Name: Puesta en marcha del irradiador y dosimetría para la evaluación de los parámetros LQ α y β, esquema de dosificación de radiación y deposición de dosis in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Aprende dosimetría de radiación para experimentos preclínicos precisos usando cámaras de ionización y película radiocrómica. Este protocolo vincula condiciones experimentales con estándares nacionales de dosis clínica.

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Los autores quieren agradecer al Microscopio y Modelos Animales Imaging Facilites de WVU por el uso de sus equipos apoyados por el número de subvención P20GM103434. Además, este trabajo fue apoyado por el número de subvención P20GM121322 de la Institue Nacional de Ciencias Médicas Generales, por el número de subvención del Instituto Nacional del Cáncer F99CA25376801, y el Fondo de Dotación de Sillas Mylan.

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Los autores no tienen divulgaciones que hacer.

El protocolo anterior describe un enfoque fácil de usar para la dosimetría de radiación, la determinación de los valores de α/β en las líneas celulares cancerosas y un breve ejemplo de un enfoque para la irradiación en un modelo preclínico de metástasis cerebral del cáncer de mama. Estos métodos se pueden utilizar para estudiar cualquier modelo de cáncer y no sólo se limitan a la metástasis cerebral del cáncer de mama. En esta sección discutiremos los entresijos relevantes subyacentes a los experimentos de radioterapia preclínica.
La dosimetría implica dos partes: 1) calibrar la salida con una cámara de agricultor, de modo que se establezca la tasa de dosis de la unidad de rayos X, y 2) preparar un práctico sistema de medición de dosimetría utilizando película radiocromática. Con respecto a la calibración de salida, el TG-61 proporciona un método reproducible en agua. El protocolo aquí utiliza el agua sólida Gammex RMI 457, según lo recomendado por XStrahl, el fabricante del irradiador. Aunque el análisis relativo de dosimetría (perfiles o curvas de dosis de profundidad normalizadas a dosis máximas) con agua sólida, coincide en que mejor que el 1% con el agua, hay una diferencia de aproximadamente 3 a 4% en dosis absolutas debido a un coeficiente de absorción de energía de masa más alto para agua sólida en comparación con el agua. Sin embargo, como todas las instalaciones del sistema XStrahl utilizan el protocolo de agua sólida para la calibración de salida, no corrigimos estas diferencias. Conocer la salida permite calcular el tiempo de exposición necesario para administrar la dosis deseada. Colocar la película en el mismo montaje que la cámara del granjero nos permite entregar dosis conocidas a la película. El escaneo de la película proporciona densidades ópticas. A continuación, la dosis de la película se puede graficar con la densidad óptica neta correspondiente (diferencia en la densidad óptica después y antes de la exposición). Esto produce una curva de calibración de película. Cuando cambiamos las configuraciones experimentales, la tasa de dosis en esa situación podría cambiar, ya que la tasa de dosis depende del tamaño del campo, la profundidad y el material que se está irradiando. Exponer la película con la configuración experimental nos proporciona una densidad óptica neta, y utilizando la curva de calibración de la película, podemos determinar la dosis correspondiente. Dividiendo esta dosis para cuando la película fue irradiada, obtenemos la tasa de dosis. Esta tasa de dosis se puede utilizar para calcular el tiempo de exposición para administrar la dosis deseada para la configuración experimental dada. El protocolo descrito anteriormente maneja varios matices asociados con la dosimetría de película. Por ejemplo, después de la exposición, la película requiere aproximadamente 24 horas para que las reacciones químicas en la capa activa de la película estén prácticamente completas. No esperar a esta cantidad de tiempo conducirá a una menor densidad óptica.
Para cualquier estudio tener dosimetría reproducible es importante conocer y entender varios de los elementos clave de un irradiador dado. En particular, es crucial conocer y detallar a otros investigadores la marca y el modelo del irradiador utilizado, el tipo de fuente (rayos X, radiactivo, etc.), la energía, la capa de medio valor, el tamaño del campo, la fuente a la superficie y la fuente a distancias isóconas, el tamaño del material irradiado, la atenuación antes y el backscatter después del material irradiado, la tasa de dosis específica del experimento, el esquema de fraccionamiento, el equipo exacto de dosimetría utilizado y el protocolo de dosimetría utilizado. Todos estos puntos de información son lo que describe cohesivamente la calidad del haz de un irradiador dado antes de administrar una dosis a cualquier animal o célula19. Otro punto pertinente de información de este protocolo y otros es que la tasa de dosis alcanzada en el Protocolo 1 es simplemente la salida del irradiador que se utiliza. Para cualquier experimento dado es importante definir la velocidad de dosis para esa configuración en particular (Protocolo 4) en comparación con una curva de calibración de película radiocromática generada (Protocolo 2).
La experimentación in vitro proporciona detalles importantes sobre el comportamiento radiobiológico de las líneas celulares cancerosas. Los ensayos in vitro de supervivencia celular clonogénica estiman y cuantifican con precisión la radiosensibilidad inherente de una línea celular20,ayudando en el diseño de horarios de fraccionamiento en experimentos celulares o de animales pequeños posteriores21. En concreto, estos ensayos auguran valores aproximados para los parámetros α y β que se utilizan en el modelo lineal-cuadrático para predecir la muerte celular en respuesta a la radioterapia según la ecuación:
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61692/61692equ09.jpg"> (Ecuación 9)
donde SF es la fracción sobreviviente de células clonógenamente viables, D es dosis de radiación en Gy, y α y β se ajustan los parámetros22. La relación α/β proporciona una medida inherente de la radiosensibilidad celular, con valores más altos que se correlacionan con una mayor sensibilidad de una línea celular22. Dado que esta relación funcional no es lineal con respecto a la dosis, los efectos biológicos de un esquema de fraccionamiento de radioterapia no sólo están relacionados con la dosis total administrada, sino también con el número y tamaño de las fracciones23. La dosis efectiva biológica (BED) es una medida de la verdadera dosis biológica suministrada a un tejido y permite la comparación directa de diferentes esquemas de fraccionamientos24,25. La ecuación BED solo requiere una estimación de α/β, y se muestra a continuación:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/61692/61692equ14.jpg"> (Ecuación 14)
donde n es el número de fracciones de la dosis D. Ensayos de supervivencia celular clonogénicos estiman α/β y facilitan la comparación directa de esquemas de fraccionamiento de radioterapia a través de la ecuación BED. Se pueden extraer conclusiones incorrectas con respecto a una respuesta de tejido u órgano a la radioterapia (o combinaciones de radioterapia con otras modalidades) si el BED en los grupos de tratamiento no es equitativo dentro o entre experimentos. Por ejemplo, 2 fracciones de 10 Gy en comparación con 4 fracciones de 5 Gy no producen el mismo BED, y por lo tanto estos esquemas de dosificación no se pueden comparar directamente en términos de respuesta biológica. La ecuación BED, aunque imperfecta debido a limitaciones inherentes en el modelo lineal-cuadrático, estima de forma fiable efectos equitativos para una amplia gama de condiciones de tratamiento experimental24,25.
Los ensayos de supervivencia celular clonogénica claramente juegan un papel importante en el estudio de los efectos de radioterapia en modelos de cáncer, pero la experimentación in vitro ofrece una serie de opciones adicionales para explorar aún más los detalles mecanicistas de la radiobiología de las células cancerosas. Se utilizaron modificaciones simples del ensayo de supervivencia celular clonogénica para determinar los modos de acción de algunas quimioterapias radio-sensibilizantes, como paclitaxel o etoposide26,27. Otras opciones experimentales in vitro incluyen estudios de inmunocitoquímica para examinar vías específicas de reparación celular, como γ-H2AX foci y/o tinción de 53BP1 para reparación de rotura de ADN de doble cadena28. Estos experimentos pueden ser de particular interés al comparar la radioterapia como una sola modalidad con terapias combinadas, especialmente al sondear detalles mecanicistas para una línea celular determinada. Otras opciones experimentales incluyen mediciones de citoquinas para examinar el papel innato de la respuesta inflamatoria de una célula a la irradiación o análisis del modo de muerte celular (es decir, apoptosis, necrosis, catástrofe mitotica, etc.) en diferentes condiciones terapéuticas29,30,31. Este tipo de experimentación puede complementar o reemplazar la experimentación con animales y proporcionar una comprensión más completa de la radiobiología de una línea de células cancerosas. Independientemente de la elección de experimentos adicionales para llevar a cabo, un ensayo estándar de supervivencia celular clonogénico como se describe en el protocolo 3 es una evaluación radiobiológica inicial importante de una línea celular.
Los ensayos clonogénicos y la dosimetría de radiación proporcionan al investigador un medio para planificar con precisión experimentos para parecerse más directamente a escenarios clínicos. Con la adición de modelos de roedores pequeños de cáncer preclínico, es posible estudiar la respuesta a la radiación solo o en el contexto de un plan de tratamiento in vivo. Antes de utilizar animales, es importante determinar la salida de dosis relativa de la configuración específica si difiere de la configuración utilizada para la determinación de la salida de dosis32,33. Cuando se trata de determinar una tasa de dosis para tamaños de campo de &lt;10 mm, el uso de una cámara de ionización se vuelve menos preciso debido a la alineación dentro de un campo pequeño y los efectos de promediación de volumen parcial33. El uso de película radiocromática para determinar la salida en combinación con experimentos inmunohistoquímicos in vivo se ha utilizado para determinar la salida y la deposición de dosis en los últimos16,34,35,36,37,38.

Los cánceres representan colectivamente la segunda causa de muerte en los Estados Unidos y en muchos países del mundo1. La radioterapia es una piedra angular del tratamiento para muchos subtipos tumorales y se administra a aproximadamente la mitad de todos los pacientes con cáncer2,3. Los resultados de los pacientes para casi todos los cánceres han mejorado con el tiempo, ya que el equipo utilizado para suministrar dosis de radiación ha avanzado constantemente y se desarrollaron algunos enfoques eficaces de terapia multimodal4,5,6,pero las tasas de recurrencia y mortalidad para pacientes con ciertos tipos de tumores siguen siendo altas7,8,9. Así, la radioterapia para el cáncer sigue siendo un área activa de investigación básica y clínica. Muchos estudios de radioterapia preclínica emplean el uso de irradiadores a pequeña escala para suministrar dosis de radiación a modelos in vitro o animales de cánceres. Con una multitud de experimentos potenciales para llevar a cabo la exploración de detalles radiobiología mecanicistas o tratamientos novedosos, se pueden encontrar escollos comunes que conducen a conclusiones incorrectas, mala reproducibilidad y recursos desperdiciados. Estos escollos se encuentran dentro de tres áreas importantes: dosimetría del irradiador, caracterización in vitro de las líneas celulares modelo, y programación y configuración de dosificación de irradiación in vivo. Los resultados precisos y reproducibles de experimentos más avanzados son difíciles de lograr sin atención previa a estos aspectos fundamentales de la investigación de radioterapia.
El protocolo aquí detallado describe una estrategia generalizada para evitar o mitigar estas cuestiones y se basa en varias metodologías previamente desarrolladas destinadas a uso independiente. Estos métodos distintos se han fusionado para que un investigador interesado en comenzar o mejorar los experimentos de radioterapia preclínica pueda utilizar esto como un diseño experimental robusto. El marco sugerido incluye metodología para la puesta en marcha de irradiadores animales a pequeña escala, para determinar las propiedades radiobiológicas básicas de las líneas celulares cancerosas modelo, y para diseñar y administrar adecuadamente un calendario de dosificación y fraccionamiento para modelos tumorales in vivo.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Este o otros productos comparables de ácido acético glacial son aceptables.</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td>Este producto de crystal violet o productos comparables son aceptables.</td></tr><tr><td>Baraometer digital</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-650-118</td><td>Para mediciones de presión y temperatura.</td></tr><tr><td>Electrómetro</td><td>de imagen estándar</td><td>CDX 2000B</td><td>calibrado por un ADCL; Factor de corrección de la necesidad, Pelec</td></tr><tr><td>Film</td><td>Película Gaffchromic</td><td>EBT3</td><td>Viene en hojas de 25; Las películas de calibración y las películas experimentales deben provenir del mismo conjunto</td></tr><tr><td>Cámara de ionización</td><td>Farmer</td><td>PTW TN30013</td><td>Calibrado por un ADCL @ dos puntos de calibración</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Este producto de metanol o productos comparables son aceptables.</td></tr><tr><td>Escáner de fotos</td><td>Epson</td><td>Perfection V700</td><td>Los escáneres equivalentes son V800, V10000, V11000, V12000</td></tr><tr><td>XenX</td><td>Xstrahl</td><td>NA</td><td>Irradiador utilizado.</td></tr></tbody></table>

puesta en marcha del irradiador y dosimetría para la evaluación de los parámetros lq α y β, esquema de dosificación de radiación y deposición de dosis in vivo

Irradiator Commissioning and Dosimetry for Assessment of LQ &alpha; and &beta; Parameters, Radiation Dosing Schema, and in vivo Dose Deposition

La dosimetría de radiación es fundamental en la entrega precisa y reproducibilidad de los esquemas de radiación en modelos preclínicos para una alta relevancia traslacional. Antes de realizar cualquier experimento in vitro o in vivo, se debe evaluar la salida de dosis específica para el irradiador y los diseños experimentales individuales. Utilizando una cámara de ionización, electroómetro y configuración de agua sólida, se puede determinar la salida de dosis de campos anchos en isócenter. Utilizando una configuración similar con películas radiocromáticas en el lugar de la cámara de ionización, también se pueden determinar las tasas de dosis para campos más pequeños a diferentes profundidades. Los ensayos de supervivencia clonogénicos in vitro de las células cancerosas en respuesta al tratamiento con radiación son experimentos baratos que proporcionan una medida de la radiosensibilidad inherente de las líneas celulares mediante la adaptación de estos datos con el modelo lineal-cuadrático tradicional. Los parámetros del modelo estimados a partir de estos ensayos, combinados con los principios de las dosis efectivas biológicas, permiten desarrollar diferentes calendarios de fraccionamientos para el tratamiento de radiación que proporcionan dosis efectivas equivalentes en experimentos con animales portadores de tumores. Este es un factor importante a considerar y corregir para comparar los horarios de radioterapia in vivo para eliminar la posible confusión de resultados debido a la varianza en las dosis efectivas entregadas. En conjunto, este artículo proporciona un método general para la verificación de la salida de dosis irradiadores preclínicos de animales y gabinetes, evaluación in vitro de la radiosensibilidad y verificación de la administración de radiación en pequeños organismos vivos.

Siguiendo el protocolo 1 proporcionará una tasa de dosis en Gy/min, que es específica del irradiador que se está utilizando. Sin embargo, independientemente del tipo de irradiador, con una tasa de dosis conocida se puede generar una curva de calibración utilizando el protocolo 2 que produce películas similares y una curva de calibración similar a la de la Figura 2A-B. Un ensayo exitoso del protocolo 3 producirá colonias distintas y bien demarcadas de células que manchan homogéneamente violeta. La estimación de α/β se puede comparar con valores literarios u otros grupos de tratamiento para interpretar la sensibilidad radioeléctosa de la línea celular dada. Utilizando la curva de calibración desarrollada siguiendo el protocolo 2 y mostrada en la Figura 2B,el protocolo 4 producirá dos muestras de película similares a la Figura 2A que se pueden utilizar para estimar los tiempos de irradiación experimental requeridos. Si hay una cámara de imágenes del portal a bordo disponible para el irradiador que se está utilizando, se pueden obtener radiogramas de animales pequeños con y sin colimación. La superposición de estas imágenes demostrará el posicionamiento exacto del haz de radiación colimado en relación con el animal pequeño que se trata como se muestra en la Figura 4A. La correcta deposición de dosis en el protocolo 5 se puede confirmar siguiendo el protocolo 6. Una indicación de que la radiación se está depositando en un sistema in vivo o in vitro es mediante la detección de roturas de ADN de doble cadena. Ilustrado en la Figura 4B, el mismo ratón tratado únicamente a través del hemisferio derecho en la Figura 4A, muestra la tinción positiva ḥH2AX sólo en el hemisferio tratado. En esta figura, los núcleos están manchados con DAPI para mostrar dos cosas; 1) el conjunto son del cerebro al que se aplicó el anticuerpo antiH2AX durante el análisis histológico, y 2) el hemisferio no tratado del cerebro permanece sin manchar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig01.jpg"> Figura 1: Configuración aproximada de la cámara de ionización y el fantasma del agua configurados para la determinación de la salida de dosis. El pictograma ilustra una configuración básica utilizando los diversos componentes necesarios para la dosimetría utilizando una cámara de ionización y fantasmas de agua sólida dentro del gabinete del irradiador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig02.jpg"> Figura 2: Generación de una curva de calibración utilizando película radiocromática. (A) Cambio de color representativo de la película radiocromática con dosis crecientes. Parte superior izquierda (0 cGy); parte inferior derecha (2000 cGy). (B) Curva potencial de calibración de película radiocromática comparando la densidad óptica neta y la dosis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig03.jpg"> Figura 3: Ensayo clonogénico de células cancerosas. El tratamiento radioerápico de las células se puede realizar antes del chapado en seis placas de pozo /placas de Petri (A), o después (B). En el panel (C), se muestra una imagen representativa de un ensayo clonogénico exitoso con células de cáncer de mama MDA-MB-231 después de seguir la Sección 3 del Protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig04.jpg"> Figura 4: Uso de radiogramas superpuestos duales para posicionamiento (si está disponible) y tinción inmunohistoquímica positiva ḥH2AX para la confirmación de la deposición de dosis. (A) Radiogramas superpuestos representativos que representan la colocación de haz de radiación. B) Resultados representativos que indican la deposición de dosis en el hemisferio derecho, como lo demuestra el aumento de la intensidad ḥH2AX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Factor de corrección</td>
			<td colspan="2">Explicación</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nκ</td>
			<td colspan="2">Factor de calibración del kerma de aire</td>
		</tr>
<tr>
<td>[(μen/ρ)Wair] agua
</td>
			<td colspan="2">Ración de coeficientes de absorción de energía masiva de agua a aire; aproximadamente 1.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pq, Cham
</td>
			<td colspan="2">Corrección de la contabilización del tallo de la cámara que afecta la perterbación de la fluencia fotónica por cámara; aproximadamente 1.022</td>
		</tr>
<tr>
<td>Psheath
</td>
			<td colspan="2">Corrección que explica la cámara de ionización que protege la eslata; valor de 1, ya que la cámara es impermeable</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ppol
</td>
			<td colspan="2">Factor de corrección que explica la polaridad; determinado en el Protocolo 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pion
</td>
			<td colspan="2">Factor de corrección que explica la recombinación de iones; determinado en el Protocolo 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>PTp
</td>
			<td colspan="2">Factor de corrección acocunting para temerpature y presión el día del experimento; determinado en el Protocolo 1</td>
		</tr>
</tbody></table>Cuadro 1: Factores de corrección necesarios para la determinación de la tasa de dosis en el Protocolo 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dosis</td>
			<td>N</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>12*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>15*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>20*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
* Sólo es necesario para dosis superiores a 10 para experimentos individuales.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Dosis que se utilizarán en la generación de curva de calibración de película radiocromática.

La dosimetría de radiación proporciona una técnica para mejorar la precisión de los experimentos preclínicos y garantizar que las dosis de radiación suministradas estén estrechamente relacionadas con los parámetros clínicos. Este protocolo describe los pasos a seguir en cada fase durante los experimentos de radiación preclínica para garantizar un diseño experimental adecuado.

Puesta en marcha del irradiador y dosimetría para la evaluación de los parámetros LQ α y β, esquema de dosificación de radiación y deposición de dosis in vivo

Radiation dosimetry is critical in the accurate delivery and reproducibility of radiation schemes in preclinical models for high translational relevance. ...

Este protocolo es una combinación novedosa de varias metodologías dosimétricas radiológicas y de radiación para garantizar experimentos precisos, reproducibles y preclínicos de radioterapia. Estos métodos vinculan las condiciones experimentales a las normas nacionales de dosis y permiten mediciones precisas de dosis que coinciden con las dosis de radioterapia. Centrándose en el diseño de experimentos reproducibles de radioterapia, este protocolo proporciona a los investigadores las herramientas y métodos necesarios para realizar estudios con una alta relevancia traslacional.Los protocolos de calibración dosimétrica pueden ser difíciles para los principiantes, especialmente para aquellos que no tienen antecedentes en física médica. Sugerimos consultar a un físico de radioterapia cuando intente estos experimentos por primera vez. Las técnicas de este protocolo son comunes tanto a los físicos de radiación como a los investigadores biomédicos.Sin embargo, algunos de estos no se utilizan típicamente en combinación. Para determinar la salida de dosis adecuada, establezca el irradiador para suministrar radiación a un kilovoltaje máximo de 220 y 13 miliamperios con un campo abierto de 17 por 17 centímetros situado a 35 centímetros de la fuente. Filtre el haz con un filtro de cobre de 0,15 milímetros con un enfoque amplio y alinee la losa de un centímetro, la losa de dos centímetros, la losa de dos centímetros con la cámara de ionización y la losa de un centímetro.Después de configurar la pila fantasma, inserte la cámara de ionización en el fantasma y ajuste las pilas de modo que la distancia de origen a superficie sea de 33 centímetros cuando esté adecuadamente nivelada. A continuación, confirme que estas medidas se colocan correctamente dentro de la cámara de ionización a 35 centímetros del isócono. Para crear una curva de calibración de película cromática radioeléctrica, prepare varias piezas adicionales de película del mismo tamaño y orientación y coloque la película a una profundidad de dos centímetros en la pila fantasma de agua sólida.Para comenzar la irradiación, coloque una pieza de película encima de cuatro centímetros de agua sólida y coloque los dos centímetros restantes de agua sólida por encima de las películas. Después de requerir escaneos de película posteriores a la exposición, importe los archivos de imagen en ImageJ en un formato de archivo tiff y seleccione Imagen, Color y seleccione Canales divididos. Solo en el canal de imagen rojo, utilice la herramienta rectángulo para dibujar una región de interés y presione Ctrl+M para permitir que los valores medios se transcriban desde la ventana de resultados.Una vez obtenidos todos los valores de píxel para las películas no expuestas y expuestas, calcule la densidad óptica neta utilizando la ecuación como se indica, luego trace la densidad óptica de la red contra la dosis a la que se expuso la película y ajuste la trama con una curva cuadrática. Para determinar el valor alfa/beta para líneas celulares cancerosas específicas a través de un ensayo clonogénico, cuente el número resultante de colonias en cada grupo de tratamiento para permitir el cálculo de la fracción de supervivencia de cada placa, luego trace el registro natural de la fracción de supervivencia contra la dosis correspondiente administrada y ajuste la curva con una función cuadrática. Para determinar la salida de dosis específica para diseños experimentales variables, seleccione el tamaño y la distancia de campo deseados de la fuente y utilice fantasmas de agua sólida para proporcionar acumulación y backscatter según sea necesario, posicionando la pieza de película en la orientación que mejor retrata el diseño experimental.A continuación, la dosis se puede determinar a partir de la densidad óptica neta de la película utilizando la curva de calibración de la película para la dosis. Para determinar la posición de haz adecuada para un tratamiento con ratones portadores de tumores, después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, utilizar una cámara portal a bordo y un filtro de aluminio para obtener un radiograma del ratón experimental sin colimación, a continuación, obtener un radiograma con la intercalación en su lugar y superponer los radiogramas en ImageJ para determinar el posicionamiento del haz. Utilizando la curva de calibración como se ha demostrado, se pueden generar dos muestras de película que se pueden utilizar para estimar los tiempos de irradiación experimental requeridos.La superposición de estas imágenes revelará el posicionamiento exacto del haz de radiación colimado en relación con el animal pequeño que está siendo tratado. La deposición exitosa de la dosis puede confirmarse como ilustrada por la tinción gamma-H2AX positiva observada dentro del hemisferio tratado sólo en este análisis representativo. Mantenerse consistente al pasar de determinar la salida del irradiador a generar una curva de calibración de película y al determinar la dosis para su diseño experimental ideal es fundamental.Seguir estos protocolos permite a los investigadores estudiar una amplia variedad de cuestiones radiobiológicas clínicamente aplicables en un entorno preclínico. Estas preguntas pueden conducir a una mejor comprensión de los resultados de los pacientes. Este protocolo no es una nueva técnica independiente.Sin embargo, la combinación de estas metodologías conducirá a la relevancia clínica directa y dará información sobre los resultados de las dosis observadas en la clínica.

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