Trasplante intramiocardio de hidrogeles inyectables msc-loading después de infarto de miocardio en un modelo murino

Este método puede ayudar a abordar problemas clave en la terapia cardíaca exacerbada actual, como la baja aplicabilidad a la baja retención y la supervivencia de las células trasplantadas en corazones infartados. Para abordar este problema, este método puede proporcionar una técnica fiable para estudiar el trasplante intramiocárdico con células madre utilizando hidrogeles inyectables en un modelo murino, que es una excelente plataforma para investigar la reparación y regeneración del tejido cardíaco después de una infracción miocárdica. La principal ventaja de esta técnica es que es un método factible para mejorar la retención y supervivencia de las células madre trasplantadas después del trasplante intramiocárdico utilizando hidrogeles inyectables de cobertura cruzada in situ.

Estos hidrogeles ofrecen diversas oportunidades para la ingeniería de tejidos cardíacos, como la administración no solo de células madre, sino también de factores de crecimiento, materiales genéticos y fármacos para maximizar su efecto terapéutico en tejidos cardíacos infartados. Eunmi Lee, una tecnóloga investigadora de mi laboratorio, demostrará el procedimiento para el experimento in vitro. Eun-Hye Park y Eunhwa Seong, tecnólogos de investigación, demostrarán el procedimiento para experimentos in vivo.

Cultivo de células madre mesenquimales, o MSC, en una placa de cultivo de 100 milímetros a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, lavar el plato dos veces con DPBS e incubarlas con un mililitro de sustituto de tripsina a 37 grados centígrados durante tres minutos. A continuación, añada nueve mililitros de medio de cultivo a las células y centrifugalas a 500 veces G durante tres minutos.

Deseche el sobrenadante resultante. Vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS y mantenga la suspensión celular en hielo. Diluya 10 microlitros de suspensión celular con 10 microlitros de azul de tripano y determine la concentración celular utilizando un contador celular automatizado.

Vuelva a suspender las MSC a una densidad de una por 10 a la séptima celdas por mililitro y transfiéralas a un tubo de un mililitro. Prepare una solución conjugada al 6,25% de GH en PBS y sepárela en dos viales. A continuación, mezcle las soluciones de GH con seis microgramos por mililitro de HRP o peróxido de hidrógeno al 0,07%.

Centrifugar brevemente la suspensión celular a 1000 veces G y aspirar cuidadosamente el sobrenadante resultante. A continuación, mezcle el pellet de celda con la solución de GH A. Cargue las MSC en la solución de GH A y la solución de GH B en cada lado de una jeringa doble. Coloque 300 microlitros de las soluciones combinadas de GH con MSC a una densidad final de 5 millones de células por mililitro en un portaobjetos de ocho pocillos.

Después de la formación de hidrogel in situ y la posterior encapsulación de MSC mediante reticulación enzimática, agregue 700 microlitros de DMEM que contengan 10% de FBS y 1% de solución antimicótica antibiótica. Incubar el portaobjetos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono y reemplazar el medio de cultivo cada dos o tres días. Antes de la cirugía, despola el pecho del ratón con crema depilatoria y esteriliza la piel con yodo.

Coloque el ratón en una mesa de operaciones e intubéntelo insertando un catéter en la tráquea para proporcionar oxígeno suplementario a través de la ventilación mecánica. Corta suavemente la piel con unas tijeras quirúrgicas. A continuación, penetra en los músculos intercostales con unas microtijeras.

Separe la segunda y la tercera costilla izquierda con una sutura de seda 5-O para mantener una cavidad torácica abierta. Ligar cuidadosamente la arteria coronaria descendente anterior izquierda con un portaagujas con un 8-0 Sutura de polipropileno y corte de la sutura mediante electrocauterización. Observe un cambio de color inmediato en la pared ventricular anterior izquierda.

Después de inducir el infarto de miocardio, inyecte 10 microlitros de MSC cargando soluciones de GH en dos puntos diferentes en la zona del borde del infarto. Restaure la cavidad torácica abierta y cierre los músculos y la piel con suturas 5-0. Retire el tubo traqueal y coloque al ratón en una jaula debajo de una lámpara infrarroja durante la recuperación.

Realizar una ecocardiografía y medir las líneas correspondientes para la pared anterior del VI, la pared interna del VI y la pared posterior del VI para obtener el grosor de la pared cardíaca, la dimensión de la cámara y el acortamiento fraccional. Antes del trasplante in vivo, la proliferación y la supervivencia de las MSC en los hidrageles de GH se confirmaron mediante un ensayo de tinción de células muertas vivas in vitro en 3D. Las imágenes representativas mostraron suficiente proliferación de MSC que muestran redes ramificadas dentro de los hidrogeles de GH.

En el día 14 se observó claramente una extensa estructura 3D multicelular de las MSC, lo que indica que los hidrogeles de GH podrían proporcionar un microambiente adecuado para las células encapsuladas. Después de la inducción del infarto de miocardio, los hidrogeles de GH con carga de MSC se trasplantaron intramiocárdicamente a las áreas periinfarto. Las MSCs y el gel se mantuvieron adecuadamente dentro de la región infartada.

Las MSC se integraron bien en los hidrogeles de GH. Para verificar los efectos terapéuticos de los hidrogeles de GH cargados de MSC, se evaluaron los cambios en la función y estructura cardíaca mediante ecocardiografía y análisis histológico en el día 28 después del trasplante, y se compararon entre los diferentes grupos de tratamiento. La ecocardiografía representativa mostró una mejoría de las funciones cardíacas, incluyendo el acortamiento fraccional, la fracción de eyección y el volumen sistólico final en el grupo tratado con gel MSC.

Además, el análisis histológico mostró menos fibrosis, paredes infartadas más gruesas y un menor tamaño de infarto en el grupo tratado con gel MSC que en los otros grupos, lo que indica que este protocolo atenuó significativamente la remodelación del VI. Con esta técnica, logramos la proliferación y la proliferación de células madre a largo plazo y condujimos a una mejora significativa en la estructura y función cardíaca después de un infarto de miocardio en un modelo murino. Esta técnica puede extenderse para su uso en animales grandes y a la traslación clínica como una nueva estrategia para la prevención de la insuficiencia cardíaca post-infarto al proporcionar reparación y regeneración del tejido cardíaco.