Análisis de seguimiento de nanopartículas de nanopartículas de oro en medios acuosos a través de una comparación entre laboratorios

Este protocolo utiliza el análisis de seguimiento de nanopartículas para realizar mediciones precisas, fiables y reproducibles de los diámetros hidrodinámicos de los nanomateriales de interés. El método es rápido y fácil de realizar, lo que facilita la medición del diámetro hidrodinámico esférico equivalente de las partículas, a través del análisis visual en tiempo real partícula por partícula y la preparación mínima de la muestra. Antes de realizar una medición, filtre el volumen de agua ultrapura que se utilizará para el análisis a través de un filtro de jeringa de 0,02 micras.

Diluir la muestra adecuadamente en el agua filtrada. Para esta muestra de dispersión coloidal de oro de 60 nanómetros, diluir volumétricamente por un factor de 50. Conecte el instrumento NTA, la bomba de jeringa y la computadora, y encienda el hardware y el software.

Retire el módulo láser del sistema y utilice un pañuelo de papel y aire comprimido para secar completamente las superficies de vidrio y los canales internos, los tubos y los puertos fluídicos de LVFC. Coloque el LVFC en el módulo láser, luego asegúrelo con los cuatro tornillos apretándolos en diagonal. Conecte el tubo de salida al puerto en el lado derecho de la celda.

Inserte el tubo de entrada en la botella de residuos y enjuague 900 microlitros de solución de limpieza tan rápido como lo permita la contrapresión. Reemplace la jeringa conectada al tubo de entrada con una jeringa nueva que contenga un mililitro de agua filtrada y conecte el tubo de entrada al puerto izquierdo de la celda de flujo. A continuación, introduzca lentamente aproximadamente 500 microlitros de líquido en la cámara de muestras, teniendo cuidado de que no se introduzcan burbujas de aire durante la carga.

Para cargar el módulo láser, inserte el LVFC lleno de agua en el instrumento y bloquee la celda en su lugar. Asegure la jeringa y la base de la bomba de jeringa y haga clic en Iniciar cámara en la interfaz del software para inicializar la cámara. En la pestaña de hardware, haga clic en Dispersión para mover la posición de referencia y establecer el nivel de la cámara en 16.

Ajuste el enfoque manualmente para comprobar si hay partículas en el diluyente, y haga clic con el botón izquierdo y arrastre en la ventana de visualización principal para ajustar la posición del campo de visión y comprobar si hay partículas. Para limpiar el sistema, reemplace la jeringa con una jeringa llena solo de aire y reemplace lentamente el agua de la cámara con aire. Retire la celda del módulo láser del instrumento y desconecte las piezas de tubería.

Limpie el vidrio óptico del módulo láser y las superficies de vidrio del LVFC con agua y seque con un pañuelo de papel y aire comprimido. Después de volver a ensamblar el LVFC y el módulo láser y cebar el tubo, conecte una jeringa que contenga un mililitro de la suspensión de nanopartículas de oro de 60 nanómetros al puerto inferior e inyecte lentamente 750 microlitros de la muestra en la cámara LVFC. Después de cargar el módulo láser e inicializar la cámara, haga clic en Dispersar para mover el enfoque de referencia a su posición, confirmando que el enfoque está configurado correctamente para dar una imagen clara de las partículas.

Compruebe que el campo de visión esté configurado en el centro con respecto a la posición del rayo láser y ejecute la función de configuración automática para optimizar automáticamente el enfoque y el nivel de la cámara para garantizar que se logre la calidad de imagen óptima. Para analizar la muestra, abra la pestaña Procedimiento operativo estándar de medición estándar y configure el instrumento para que adquiera cinco videos de 60 segundos bajo flujo lento y constante. A continuación, establezca el nombre del archivo y la ubicación de los datos e inicie la ejecución.

Para analizar los datos, arrastre la barra deslizante en la pestaña Umbral de detección para establecer el umbral de detección de modo que se detecten y rastreen tantas partículas visibles como sea posible. Asegúrese de que no se observen más de cinco cruces azules indicativas de ruido. Para procesar automáticamente los vídeos de análisis de seguimiento de partículas, haga clic en Configuración, Aceptar y deje todos los parámetros de procesamiento en su configuración automática.

Una vez finalizado el procesamiento de datos, exporte los datos como un archivo de resultados de formulario CSV. Aquí, se muestran los resultados de la comparación entre laboratorios de la primera ronda obtenidos utilizando varias configuraciones de instrumentos de análisis de seguimiento de nanopartículas. Con la excepción del laboratorio seis, la repetibilidad entre las cinco repeticiones de captura fue buena a pesar de que varios laboratorios registraron un tamaño de modo superior al esperado.

La precisión de los resultados del análisis de seguimiento de nanopartículas de la tercera ronda fue mejorada por todos los laboratorios que implementaron el mismo procedimiento operativo estándar y la misma configuración de instrumentos con un modo promedio en todos los laboratorios de 62,02 más o menos 1,97 nanómetros. El diámetro medio de las partículas se puede calcular utilizando imágenes de microscopía electrónica de transmisión como una técnica complementaria a NTA para validar el tamaño de partícula, la morfología y la relación de aspecto. En este análisis, las partículas parecen ser en su mayoría esféricas con una relación de aspecto promedio de 1.1.

Es importante asegurarse de que la celda de flujo de bajo volumen esté bien limpia antes de su uso, que la muestra esté adecuadamente diluida, bien cargada y enfocada, y que se sigan los SOP. Este método se puede utilizar para cualquier otra caracterización de nanopartículas, incluidos exosomas y virus, para respaldar estudios de estabilidad y procesos de control de calidad.