Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

Este protocolo facilita la preparación de cortes horizontales de cerebro del hipocampo para su uso en diversas aplicaciones científicas. Esta técnica preserva la integridad de todas las vías de las fibras del hipocampo dentro de una sola porción de hemisferio. Este protocolo de corte es ideal para evaluar los cambios neurológicos que se producen en las patologías cerebrales que se desarrollan y manifiestan en el giro dentado.

El aspecto más importante de este protocolo es encontrar el equilibrio entre una ejecución lo más rápida posible y el manejo suave del tejido cerebral. Para preparar un litro de ACSF, mezcle lentamente todos los productos químicos sólidos como se indica en 800 mililitros de agua bajo agitación constante con una barra de agitación magnética antes de gotear lentamente los volúmenes apropiados de sulfato de magnesio y cloruro de calcio. A continuación, utilice un osmómetro de presión de vapor para validar la osmolaridad entre 305 y 315 miliosmoles y burbujee continuamente la solución de ACSF a temperatura ambiente con carbógeno para ajustar el pH entre 7,3 y 7,4.

Para preparar 250 mililitros de solución de rodajas con alto contenido de sacarosa, agregue los compuestos a 25 mililitros de solución precortada como se indica en la tabla y verifique que la osmolaridad esté entre 320 y 325 miliosmoles. A continuación, burbujee la solución de rodajas con alto contenido de sacarosa durante 10 a 15 minutos con carbógeno para establecer el pH entre 7,3 y 7,4 y almacene la solución de rodajas con alto contenido de sacarosa durante 20 a 30 minutos a menos 80 grados centígrados hasta que esté parcialmente congelada. Para preparar un espacio de trabajo para la disección, llene una cámara de recuperación con solución de ACSF carbogenada y coloque la cámara en un baño de agua a 32 grados centígrados.

Ajuste el vibratomo al programa de corte apropiado y llene el soporte con hielo, móntelo en el vibratomo y conecte una cuchilla al brazo del vibratomo. Use una espátula para triturar y mezclar la solución de rodajas con alto contenido de sacarosa parcialmente congelada hasta obtener un granizado heterogéneo. A continuación, burbujee la solución con carbógeno y utilice la solución para hidratar un trozo de papel de filtro encima de una placa de cultivo refrigerada de 90 milímetros y llene una placa de cultivo de 35 milímetros con hielo.

Para extraer el cerebro, use tijeras de disección para abrir el cuero cabelludo de un ratón macho de dos a seis semanas de edad y para abrir la calvaria a lo largo de la sutura sagital. Use pinzas curvas para extraer el cráneo hasta que todo el cerebro, incluidos los bulbos olfativos, sea visible, y use una espátula para extraer con cuidado el tejido cerebral intacto. Coloque el cerebro en la placa de cultivo de 35 milímetros y use una pipeta Pasteur llena de solución de rodajas con alto contenido de sacarosa para eliminar suavemente cualquier partícula de pelo o sangre del tejido.

Use la espátula para transferir el cerebro limpio al pedazo de papel de filtro empapado y use una cuchilla para cortar el cerebro longitudinalmente por la mitad. Coloque ambos hemisferios en el lado medial recién cortado y use la cuchilla para hacer un corte paralelo en la parte superior dorsal de cada hemisferio para eliminar la región dorsal de cada pieza de cerebro. Coloque ambos hemisferios en el lado dorsal recién cortado con la parte ventral del cerebro hacia arriba y coloque una gota de superpegamento en una placa de muestra.

Use una punta de pipeta para esparcir el pegamento en un área grande para acomodar ambos pedazos de pañuelo y toque un pedazo de correa de papel de filtro con el lado ventral de un hemisferio. Use otra correa de papel de filtro para semisecar cuidadosamente el lado dorsal del cerebro y coloque el lado dorsal del hemisferio hacia abajo sobre el pegamento en la placa de muestra. Use dos correas de papel de filtro adicionales para colocar el segundo hemisferio en el pegamento como se acaba de demostrar y coloque la placa de muestra en la cámara de corte.

Luego, cubra rápida pero cuidadosamente el plato con granizado de solución de rodajas helada con alto contenido de sacarosa. Para adquirir secciones del tejido cerebral, coloque la hoja del vibratomo frente al lado medial de los hemisferios y levante la mesa del vibratomo para que la hoja esté a la misma altura que los lados ventrales de los hemisferios, que ahora están hacia arriba. Utilice el control de vibratome para bajar la hoja 600 micras más en la dirección dorsal y corte el tejido hasta que las dos primeras rodajas estén completamente separadas de los dos hemisferios.

Cuando se hayan obtenido las dos primeras lonchas de tejido, invierta la dirección de corte y baje la hoja otras 300 micras antes de volver a cortar. Cuando el hipocampo se haga visible, utilice una pipeta Pasteur de plástico ensanchada para recoger y transferir las rodajas a la cámara de recuperación en el baño de agua. Deje las lonchas en la cámara de recuperación llena de ACSF durante una hora, luego coloque la cámara de recuperación a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de realizar registros electrofisiológicos de las muestras de tejido.

Aquí, se pueden observar registros representativos de potencial postsináptico excitatorio de campo negativo y positivo de cortes de baja y alta calidad, respectivamente. La traza de ejemplo negativo exhibe una gran amplitud de descarga de fibra tras la despolarización de las fibras neuronales estimuladas que es incluso mayor que la amplitud real de fEPSP, mientras que la traza de alta calidad demuestra una pequeña relación de volea de fibra a fEPSP y una alta amplitud de fEPSP. La viabilidad de un corte de cerebro también se puede analizar trazando las pendientes de potencial postsináptico excitatorio de campo frente a las amplitudes de la descarga de fibras.

Las curvas de entrada/salida, que se utilizan normalmente para determinar la calidad del corte, se pueden obtener aplicando estímulos de corriente crecientes al corte del cerebro y monitoreando las respuestas posteriores de fEPSP. Debido a las propiedades de conducción subóptimas del tejido cerebral mal conservado, los cortes de cerebro de baja calidad muestran curvas de entrada/salida reducidas. Los cortes de cerebro viables tienen líneas de base de transmisión sináptica estables, mientras que los cortes de cerebro con una línea de base inestable no se pueden usar para protocolos de acondicionamiento adicionales para estudiar la plasticidad sináptica de los circuitos cerebrales.

Los registros basales de fEPSP también pueden ser útiles para monitorizar los efectos de los fármacos en la propia transmisión sináptica. Además, los cortes de cerebro se pueden usar en combinación con un indicador de calcio para adquirir registros de imágenes de fluorescencia y para estudiar los influjos de calcio bajo diferentes condiciones de corte o tratamientos. Asegúrese de que la disección del cerebro se realice dentro de no más de 1,5 minutos después del sacrificio y esto sigue siendo una garantía de que el tejido cerebral está solo brevemente sin enfriamiento ni suministro de oxígeno.

Los cortes de cerebro del hipocampo tienen muchas aplicaciones diferentes, desde técnicas de biología molecular hasta electrofisiología. Este procedimiento facilita las investigaciones intensivas de la anatomía del hipocampo y los procesos neurológicos.