Perfiles metabólicos para determinar los efectos bactericidas o bacteriostáticos de nuevos productos naturales utilizando microcalorimetría isotérmica

Comprender el modo de acción de los nuevos compuestos antibacterianos es una tarea importante pero difícil. Este método proporciona información sobre estos mecanismos y es fácil de implementar. Esta técnica permite una observación en tiempo real de los efectos antibacterianos de una manera no invasiva que permite un análisis de la muestra adicional.

Aunque practicar con técnicas microbiológicas es un requisito previo, el experimento es fácil de realizar. Tomar su tiempo con el análisis de datos es muy importante a la hora de realizar microcalormetría por primera vez. Comience usando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nanómetros para medir la densidad óptica del cultivo nocturno.

Diluir el cultivo a una 5 veces 10 a la 5a colonia formando unidades por mililitro de concentración media MHB fresca y añadir 150 microlitros de células a cada tubo de 1,5 mililitros de antibiótico a la concentración de interés. Luego mezcle el compuesto con las células por vórtice. Para preparar las plaquitas, añadir 120 microlitros de cada mezcla de antibióticos bacterias en inserciones de plástico individuales en los pozos apropiados de una placa de 48 pozos y utilizar pinzas para colocar todos los viales de titanio en los soportes.

Transfiera suavemente las plaquitas a los viales de titanio en la placa del soporte y coloque libremente las tapas de titanio en todos los viales. Cuando se hayan transferido todas las plaquitas, coloque el soporte en el área designada de la estación de muestra y utilice una llave de torsión ajustada a 40 metros centinewton para apretar todas las tapas. En el software del sistema, inicie un nuevo experimento y retraiga el brazo de inserción de la muestra del instrumento.

Coloque el soporte de la taza en el puente con la columna ocho mirando hacia la abertura de inserción de la muestra y empuje suavemente el soporte de la taza en el instrumento en la posición uno. Espere 10 minutos hasta que el sistema se estabilice antes de etiquetar los pozos experimentales. A continuación, empuje el brazo de inserción de la muestra hasta que el soporte de la taza esté en la posición dos.

Después de permitir que el sistema se estabilice durante 20 minutos, empuje el brazo de inserción de la muestra hasta la posición tres y retraiga el brazo de inserción de la muestra hasta que esté en la posición de marcha. Resalte todos los pozos en el software y seleccione el inicio de la reacción, luego ejecute el experimento hasta que las lecturas de emisión de calor se vuelvan estables a cero. Al final del análisis, seleccione detener.

El software le preguntará si está seguro. Seleccione sí y guarde el experimento para el análisis de datos. A continuación, inserte el brazo de inserción de la muestra completamente en el instrumento y enganche los imanes para recuperar el soporte de la copa.

Para analizar los datos, abra el software y seleccione abrir experimento. En la ventana emergente, seleccione el experimento de interés y haga clic en Abrir. Haga clic en Seleccionar todo y defina la línea base para normalizar los datos en cada posición.

En la ventana emergente, seleccione un período de tiempo superior a 30 minutos dentro de la fase de retraso. Después de la selección, la línea base aparecerá en verde en el termograma. Cierre la ventana definir sección de línea base y, a continuación, haga clic en Guardar y cerrar el software.

A continuación, abra la aplicación de análisis de calorimetría SymCel basada en web. Haga clic en Examinar para cargar el archivo de interés y seleccionar el experimento. Los parámetros metabólicos se calcularán automáticamente para las 32 muestras.

Para ajustar los datos de flujo de calor a los modelos Gompertz y/o Richards Growth, haga clic en la función de crecimiento. Los modelos de crecimiento se mostrarán en la sección acumulativa para comparar los datos sin procesar en la sección de flujo. Para descargar los parámetros calculados, haga clic en medir, seleccione la ubicación del archivo y haga clic en Guardar.

El archivo se exportará a una hoja de cálculo para su posterior análisis. Aquí, se muestran los termogramas obtenidos mediante la exposición de A.baumannii DSM-30008 a ciprofloxacino en dilución en serie. Las concentraciones entre 0,005 y 0,1 micromolares tienen un efecto mínimo sobre el crecimiento y el metabolismo de A.baumannii.

El tratamiento de las células con 0,5 ciprofloxacino micromolar, sin embargo, conduce a un cambio significativo en la duración de la fase de retraso y a un flujo de calor máximo más bajo. Estos dos cambios juntos afectan el tiempo hasta el pico, lo que resulta en un aumento de aproximadamente seis horas. En esta figura, el calor liberado acumulativo se traza contra el tiempo con el efecto de cada concentración reflejado por una inclinación de la pendiente.

La cuantificación de la inclinación del termograma permite calcular la tasa metabólica máxima de A.baumannii en presencia de ciprofloxacino con una disminución concomitante en la tasa metabólica observada en células tratadas con 0,5 micromolar ciprofloxacino. El tratamiento con rifampicina tiene un efecto dramático en los termogramas de A.baumannii DSM-30008. También se observa una reducción significativa de la emisión de calor que se correlaciona con una disminución de la actividad metabólica.

Tenga en cuenta el aumento en el tiempo hasta el pico para todas las concentraciones probadas y la disminución en la tasa metabólica causada por la disminución de la pendiente para todas las concentraciones que generalmente se atribuyen a un efecto bactericida. Para garantizar resultados óptimos, utilice el pipeteo inverso y evite fluidos adicionales en los lados de la plaquita al transferir la muestra, asegúrese también de que las tapas estén correctamente cerradas.