajo). El cuadrado discontinuo indica el área fotografiada en instantáneas a la derecha. (C) Neutrófilos en larvas de Tg(lyz:Cxcr1-FT) (se muestra sfGFP) al movilizarse desde el CHT (paneles superiores) o quimiotaxis hacia la herida (paneles inferiores). Las flechas muestran las mismas celdas a lo largo del tiempo. Los puntos de tiempo en la imagen de la derecha son minutos transcurridos después de la imagen de la izquierda. Barra de escala = 10 μm. (D) Representación esquemática del enfoque experimental para la obtención de imágenes en vivo del tráfico de receptores de quimiocinas. Paneles A-C modificados de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figura 3: Ejemplos de cuantificación de la dinámica de los receptores. Los neutrófilos individuales (azules) o agrupados (verdes) en las heridas o los neutrófilos no movilizados en el CHT (rojo, naranja) fueron segmentados y analizados por diferentes métodos para comparar los resultados. Las mismas celdas de ejemplo mostradas fueron analizadas con dos métodos para relacionar lo que se ve en la imagen con el rango de valores extraídos. (A) La superficie de las celdas de ejemplo seleccionadas se segmentó en función de la definición del contorno en el canal sfGFP. (B) El contraste se calculó a partir de las células de ejemplo que se muestran en A. (C) La membrana de las células de ejemplo seleccionadas se segmentó en función de la definición del contorno en el canal CFP. Se siguió un análisis ratiométrico de sfGFP/CFP. (D) La relación sfGFP/CFP se calculó sobre las celdas de ejemplo que se muestran en C. Las barras de error representan S.E.M. a partir de celdas individuales, en casos de n&gt;1, los valores aquí no se utilizaron para el análisis estadístico sino simplemente para ejemplificar las mediciones obtenidas con los diferentes métodos de cuantificación. Barra de escala = 10 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figura 4: Dinámica diferencial de Cxcr1 y Cxcr2 en respuesta a heridas. (A) Proyección confocal de neutrófilos en larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) o Tg(lyz:Cxcr2-FT) en la herida a los 80 min post-herida (se muestra el canal sfGFP). Barra de escala = 10 μm.  (B) Neutrófilo Cxcr1-FT magnificado (izquierda) y Cxcr2-FT (derecha) en la herida. El receptor verde se muestra en gris. Barra de escala = 5 μm. (C) Contraste normalizado (contraste por neutrófilo individual normalizado al contraste medio de células no movilizadas en el CHT). cxcl8a se refiere a la inyección de un bloqueo de empalme junto con un morfolino que bloquea la traslación para cxcl8a. cxcl8b se refiere a la inyección con un morfolino que bloquea el empalme para cxcl8b. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 células (CHT), n=47 células (herida) de 8 larvas. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT) con morfolinos: n=28 células (Cxcl8a-MO) de 5 larvas, n=16 células (Cxcl8b-MO) de 5 larvas. Para Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 células (CHT) y n=20 células (herida) de 3 larvas. Los datos se agruparon a partir de larvas independientes adquiridas en 1-5 sesiones de imágenes. Prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn para Tg(lyz:Cxcr1-FT), prueba de Mann-Whitney de dos colas sin aparear para Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Proyección confocal de neutrófilos en larvas transgénicas Tg(lyz:Cxcr1-FT) tratadas con cxcl8a morfolino (MO) (izquierda) y cxcl8b MO (derecha) respondiendo a heridas en las aletas (canal sfGFP mostrado en verde). Instantánea tomada en puntos de tiempo de acumulación equivalente de neutrófilos (85 min post-herida en la imagen izquierda y 45 min post-herida en la imagen derecha). Barra de escala = 10 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figura 5: Ensayo de respuesta a quimiocinas en embriones tempranos. Se inyectaron cortes confocales de barrido láser de embriones gastrulatantes que muestran expresión y distribución de Cxcr1-FT. Se inyectaron 100 pg de ARNm Cxcr1-FT en un óvulo en etapa celular con o sin ARNm Cxcl8a de 150 pg. Los receptores verde y rojo se muestran en canales separados. El marcador CFP de membrana de control (mCFP) se muestra en el canal cian. Barra de escala = 20 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Película suplementaria 1: Neutrófilos transgénicos en la cabeza de una larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (izquierda) y Tg(lyz:Cxcr2-FT) (derecha) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 5 fps. Barra de escala = 20 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Película complementaria 2: Neutrófilos en larvas transgénicas Tg(lyz:Cxcr1-FT) (izquierda) y Tg(lyz:Cxcr2-FT) (derecha) que responden a heridas en las aletas. La película comienza dentro de los 10 minutos posteriores a la herida y dura 60 minutos sfGFP (verde), tagRFP (magenta). El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 10 fps. CHT = tejido hematopoyético caudal. VF = aleta ventral. Barra de escala = 25 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Película suplementaria 3. Ejemplos adicionales de neutrófilos de una larva transgénica Tg(lyz:Cxcr1- FT) herida (larva diferente a la que se muestra en el Video 2), adquirida a mayor resolución, mostrando internalización del receptor (canal sfGFP mostrado en verde) al movilizarse en el CHT o al ingresar y quimiotaxis en la aleta ventral. El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 2 fps. Barra de escala = 10 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Archivo complementario 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Aquí describimos protocolos para realizar imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores quimioatrayentes en neutrófilos de pez cebra

Imágenes en vivo de los receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra durante las respuestas de la herida

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Los neutrófilos son células inflamatorias importantes que se infiltran en las heridas en respuesta a ligandos químicos producidos localmente. Este protocolo permite la visualización de la dinámica de los receptores en respuesta a dichos ligandos in vivo. El uso de los receptores de quimiocinas podría ampliarse a otros entornos fisiológicos, como modelos de infección y tumores, y a otras células inmunitarias.El método permite rastrear cuándo y dónde en el tejido, los leucocitos detectan las moléculas quimio-atrayentes. Esto puede permitir una mejor comprensión de cómo se desarrollan y resuelven las respuestas inmunitarias. Realizar un herido en la aleta ventral en larvas de pez cebra requiere una manipulación fina de las larvas, por lo que se requiere cierta práctica en larvas que no están destinadas a fines experimentales.En el día 2,5 a 3,5 después de la fertilización, coloque las larvas de pez cebra anestesiadas bajo un endoscopio de disección fluorescente y seleccione las larvas con expresión de receptores transgénicos. Transfiera las larvas seleccionadas a una placa de Petri de 120 milímetros que contenga tricaína suplementada con medio E3 y use un bisturí estéril para cortar la aleta ventral de cada larva lo suficientemente profunda como para causar un reclutamiento sustancial de neutrófilos sin cortar los vasos de tejido hematopoyético caudal. Agregue 500 microlitros de tricaína 2X a un plato con fondo de vidrio, luego agregue 500 microlitros de solución de agarosa y mezcle revolviendo suavemente con la punta de la pipeta.Use una pipeta para transferir las larvas de pez cebra anestesiadas heridas al plato y oriente el embrión lateralmente mientras empuja suavemente hacia abajo para que la parte caudal del pez esté lo más cerca posible del fondo de vidrio. Cuando el embrión esté en posición, deje que la agarosa se enfríe. Después de cinco a 10 minutos, toque suavemente el gel con un pincel pequeño para confirmar la solidificación y agregue dos mililitros de medio E3 complementado con 0,2 miligramos por mililitro de Tricaína al plato.Tome imágenes del sitio de la herida con un microscopio confocal de disco giratorio. Tan pronto como sea posible, después de que la agarosa cuaje, transfiera el embrión a la plataforma de disco giratorio de imágenes confocales y use el joystick de la platina y el objetivo del microscopio para localizar los peces. Usando el objetivo de 30 a 40X, concéntrese en el área de la herida y seleccione el campo para obtener imágenes alrededor de la herida.Seleccione el láser y ajuste el tiempo de exposición, luego configure un lapso de tiempo cada 30 segundos durante la duración deseada y obtenga una imagen de campo claro para documentar el campo de visión. Para cuantificar la internalización del receptor de neutrófilos en el sitio de la herida, abra los conjuntos de datos de imágenes en Fiji y use el control deslizante de tiempo para seleccionar un período de tiempo representativo de interés para cada conjunto de datos. En MATLAB, cree un nuevo script e incluya funciones para la lectura de imágenes, la apertura y la selección manual de los puntos de interés.Ejecute el script para abrir el marco de interés y haga clic en los neutrófilos para el análisis. Registrar una estimación de sus centroides, tanto en la herida de la aleta ventral como en el tejido hematopoyético caudal. Segmente los neutrófilos en cada fotograma utilizando la técnica de contornos activos y cree el script para agregar el cálculo de la matriz de co-ocurrencia del nivel de grises para cada neutrófilo, incluido el cálculo del contraste de los neutrófilos basado en la matriz de co-ocurrencia del nivel de grises.Agregue comandos para guardar los valores por separado para neutrófilos individuales en la aleta ventral, incluido el cálculo del valor medio de contraste de neutrófilos de todos los neutrófilos del tejido hematopoyético caudal. Incluya la normalización del valor de contraste de los neutrófilos individuales en el sitio de la herida con el contraste medio calculado de los neutrófilos del tejido hematopoyético caudal para obtener un contraste normalizado que refleje cuán punteada es la apariencia de un receptor dentro de las células individuales que responden en relación con las células de control que no responden. A continuación, haga clic en ejecutar para ejecutar el script.El herida de la aleta ventral es seguido por una rápida movilización de neutrófilos desde el tejido hematopoyético caudal hacia la aleta ventral y se agrupa en el borde de la herida dentro de los 30 a 60 minutos posteriores a la inducción de la lesión. En este análisis, se obtuvieron imágenes de los receptores de quimiocinas CXCR1 y CXCR2 expresados por neutrófilos de pez cebra mediante microscopía confocal de disco giratorio. El patrón de distribución del receptor se cuantificó utilizando la métrica de contraste, que informa de las diferencias de intensidad entre píxeles vecinos.Un método alternativo consiste en cuantificar la relación entre los niveles de receptores y los niveles de un marcador de membrana controlado. Utilizando la métrica de contraste para detectar la internalización del receptor en los grupos de neutrófilos en la herida, se pueden cuantificar las diferencias visibles entre el tráfico de CXCR1 y CXCR2 en los neutrófilos en el sitio de la herida. Por ejemplo, en este análisis, la internalización de CXCR1 marcada con fluorescencia en las células ubicadas en el sitio de la herida aumentó con el tiempo, mientras que la CXCR2 marcada con fluorescencia permaneció en las membranas de los neutrófilos en la herida.La supresión de los ligandos CXCR1 y CXCR2 mediante el tratamiento con morfolinos da lugar a una internalización diferencial de CXCR1 marcada con fluorescencia en el sitio de la herida. Además, en embriones tempranos, CXCR1 marcado con fluorescencia se internaliza marcadamente en embriones en los que se coexpresa el ligando receptor. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que las imágenes deben realizarse lo más rápido posible después de la herida para capturar la dinámica de los receptores durante el reclutamiento de neutrófilos en las heridas.Después de las imágenes de los receptores de quimiocinas en larvas normales, los investigadores pueden realizar imágenes comparativas en larvas mutantes con inflamación desregulada.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Este video muestra el seguimiento del reclutamiento de leucocitos utilizando larvas de pez cebra transgénicas que expresan proteína fluorescente verde fotoconvertible. La preinyección de bacterias marcadas con colorante fluorescente rojo en la vesícula ótica e inducción de la fotoconversión permite observar la migración, fagocitosis y dispersión de los leucocitos en todo el cuerpo, lo que proporciona información valiosa sobre la dinámica de la respuesta inmunitaria.

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El video muestra una técnica de dispositivo de herida y atrapamiento de pez cebra para observar la infección por patógenos fúngicos marcados con fluorescencia en larvas de pez cebra. La infección inicial atrae a los macrófagos y, a medida que la infección persiste, el reclutamiento de neutrófilos progresa en el lugar de la inyección.

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El estudio de los primeros eventos de la progresión de células preneoplásicas y la interacción célula inmune innata es fundamental para entender y tratar el cáncer. Aquí se describe un método para inducir condicionalmente transformaciones de células epiteliales y la formación de imágenes en directo posterior de la interacción de células inmune innato con HRAS G12V expresando células de la piel en las larvas de pez cebra.

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Aquí, presentamos un protocolo para la generación y obtención de imágenes de una infección bacteriana localizada en la vesícula ótica del pez cebra.

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

Se demuestran modelos de infección sistémica y localizada del pez cebra por el virus de la influenza A humana. Utilizando un modelo de infección sistémica, el pez cebra se puede utilizar para detectar medicamentos antivirales. Utilizando un modelo de infección localizada, el pez cebra puede utilizarse para caracterizar las respuestas de las células inmunitarias del huésped.

El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células

Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.

Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

Aquí presentamos un protocolo para la reparación de herida de imágenes en vivo y la respuesta inflamatoria asociada a alta resolución espacio-temporal en vivo. Este método utiliza la etapa pupal de Drosophila desarrollo para permitir la proyección de imagen a largo plazo y seguimiento de poblaciones celulares específicas en el tiempo y es compatible con la inactivación del gene de RNAi-mediada eficiente.

Seguimiento en Vivo a largo plazo de la dinámica de la célula inflamatoria dentro de pupas de Drosophila

Para probar el efecto de una quimiocina en el reclutamiento in vivo de macrófagos, se utilizó toda la hibridación in situ del monte para detectar la expresión ectópica de la quimiocina, y se utilizó inmunomanchado para etiquetar los macrófagos. Las imágenes en vivo se utilizaron para la observación en tiempo real de la migración de macrófagos.

Un modelo de expresión de chemocina ectópico para probar el reclutamiento de macrófagos in Vivo

El pez cebra dirigido a electrófilos y oxidantes reactivos (Z-REX) es un método basado en la biología química para la investigación de la señalización reactiva de moléculas pequeñas. Esta técnica se puede aplicar a peces vivos de diferentes etapas de desarrollo. Aquí, combinamos ensayos estándar en pez cebra con Z-REX para el análisis de la vía de señalización.

Monitoreo de respuestas de señalización en el objetivo en larvas de pez cebra - Z-REX desenmascara mecanismos precisos de fármacos electrofílicos y metabolitos

Aprende a visualizar la dinámica de receptores de quimioquinas en neutrófilos de pez cebra durante la respuesta inflamatoria a heridas. Este protocolo utiliza microscopía confocal de disco giratorio para analizar el comportamiento de CXCR1 y CXCR2 in vivo.

Imágenes en vivo de los receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra durante las respuestas de la herida

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