Cuantificación de los efectos de los antimicrobianos en la arquitectura de biopelículas in vitro mediante el software COMSTAT

La importancia de este protocolo es que ofrece un marco simple y reproducible para cuantificar estructuras de biopelículas in vitro en diferentes condiciones antimicrobianas. La principal ventaja de esta técnica es que ayuda a eliminar las variaciones subjetivas asociadas con la operación manual de COMSTAT, lo que en última instancia facilita la estandarización y la transparencia de los experimentos en todos los centros de investigación. Para obtener imágenes de los cultivos de Pseudomonas aeruginosa, coloque la placa en la platina de un microscopio confocal, equipado con las longitudes de onda de excitación láser y los conjuntos de filtros adecuados.

Y utilice una lente de inmersión en agua de 20 a 25x para capturar al menos seis imágenes de pila z en capas desde el sustrato hasta la parte superior de cada segmento de biopelícula en incrementos de 0,3 micrómetros. A continuación, guarde las imágenes como OME-TIFF para el análisis COMSTAT. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, abra el paquete COMSTAT2 en ImageJ y cree una carpeta de origen en el escritorio.

Agregue un solo OME-TIFF a la carpeta y abra OME-TIFF desde la carpeta de origen. Elimine las capas vacías que no contengan biomasa. Seleccione Archivo, Importar y Secuencia de imágenes para importar el archivo a ImageJ.

Localice y resalte la carpeta de origen sin abrirla y haga clic en Seleccionar. Aparecerá una ventana de opciones de secuencia, haga clic en Aceptar. Seleccione Imagen, Transformar y Voltear Z para invertir la orientación de la biopelícula de modo que el sustrato esté en la parte superior de la pila. Para definir las propiedades de la imagen, seleccione Imagen y Propiedades, aparecerá una ventana de origen.

Especifique la unidad de longitud como micras, defina la profundidad del vóxel como 0,3 y haga clic en Aceptar. Seleccione Imagen, Ajustar y Umbral. Para ajustar el umbral de la imagen en la ventana de umbral, coloque el control deslizante inferior en el extremo derecho para establecer manualmente el valor máximo del umbral y utilice el control deslizante superior para establecer el umbral mínimo. A continuación, utilice el control deslizante de la ventana de la imagen para desplazarse por cada capa y asegurarse de que el ruido de fondo se ha eliminado lo suficiente en toda la pila y seleccione Establecer para fijar el valor del umbral inferior.

En la ventana establecer niveles de umbral, seleccione Aceptar y establezca y fije el valor máximo del umbral de manera similar. Seleccione Aplicar, haga clic en Aceptar en la ventana de conversión de pila a binario que aparece y salga de la ventana de umbral. Seleccione Plugins, Bio-Formats, y Bio-Formats Exporter para guardar el archivo con un nuevo nombre de archivo en la carpeta de origen.

Aparecerá una ventana de varios archivos del Exportador de Bioformatos, seleccione Aceptar. Aparecerá una ventana de opciones del Exportador de Bio-Formatos, seleccione Aceptar de nuevo. Para ejecutar COMSTAT, seleccione complementos y COMSTAT2, aparecerá una ventana acerca de, seleccione OK.In la ventana Directorios observados, seleccione Agregar, localice y resalte la carpeta de origen, resalte y haga clic en Elegir. Aparecerá una ventana Imágenes en directorios que enumera los OME-TIFF que se van a analizar.

En la ventana COMSTAT2.1, anule la selección de Umbral automático del método de Otsu y del filtrado de volúmenes conectados para asegurarse de que el software utiliza valores de umbral preestablecidos para OME-TIFF individuales. En la ventana COMSTAT2.1, seleccione Biomasa, Distribución de espesor y Área de superficie, y haga clic en Ir para ejecutar el programa. Los datos de salida se mostrarán en la ventana de registro.

Las mediciones se guardarán automáticamente como archivos TXT en la carpeta de origen. En este análisis representativo, se utilizó un aislado de Pseudomonas aeruginosa, cultivado a partir de un paciente infectado con fibrosis quística, para demostrar las fortalezas de este enfoque, cuantificando incorrectamente los cambios inducidos por los antimicrobianos en la arquitectura de la biopelícula in vitro. Las imágenes de células vivas también pueden visualizar cambios en la estructura de la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa antes y después del tratamiento con monoclonales y tobramicina específicos de la biopelícula.

El análisis de datos de COMSTAT reveló diferencias significativas entre las estructuras de biofilm tratadas en comparación con los cultivos de control. En los cultivos tratados con tobramicina, se observó una clara reducción en el espesor medio y en la biomasa. Sin embargo, en presencia de anticuerpos, el biofilm de P. aeruginosa fue resistente a estos cambios estructurales inducidos por la tobramicina.

Al examinar la relación superficie/biovolumen, se observó una reducción significativa en la presencia de anticuerpos en las biopelículas expuestas y no expuestas a la tobramicina, lo que indica la formación de agregados en los cultivos tratados con anticuerpos. Este procedimiento se puede realizar para evaluar cuantitativamente o comparar los efectos de diferentes antimicrobianos utilizados para alterar las matrices de biopelículas. Utilizando esta técnica como marco general, los investigadores pueden explorar diferentes formas de refinar el protocolo para incluir nuevos modelos matemáticos y complementos algorítmicos en ImageJ para representar mejor la heterogeneidad de la biopelícula.