Name: Electroforesis capilar Enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito Corona adquiridos por nanomateriales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende a caracterizar la corona biomolecular completa de nanomateriales mediante electroforesis capilar y espectrometría de masas CESI-MS. Este método permite analizar proteínas y metabolitos con alta sensibilidad y reproducibilidad.

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A.J.C, J.A.T e I.L reconocen la financiación de la Comisión Europea a través del proyecto Horizonte 2020 ACEnano (Subvención no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z reconoce la financiación de doctorado del Consejo de Becas de China (CSC, No. 201507060011). R.R reconoce el apoyo financiero del programa de subvenciones Vidi de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO Vidi 723.0160330).

El uso de biofluidos humanos fue aprobado según las pautas del protocolo IRB de la Universidad de Leiden y la Universidad Médica de Innsbruck. Cuando se investigan biofluidos humanos o animales, se requiere la aprobación ética de la institución de investigación, y se ha obtenido en el caso de los resultados mostrados en este protocolo. Además, también deben realizarse informes adecuados para garantizar la transparencia y la reutilización de los datos en los trabajos futuros9,29,30.
1. Preparación de electrolitos de fondo (BGE)
NOTA: Todos los disolventes deben prepararse en una campana de humos adecuada y se debe usar equipo de protección personal adecuado para todos los pasos (bata de laboratorio, guantes y gafas). En cada paso, se requieren viales de plástico de baja unión para minimizar la pérdida de analitos y la contaminación de la muestra con sales lixiviadas de la cristalería.
<ol><li>Preparar 10% de ácido acético BGE (v/v), pH 2.2 diariamente para la metabolómica.<ol>
<li>En un matraz amétrico de 10 ml agregue 1 ml de ácido acético, seguido de la adición de agua desionizada (DI) a la línea marcada y una mezcla completa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 100 mM de ácido acético, pH 2.9 diariamente para la proteómica.<ol>
<li>En un matraz amétrico de 10 ml agregue 57 μL de ácido acético, seguido de la adición de agua DI a la línea marcada y una mezcla completa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación NM
<ol><li>Dispersar vigorosamente los NM en el agua utilizando las directrices publicadas31,32,33. NOTA: En el desarrollo de este protocolo, se utilizaron 7 NM de la siguiente manera: se utilizó poliestireno carboxilado de 100 y 1.000 nm para la proteína y el metabolito corona, respectivamente. Se utilizaron NM de poliestireno no modificados de 100 nm, NM de anatasa TiO2 de 13 nm que no se modificaron o recubrieron con polímeros de poliacrilato o PVP y NM de SiO 2 sin modificarde 22 nm para coronas de proteínas y metabolitos. Si bien el método se desarrolló y demostró utilizando estos NM, debe tenerse en cuenta que este enfoque sería aplicable a una amplia gama de composiciones, tamaños, formas y morfologías de NM.</li>
	<li>Caracterizar el tamaño de partícula utilizando dispersión dinámica de luz34,35,espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente a partículas individuales36,análisis de seguimiento de nanopartículas37,o microscopía electrónica de transmisión y carga superficial como potencial zeta utilizando un escalador zeta34.</li>
</ol>3. Formación de corona biomolecular
<ol><li>Divida 2 ml de plasma humano (o biofluido de elección) en alícuotas de 1 ml, una para el metabolito y la proteína corona y la segunda para la caracterización del metaboloma plasmático.</li>
	<li>Incubar 1 mg/ml de NM en el plasma humano durante 1 h a 37 °C mientras se mezcla suavemente a 500 rpm en un termomezclador. Después de la incubación, centrífuga la muestra a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C para gletizar los NM.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante plasmático para el análisis de la corona del metabolito. Retener el complejo corona de proteína NM para la caracterización de la corona de proteína.</li>
</ol>4. Aislamiento de proteínas corona
<ol><li>Resuspend el complejo DE PROTEÍNA NM (el pellet) en 1 ml de 10x PBS Buffer y vórtice vigorosamente durante 2 min para eliminar las proteínas no unidas. Centrifugar la solución de PBS a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C para peletizar los NM, y retirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet.</li>
	<li>Resuspend el pellet en 1 mL de tampón de bicarbonato de amonio (ABC) (100 mM, pH 8.0) y vórtice vigorosamente durante 2 min para eliminar las proteínas no unidas y las sales no deseadas. Centrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C para gletizar los NM; retire y deseche el sobrenadante. Repita este paso.</li>
	<li>Reducir los enlaces disulfuro de proteína disolviendo el pellet de proteína NM en 20 μL de tampón ABC (100 mM pH 8) que contiene 10 mM de ditioteritol. Incubar la solución reductora durante 30 min a 56 °C.</li>
	<li>Para digerir las proteínas, agregue 2 μg de tripsina de grado de secuenciación a 20 μL de ABC que contengan 0.1% de surfactante. Incubar la solución digesto durante 16 h a 37 °C.</li>
	<li>Alquilar la muestra mediante la adición de 20 μL de yodoacetamida a 55 mM en ABC de 100 mM e incubar a temperatura ambiente durante 20 min.</li>
	<li>Añadir 20 μL de 0,1 M HCl para escindir el surfactante y dejar actuar durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Enriquezca y desalar péptidos usando una punta de pipeta desalineada empaquetada C18.<ol>
<li>Humedezca la punta con 80 μL 0.1% de ácido fórmico 50% acetonitrilo 5 veces, limpie con 80 μL 0.1% de ácido fórmico 5 veces, extraiga y elute la muestra 10 veces, desalte la muestra enjuagando 80 μL 0.1% de ácido fórmico 5 veces y elute la muestra 2 veces con 80 μL 0.1% de ácido fórmico 70% acetonitrilo en un tubo limpio de PCR de baja unión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Liofilizar las muestras y conservar a -20 °C hasta su análisis.</li>
</ol>5. Aislamiento de la corona del metabolito
<ol><li>Tome el plasma de control y el sobrenadante de la incubación de plasma NM del Paso 3.3 y manténgalo en hielo durante la preparación de la muestra.</li>
	<li>Tome 50 μL de cada uno en viales separados y diluya 1 de cada 10 con agua DI. Tome 50 μL de cada muestra diluida y pase a nuevos viales para el paso 5.3.</li>
	<li>Agregue 200 μL de cloroformo, 250 μL de metanol y 350 μL de agua DI y vigorosamente la mezcla de vórtice durante 2 min. Centrifugar durante 10 min a 20.800 x g a 4 °C.</li>
	<li>Tomar 500 μL de sobrenadante y filtrar a través de un filtro centrífugo de 3 kDa durante 2 h a 10.000 x g a 4 °C. Tomar 430 μL de ultrafiltrado y secar en una aspiradora de velocidad. Las muestras ahora se pueden congelar antes del análisis.</li>
</ol>6. Preparación del sistema CESI-MS38
NOTA: Antes de la instalación de los capilares, compruebe que la entrada y el extremo de salida de los capilares estén intactos y que no haya roturas visibles en el capilar.
<ol><li>Instalación de un capilar de recubrimiento neutro para análisis de proteínas corona39.<ol>
<li>Coloque un nuevo capilar recubierto neutro (90 cm de longitud con 30 μm de diámetro interno) en el instrumento CESI siguiendo las directrices del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de capilares CESI para análisis proteómico.<ol>
<li>Enjuague el capilar de separación en la dirección hacia adelante usando 100 mM de HCl durante 5 min a 100 psi y verifique la formación de gotas en la salida del capilar. Enjuague el capilar de separación con BGE a 100 psi durante 10 min y luego agua DI a 100 psi durante 30 min (esto solo se requiere para capilares nuevos).</li>
		<li>Enjuague tanto el capilar de separación como el capilar conductor con BGE a 90 psi durante 5 minutos y asegúrese de que se formen gotas en el extremo de salida de ambos capilares.</li>
		<li>Enjuague el capilar de separación con agua DI a 90 psi durante 10 min, luego 50 psi durante 10 min con 0.1 M HCl, seguido nuevamente por 90 psi durante 10 min con agua DI y finalmente BGE a 90 psi durante 10 min. Acopla CESI al MS usando una fuente de nanospray y un adaptador como se describió anteriormente38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instalación de capilar de sílice fundida desnuda para caracterización de metabolito corona38.<ol>
<li>Coloque un nuevo capilar de sílice fundido desnudo (90 cm de longitud con un diámetro interno de 30 μm) en el instrumento CESI siguiendo las pautas del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de capilares CESI para análisis metabolómico.<ol>
<li>Enjuague el capilar de separación en la dirección hacia adelante usando 100% MeOH a 50 psi durante 15 min y verifique la formación de gotas en la salida del capilar. Enjuague tanto el capilar de separación como el capilar conductor con BGE a 90 psi durante 5 minutos y asegúrese de que se formen gotas en la salida de ambos capilares.</li>
		<li>Enjuague el capilar de separación con agua DI a 90 psi durante 10 min, luego 50 psi durante 10 min con 0.1 M NaOH, seguido nuevamente por 90 psi durante 10 min con agua DI y finalmente BGE a 90 psi durante 10 min. Acopla CESI al ESI-MS usando una fuente de nanospray y un adaptador como se describió anteriormente. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS para el análisis de proteínas corona
<ol><li>Muestras de resuspend del paso 4.8 en 20 μL de 50 mM de acetato de amonio pH 4.0.</li>
	<li>Realizar 5 psi 10 s de inyección hidrodinámica de muestra. Separe utilizando un voltaje de separación de 30 kV con el siguiente gradiente de presión: 0-10 min a 1 psi, 10-35 min a 1.5 psi y 35-45 min a 5 psi usando 100 mM, pH 2.9 ácido acético como BGE.</li>
	<li>Recopile espectros de masas entre 250-2000 m/z con la adquisición de fragmentación dependiente de los 10 datos principales.</li>
	<li>Entre muestras, enjuague capilar con 0,1 M HCl durante 3 min a 100 psi y 10 min 100 psi de BGE para separación capilar y durante 3 min a 100 psi para el capilar líquido conductor.</li>
</ol>8. CESI-MS para el análisis de la corona de metabolitos
NOTA: Todas las muestras deben analizarse dos veces, una en modo positivo para la detección de cationes y una vez en modo negativo para la detección de aniones. Las muestras de plasma de control deben analizarse al menos 5 veces.
<ol><li>Resuspend NM expuesto y no expuesto muestras de plasma del paso 5.4 en 430 μL de agua DI y vórtice vigorosamente durante 2 min. Filtrar a través de un filtro de membrana de 0,1 μm.</li>
	<li>Tomar 95 μL de filtrado y añadir 5 μL de normas internas a 200 μM para cationes (L-metionina sulfona) y 400 μM para aniones (ácido 2,2,4,4-D4-cítrico) y vórtice vigorosamente. Centrifugar a 4.000 x g a 4 °C durante 10 min antes del análisis CESI-MS.</li>
	<li>Inyecte la muestra hidrodinámicamente durante 30 s (cationes) y 40 s (aniones) a 2 psi.</li>
	<li>Metabolitos separados en ácido acético al 10% con un voltaje de separación de 30 kV en modo hacia adelante (cationes) y hacia atrás (aniones). El modo de separación inversa se ayuda con una presión de avance de 0,5 psi en el capilar de separación.</li>
	<li>Configure el espectrómetro de masas para recopilar datos en modo positivo (cationes) o negativo (aniones) en el rango de masas 65-1000 m / z. Entre muestras, enjuague capilarmente con 0.1 M HCl, 0.1 M NaOH, agua DI y BGE a 50 psi durante 2 min.</li>
</ol>

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<li>Zhang, X., Pandiakumar, A. K., Hamers, R. J., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+lipid+corona+formation+on+colloidal+nanoparticles+from+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of lipid corona formation on colloidal nanoparticles from lipid vesicles.</a> Analytical Chemistry. 19 (24), 14387-14394 (2018).</li>
</ol>

J.A.T es un empleado de AB Sciex UK Ltd que participa como socio de la industria en el proyecto ACEnano, J.A.T y todos los demás autores no tienen conflicto de intereses en este trabajo.

Este es el primer método propuesto para caracterizar la corona biomolecular completa incorporando proteínas y metabolitos, a partir de la misma muestra, utilizando CESI-MS. La capacidad de caracterizar tanto las proteínas como los metabolitos de la misma muestra aumentará significativamente la cantidad de datos recopilados de una sola exposición experimental, lo que permitirá nuevos conocimientos sobre el proceso de formación de corona y sus impactos para la toxicidad y eficacia de los NM como nanomedicamentos. Además, CESI-MS es una plataforma ideal para caracterizar ambas clases de biomoléculas con solo un cambio de capilar requerido. En el futuro, los nuevos métodos desarrollados para la CE no acuosa permitirán que la lipidómica se realice utilizando CE-MS40, por lo que ahora es posible analizar proteínas, metabolitos y lípidos utilizando una sola plataforma. Los enfoques convencionales actuales requerirían dos plataformas LC-MS dedicadas, una para la proteína corona y otra para el metabolito corona. Por lo tanto, este enfoque puede recopilar el doble de datos utilizando una sola plataforma analítica.
Hay algunas advertencias a este enfoque, particularmente con el metabolito corona, ya que este protocolo propone una medición indirecta de la corona. Como tal, el problema puede surgir cuando los niveles de metabolitos están presentes en altas concentraciones en relación con los NM y la posterior caída en la concentración de metabolitos en la matriz es pequeña. Sin embargo, a diferencia de la proteína corona, es poco probable que se desarrolle un enfoque de "talla única" para aislar el metabolito corona debido a que cada NM tiene químicas de superficie únicas. Sin embargo, en el futuro es más probable que se desarrollen y validen enfoques específicos de NM para aislar el metabolito corona; esto será aplicable solo a ese NM específico. A pesar de esto, el CESI-MS seguirá siendo una plataforma muy adecuada para la caracterización de los metabolitos con carga polar independientemente de cómo estén aislados. También cabe destacar que si no se forma un pellet durante los pasos de centrifugación diseñados para peletizar los NM, se puede requerir una fuerza centrífuga más alta; esto es más probable que ocurra con NM menos densos. También es fundamental que todos los pasos de filtrado se cumplan dentro del protocolo debido al estrecho orificio de los capilares, estos pueden bloquearse fácilmente si alguna partícula no se ha eliminado adecuadamente de la muestra.
Si bien la proteína corona ha sido un área intensa de investigación durante varios años, la capacidad de combinarla con el metabolito corona es un nuevo campo de interés para los científicos que investigan la interfaz bio-nano6,14. Hasta la fecha, la mayoría de estos estudios se han centrado en la fracción lipídica no polar del metabolito corona9,28. Este método actual permite la caracterización de los metabolitos altamente polares y cargados en la corona, que incluye metabolitos importantes involucrados en el metabolismo energético, la glucólisis y la síntesis de ADN. Como resultado, cuando se combina con el flujo de trabajo de proteómica, es posible una caracterización más holística de la corona biomolecular. Esto permite un análisis más profundo de las interacciones bio-nano en el futuro. Este método permite una mayor comprensión mecanicista de la endocitosis mediada por receptores a través de interacciones de proteínas y metabolitos con receptores de membrana. Además, se pueden explorar las interacciones inter e intra corona entre proteínas y moléculas pequeñas; por ejemplo, recientemente se ha demostrado que las proteínas de la corona juegan un papel clave en el reclutamiento de metabolitos15. Vale la pena señalar que los resultados representativos en la Figura 3 y la Figura 4 son la cuantificación absoluta de los metabolitos, sin embargo, un enfoque no dirigido que utilice el análisis de datos multivariante para comparar todas las características de CE-MS en los controles en comparación con el plasma expuesto también dilucidaría la unión a metabolitos. Por lo tanto, existe un margen significativo para investigar cómo, y cuáles, los metabolitos y proteínas influyen en su respectivo reclutamiento en las coronas NM. Estos estudios adicionales pueden ayudar a diseñar coronas para optimizar la administración de nanomedicamentos o descubrir más obstáculos para su desarrollo, como la supresión de la acción farmacéutica debido al bloqueo biomolecular de la corona o las funcionalidades de enmascaramiento dirigidas.
CESI-MS con sus caudales a nanoescala de alrededor de 20 nL/min y el uso mínimo de disolventes orgánicos ofrece una mejora en las credenciales ecológicas y económicas sobre el estándar LC-MS y nanoLC-MS en términos de uso de disolventes, los principales desafíos para los estudios de metabolómica y proteómica, respectivamente. CESI-MS ofrece resultados altamente reproducibles tanto para el tiempo de migración como para el área pico que se comparan favorablemente con los métodos basados en LC-MS11,15. Además, en comparación con nanoLC-MS, el arrastre no es un problema en CESI-MS. Por lo tanto, no se requiere una limpieza exhaustiva del sistema entre los análisis de muestras, lo que mejora en gran medida el rendimiento de la muestra11.
En resumen, el flujo de trabajo propuesto es el primero en detallar un enfoque para caracterizar los componentes de proteínas y metabolitos de la corona biomolecular completa de los NM. Esto desbloquea un nuevo aspecto de las interacciones bio-nano, el metabolito corona, lo que permite la recopilación del doble de datos de la misma muestra, lo que permite una comprensión más completa de las interacciones en la interfaz bio-nano.

Las interacciones bio-nano, en la interfaz entre las superficies de nanomateriales (NM) y las matrices biológicas a partir de las cuales las biomoléculas se adsorben al NM, es un área intensa de investigación que sustenta la nanoseguridad y la nanomedicina1. Esta capa de biomoléculas adsorbidas confiere una identidad biológica a las NM, por lo que las células las identifican como "propias", influyendo posteriormente en la captación celular, distribución y puntos finales biológicos2,3,4. La gran mayoría de los estudios bio-nano se han centrado en las proteínas dentro de la corona, y han demostrado que las proteínas varían cuantitativa y cualitativamente entre NM de diferentes composiciones5. Esta variación depende tanto de las propiedades del NM como del tamaño, la funcionalización y el material, además de las propiedades de la matriz biológica, incluida la composición y el contenido de sal5. Un área de interés creciente en la interfaz bio-nano son los metabolitos que se adsorben a los NM6. Varios estudios han demostrado que, al igual que con las proteínas, las propiedades nm son un factor clave para determinar la composición de los metabolitos en la corona y que pueden influir en los resultados biológicos de la exposición a NM6,7,8.
En los estudios de la corona biomolecular existen cuatro fases distintas para su caracterización, la formación de corona, el aislamiento de las biomoléculas dentro de la corona, su detección mediante espectrometría de masas cualitativa o cuantitativa y la identificación9. Hasta la fecha, se han adoptado una serie de técnicas para aislar la proteína corona, incluida la ebullición en tampón SDS-PAGE, extracciones de solvente y sal o digestión directa de proteínas in situ en la superficie de los NM. En cuanto a los metabolitos en la corona, el aislamiento es más complejo con diversos métodos utilizando disolventes o incluso la disolución de los NM propuestos como soluciones8,10,11. Sin embargo, a diferencia de la proteína corona, es poco probable que se aplique un enfoque de "talla única" al aislamiento de metabolitos de NM, debido al amplio espacio químico ocupado por el metaboloma y la diversidad de posibles NM. Un enfoque alternativo es caracterizar la matriz biológica antes y después de la exposición a NM con la diferencia en las concentraciones de metabolitos atribuidas a la adsorción de metabolitos a NM.12
Este enfoque alternativo sería aplicable a todos los biofluidos y NM y, aunque requiere el doble de análisis, en consecuencia ofrece una medida mucho más precisa del metabolito corona y no tiene riesgo de que las recuperaciones de metabolitos bajos de la superficie NM se confundan con una baja unión del metabolito específico.
El segundo paso para el análisis biomolecular de la corona es la detección de las biomoléculas. Tradicionalmente para las proteínas en la corona, este ha sido el mandato de nano-LC-MS, el caballo de batalla de la proteómica; también se han aplicado otros enfoques como NMR13,1D y 2D SDS-PAGE. En cuanto al metabolito corona LC-MS7,GC-MS8 y espectrometría de masas de infusión directa se han utilizado14. Sin embargo, un nuevo enfoque ha comenzado recientemente a ganar tracción, a saber, la electroforesis capilar-espectrometría de masas (CE-MS)11,15 y ha estado presente en los laboratorios nm como una técnica independiente para caracterizar diversas propiedades físicas y químicas de los NM16. CE-MS es una técnica de separación ortogonal a nanoLC-MS y GC-MS y es capaz de permitir la detección de metabolitos altamente polares y cargados17,18. Además, CE-MS es muy adecuado para el análisis de proteínas y sus modificaciones posttraduccionales como la fosforilación y la glicosilación19,20,21,22. El paso final, la identificación y el análisis de datos se pueden realizar de varias maneras dependiendo de si se está utilizando un enfoque cuantitativo / cualitativo o dirigido / no dirigido, esto, sin embargo, queda fuera del ámbito de este protocolo.
CESI-MS, una combinación de CE y una interfaz nanoESI, es un avance reciente en la tecnología CE que utiliza una interfaz sin vase. Esto permite la conexión directa de CE de flujo ultra bajo (<20 nL / min) a un espectrómetro de masas de alta resolución sin dilución, lo que resulta en una sensibilidad de detección significativamente mejorada23,24,25. CESI-MS permite analizar muestras de volumen limitado (< 10 μL) manteniendo un análisis altamente sensible26. CESI-MS también se compara favorablemente con los enfoques tradicionales de nanoLC-MS de bajo caudal utilizados en proteómica y metabolómica en términos de reproducibilidad27,28, rendimiento y arrastre, lo que lo convierte en una perspectiva emocionante para la caracterización completa de la corona biomolecular.
Para resaltar el potencial de CESI-MS para los análisis de interacciones bio-nano, este trabajo describe la preparación de muestras requerida para aislar la corona biomolecular NM de una sola muestra de plasma humano de tal manera que maximice los datos de los aspectos proteicos y metabolitos de la corona NM biomolecular completa. Si bien informamos sobre el uso de plasma humano, este protocolo sería igualmente apropiado para otros biofluidos como el suero sanguíneo, el medio de cultivo celular completo, el lisato celular, el líquido cefalorraquídeo o la orina. Los análisis de estos dos componentes (proteínas y metabolitos) se describirán utilizando capilares CESI recubiertos neutros para la proteína corona y capilares de sílice fusionados desnudos para metabolitos catiónicos y aniónicos.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-cítrico</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Anión estándar interno</td></tr><tr><td>Acetato de amonio >98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio >99.5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerante de cartucho capilar</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 instrumento</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Tapa</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Viales</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Tóxico, uso en una campana</td></tr> extractora <tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamida</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina sulfona</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Catión patrón interno</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Uso en campana extractora</td></tr><tr><td>Microviales</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoViales</td><td>Sciex 5043467</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cartucho de superficie neutra 30 &micro; M ID x 90 cm longitud total</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adaptador para Sciex Nanospray III fuente</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 y B83386 para espectrómetros de masas térmicos, B85397 para espectrómetros de masas Waters, B86099 para espectrómetros de masas Bruker</td></tr><tr><td>Cartucho de sílice fundida OptiMS 30 &micro; m ID x 90 cm longitud total</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte solución salina tamponada 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Puntas, 100 &micro; Cama L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Poliestireno 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Poliestireno carboxilado 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Poliestireno carboxilado 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (surfactante)</td><td>Aguas</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Grado de secuenciación modificado Tripsina</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>solución de hidróxido de sodio</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>Partículas de Promethion</td><td>recubiertas de TiO2 Dispex</td><td>Partículas</td><td></td>a medida</tr><tr><td>Partículas de Promethion</td><td>recubiertas de TiO2 PVP</td><td>Partículas</td><td></td>a medida</tr><tr><td>Partículas</td><td></td> <td>de Promethion sin recubrimiento de TiO2Partículas</td><td></td> a medida</tr></tbody></table>

electroforesis capilar enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito corona adquiridos por nanomateriales

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

La adsorción de biomoléculas de las matrices biológicas circundantes a la superficie de los nanomateriales (NM) para formar la corona ha sido de interés durante la última década. El interés en la interfaz bio-nano surge del hecho de que la corona biomolecular confiere una identidad biológica a los NM y, por lo tanto, hace que el cuerpo los identifique como "propios". Por ejemplo, estudios previos han demostrado que las proteínas en la corona son capaces de interactuar con los receptores de membrana para influir en la captación celular y han establecido que la corona es responsable del tráfico celular de NM y su eventual toxicidad. Hasta la fecha, la mayoría de las investigaciones se han centrado en la proteína corona y han pasado por alto los posibles impactos de los metabolitos incluidos en la corona o los efectos sinérgicos entre los componentes de la corona biomolecular completa. Como tal, este trabajo demuestra metodologías para caracterizar los componentes proteicos y metabolitos de la corona biomolecular utilizando enfoques de proteómica y metabolómica de abajo hacia arriba en paralelo. Esto incluye una digestión en partícula de la proteína corona con un surfactante utilizado para aumentar la recuperación de proteínas, y una caracterización pasiva del metabolito corona mediante el análisis de matrices de metabolitos antes y después de las exposiciones a NM. Este trabajo introduce la electroforesis capilar – espectrometría de masas (CESI-MS) como una nueva técnica para la caracterización de la corona NM. Los protocolos descritos aquí demuestran cómo CESI-MS se puede utilizar para la caracterización confiable de la proteína y el metabolito corona adquiridos por los NM. El cambio a CESI-MS disminuye en gran medida el volumen de muestra requerido (en comparación con los enfoques tradicionales de cromatografía líquida – espectrometría de masas (LC-MS)) con múltiples inyecciones posibles desde tan solo 5 μL de muestra, lo que lo hace ideal para muestras de volumen limitado. Además, las consecuencias ambientales del análisis se reducen con respecto a LC-MS debido a los bajos caudales (<20 nL/min) en CESI-MS, y al uso de electrolitos acuosos que eliminan la necesidad de disolventes orgánicos.

El método descrito es el primero en caracterizar tanto las proteínas como los metabolitos en la corona biomolecular NM utilizando la misma muestra de plasma humano. Este método es capaz de detectar &gt;200 proteínas y metabolitos &gt;150, lo que permite determinar la visión general más completa de la corona biomolecular completa, lo que permite una mejor comprensión de la unión celular NM, la absorción y los impactos.
El uso de CESI-MS tanto para la separación y detección de proteómica(Figura 1)como para metabolómica(Figura 2)muestra buenas ventanas de separación en ambos capilares para cada abordaje.
Este método es capaz de distinguir entre las proteínas de la corona a través de una amplia gama de composiciones de NM, demostrando así la aplicabilidad de los métodos a las NM a través de una amplia gama de características físicas y químicas (Tabla 1).
Las huellas dactilares únicas del metabolito corona también se pueden distinguir utilizando la rama metabolómica de esta metodología (Figura 3). Aunque este enfoque utiliza un enfoque pasivo para caracterizar el metabolito NM corona, todavía es capaz de descubrir ideas interesantes sobre el papel de los metabolitos en la corona biomolecular, como la adsorción diferencial de isómeros(Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figura 1: Electroferograma ejemplar de una separación de corona de proteína SiO2 utilizando CESI-MS después de una digestión en partícula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figura 2: Ejemplo de electroferogramas iónicos extraídos obtenidos de compuestos endógenos en plasma por CE-MS. Los compuestos numerados son los siguientes: 1. Ornitina; 2. Lisina; 3. Arginina; 4. Histidina; 5. Creatina; 6. Glicina; 7. Alanina; 8. Valina; 9. Isoleucina; 10. Leucina; 11. Serina; 12. Treonina; 13. Asparagina; 14. Metionina; 15. Glutamina; 16. Ácido glutámico; 17. Fenil-D5-alanina; 18. Fenilalanina; 19. Tirosina; 20. Prolina; 21. Metionina sulfona (estándar interno). Publicado bajo una licencia Creative Commons CC BY de acceso abierto y reproducido de Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Análisis de la proteína corona en una matriz de 6 NM. Mapa de calor de las clases de proteínas identificadas en sílice (SiO2),titania (TiO2),titania con tapa de PVP (TiO2-PVP), titania con tapa de dispex (TiO2-Dispex), poliestireno y NM de poliestireno carboxilado. Los porcentajes se refieren a la abundancia de proteínas en relación con el contenido total de proteínas en función de la abundancia de 3 péptidos principales para cada proteína. Dadas las diferencias observadas en las abundancias relativas de proteínas en las diferentes coronas NM, está claro que este protocolo propuesto es lo suficientemente sensible como para diferenciar entre la proteína corona de diferentes NM. Figura reproducida a partir de un análisis CESI-MS de la proteína corona, publicado bajo una licencia Creative Commons CC BY de acceso abierto11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figura 3: Análisis dirigido de los metabolitos catiónicos en la corona NM. Adsorción de cationes a Los NM de SiO2 y TiO2. El rojo se refiere a la concentración inicial de metabolitos, mientras que el azul se refiere a la concentración de metabolitos después de una incubación de 1 h con los NM a 37 °C. La reducción en la concentración de metabolitos en la solución es el resultado de la adsorción de metabolitos a la superficie NM. No se observó una adsorción significativa de metabolitos para los NM de poliestireno. Los diagramas de caja representan los valores mínimo y máximo, los rangos de mediana e intercuartílico. Figura reproducida de un análisis dirigido CESI-MS del metabolito corona publicado bajo una licencia Creative Commons CC BY de acceso abierto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figura 4: Análisis dirigido de los metabolitos aniónicos en la corona NM con un enfoque en la adsorción de isómeros. La adsorción de aniones a una gama de NM de titania muestra claras diferencias entre varios isómeros, como los fosfatos de azúcar. El rojo se refiere a la concentración inicial de metabolitos, mientras que el azul se refiere a la concentración de metabolitos después de una incubación de 1 h con el NM a 37 °C. La reducción en la concentración de metabolitos en solución es el resultado de la adsorción de metabolitos a la superficie NM. No se observó una adsorción significativa de metabolitos para el SiO2 y los NM de poliestireno. Las gráficas de caja representan los valores mínimo y máximo, los rangos de mediana e intercuartílico. Figura reproducida de un análisis dirigido por CESI-MS del metabolito corona publicado bajo una licencia Creative Common CC BY de acceso abierto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analito</td>
			<td>Área media de pico de RSD</td>
			<td>Tiempo medio de migración de RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>Péptidos de 1928 intradía (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationes intradía (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationes entre días (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Reproducibilidad de réplicas técnicas de CESI-MS para péptidos y metabolitos catiónicos. DSR: desviación estándar relativa, como medida de reproducibilidad. La reproducibilidad de CESI-MS en términos de áreas pico y tiempos de migración es muy buena, con todos los analitos con una RSD media &lt;15% y tiempos de migración &lt;2,2%. Estos resultados demuestran el alto grado de confianza que se puede atribuir a los datos recopilados mediante esta técnica y confirman que las variaciones detectadas se deben a diferencias genuinas en la composición de la muestra (enriquecimiento en NM) más que a la variación analítica. La Tabla 2 se genera a partir de los resultados presentados anteriormente11,15.

Aquí presentamos un protocolo para caracterizar la corona biomolecular completa, proteínas y metabolitos, adquiridos por nanomateriales a partir de biofluidos utilizando un enfoque de electroforesis capilar – espectrometría de masas.

Electroforesis capilar Enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito Corona adquiridos por nanomateriales

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Este protocolo es el primero en implementar CESI-MS para la caracterización no solo de la proteína corona, sino también de la corona de metabolitos de nanomateriales. CESI ofrece una separación ortogonal a los métodos tradicionales de LCMS, que es altamente reproducible y sensible mientras utiliza solo unos pocos nanolitros de muestra. Para empezar, divida dos mililitros del plasma humano en alícuotas de un mililitro, una para el metabolito y la proteína corona, y otra para la caracterización del metaboloma plasmático.Incubar un miligramo por mililitro de nanomateriales en el plasma humano durante una hora a 37 grados centígrados mientras se mezcla suavemente a 500 rotaciones por minuto en un termomezclador. A continuación, granular los nanomateriales centrifugando a 4.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante de plasma para el análisis de la corona de metabolitos y conserve el complejo de corona de proteínas del nanomaterial para la caracterización de la corona de proteínas.Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón PBS 10X y haga vórtice vigorosamente durante dos minutos para eliminar las proteínas no unidas. Centrifugar la solución a 4.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para granular los nanomateriales, luego retire el sobrenadante con cuidado sin alterar la bolita. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón ABC y haga un vórtice vigoroso durante dos minutos para eliminar las proteínas y las sales no unidas.Repita el paso de centrifugación y deseche el sobrenadante. Disuelva el pellet en 20 microlitros de tampón ABC que contenga 10 milimolares de ditiotreitol para reducir los enlaces disulfuro de proteínas. Incubar la solución durante 30 minutos a 56 grados centígrados.Agregue dos microgramos de tripsina de grado de secuenciación a los 20 microlitros de tampón ABC que contiene 0,1% de surfactante e incube la solución de digestión a 37 grados Celsius durante 16 horas. Alquilar la muestra añadiendo 20 microlitros de yodoacetamida de 55 milimolares en ABC de 100 milimolares e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Añadir 20 microlitros de ácido clorhídrico 0,1 molar para escindir el tensioactivo y dejar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente.Enriquezca y desale los péptidos utilizando una punta de pipeta desalinizante empaquetada con C18 como se describe en el manuscrito del texto. A continuación, liofilizar la muestra y almacenarla a 20 grados centígrados negativos hasta el análisis. Tome el plasma de control y el sobrenadante de la incubación de plasma de nanomateriales y póngalos en hielo.Alícuota 50 microlitros de cada muestra en viales separados, y diluir diez veces con agua destilada. Después del vórtice, mueva 50 microlitros de esta muestra diluida a nuevos viales. Agregue 200 microlitros de cloroformo, 250 microlitros de metanol y 350 microlitros de agua destilada y vórtice vigorosamente durante dos minutos.Centrifugar a 20, 800 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Tome 500 microlitros del sobrenadante y fíltrelo a través de un filtro centrífugo de tres kilodalton durante dos horas a 10.000 veces G a cuatro grados centígrados. Secar 430 microlitros del ultra filtrado en una aspiradora rápida y congelar la muestra.Antes de instalar los capilares en el instrumento CESI, compruebe que los extremos de entrada y salida de los capilares estén intactos y que no haya roturas visibles en el capilar. A continuación, coloque un nuevo capilar codificado en neutro en el instrumento, siguiendo las directrices del fabricante. Enjuague el capilar de separación en la dirección de avance con ácido clorhídrico 100 milimolar, luego con BGE y finalmente con agua destilada, utilizando las condiciones descritas en el manuscrito de texto.A continuación, enjuague tanto el capilar de separación como el capilar conductor con BGE, seguido de agua destilada, ácido clorhídrico 100 milimolares, agua destilada de nuevo y, finalmente, con BGE. Acople CESI al MS utilizando la fuente de nano pulverización y el adaptador. Para el análisis de corona de proteínas, vuelva a suspender las muestras liofilizadas en 20 microlitros de acetato de amonio de 50 milimolares a pH cuatro.Realizar el análisis CESI-MS para las muestras tal como se describen en el manuscrito del texto. Recopile datos de espectros de masas entre 250 y 2.000 m/z, con adquisición de fragmentación dependiente de los 10 datos principales, y enjuague el capilar entre muestras. Coloque un nuevo capilar de sílice fundida desnudo en el instrumento CESI.Enjuague el capilar de separación en la dirección de avance con metanol al 100 %, luego enjuague tanto el capilar de separación como el capilar conductor con BGE para garantizar la formación de gotas en los extremos de salida. A continuación, enjuague el capilar con agua destilada, seguido de hidróxido de sodio 0,1 molar, agua destilada de nuevo y, por último, con BGE. Acople CESI al SEMS utilizando la fuente de nano pulverización y el adaptador.Para realizar el análisis de corona de metabolitos, vuelva a suspender las muestras de plasma del nanomaterial expuestas y no expuestas en 430 microlitros de agua destilada y vórtice vigorosamente durante dos minutos. Filtre las muestras a través de un filtro de membrana de 0,1 micrómetros. Agregue cinco microlitros de los patrones internos, como se menciona en el manuscrito del texto, a 95 microlitros del filtrado y el vórtice vigorosamente.Centrífuga a 16, 100 veces G y cuatro grados centígrados. Realizar el análisis CESI-MS para las muestras tal como se describen en el manuscrito del texto. El uso de CESI-MS para la separación y detección proteómica y metabolómica demuestra buenas ventanas de separación en ambos capilares para cada enfoque, lo que permite una caracterización completa de la corona biomolecular.El método proteómico CESI-MS es capaz de distinguir entre una matriz de proteínas y concentraciones de proteínas en la corona en una amplia gama de composiciones de nanomateriales, y puede distinguir una corona de proteínas única para cada nanomaterial. Este enfoque metabolómico de CESI-MS permite un análisis cuantitativo del metabolito corona y se puede utilizar para descubrir sus huellas dactilares únicas. Aunque este enfoque caracteriza de forma pasiva la corona del metabolito del nanomaterial, sigue siendo capaz de descubrir información interesante sobre el papel de los metabolitos en la corona biomolecular, como la absorción diferencial de isómeros.Esta técnica permite caracterizar tanto la proteína como el metabolito corona, lo que permite una mejor comprensión de cómo la corona biomolecular completa afecta la absorción de nanomaterial por parte de las células.

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Electroforesis capilar Enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito Corona adquiridos por nanomateriales (Video) | JoVE Journal

Electroforesis capilar Enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito Corona adquiridos por nanomateriales

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