Caracterización espectroscópica UV-Vis de nanomateriales en medios acuosos
25 de octubre de 2021
Este estudio presenta los resultados de la evaluación comparativa para una comparación entre laboratorios (ILC) diseñada para probar el procedimiento operativo estándar (SOP) desarrollado para dispersiones coloides de oro (Au) caracterizadas por espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis), entre seis socios del proyecto H2020 ACEnano para la preparación de muestras, la medición y el análisis de los resultados.
La espectrofotometría UV-Vis es una técnica bien establecida, fácil de usar y económica para medir el tamaño, la concentración, el estado de agregación y el índice de refracción de los nanomateriales. UV-Vis proporciona un cribado y evaluación no invasivos y rápidos en tiempo real de las características de los nanomateriales mediante mediciones de absorción simples. UV-Vis es excepcionalmente sencillo.
Las muestras requieren poca preparación, y el software tiene pocas variables y es fácil de usar. Encienda el espectrómetro UV-Vis durante al menos 20 minutos para permitir que la lámpara se caliente. Cargue el software y seleccione Conectar el instrumento Seleccione la opción Spectrum Scan en la ventana de modo que muestra los modos de funcionamiento.
En el software, haga clic en Instrumento y vaya a Configuración en la barra de comandos, seleccione Parámetros para Spectrum Scan, luego ajuste la configuración para la medición. Vaya a la pestaña Instrumento y seleccione ABS para Modo de datos y Ancho de ranura de 1.5. Vaya a la pestaña Escaneo de longitud de onda y establezca una longitud de onda de inicio de 680 nanómetros, una longitud de onda final de 380 nanómetros y una velocidad de escaneo de 400 nanómetros por minuto.
Después de ajustar los parámetros, llene dos cubetas con un mililitro de agua ultra pura y colóquelas en el soporte de referencia y celda de muestra para cubrir la trayectoria de la luz. Cierre la tapa del instrumento y continúe con la calibración en blanco seleccionando espacio en blanco en la barra de comandos y, a continuación, seleccione Aceptar. Tome una submuestra de 500 microlitros de cada muestra de nanopartículas de oro y prepare una dilución con 500 microlitros de agua ultrapura. Coloque las diluciones en cubetas de un mililitro con una concentración final de 25 microgramos por mililitro.
Ejecute una calibración en blanco. Después de la calibración en blanco, reemplace una de las cubetas en blanco en el soporte de la celda de muestra con una muestra de nanopartículas de oro, manteniendo intacta la cubeta de referencia. Seleccione la medida Inicio en la barra de comandos para ejecutar el análisis.
Ejecute tres exploraciones de espectro para cada muestra de nanopartículas de oro diluidas y muestra desconocida. Extraiga los datos experimentales sin procesar para cada medición en un archivo compatible con hojas de cálculo. Seleccione Propiedad en el escaneo, en la barra de comandos, vaya a la pestaña Imprimir/Exportar, haga clic en Datos, espectro y parámetros y presione Aceptar. Haga clic en Guardar en la barra de comandos y guarde los datos como un archivo xls.
Anote la longitud de onda de absorción máxima y lambda para cada una de las lecturas y regístrelas en la plantilla proporcionada. Trazar una curva de calibración con el promedio de lambda máximo contra el tamaño de nanopartícula seleccionando datos, insertar gráfico, diagrama de dispersión, agregar línea de tendencia y curva polinómica. Para incluir la ecuación polinómica de la curva de calibración, seleccione Opciones de línea de tendencia y Mostrar ecuación en el gráfico en la barra de comandos.
Finalmente, calcule el tamaño de la muestra de nanopartículas de oro desconocida aislando la ecuación polinómica de la curva de calibración para ajustarse al valor medio de la lambda máxima desconocida utilizando una derivación de la fórmula cuadrática. Entre los seis laboratorios, la longitud de onda máxima mostró una repetibilidad cercana, mientras que los resultados de la absorbancia máxima exhibieron un rango más disperso de valores de datos para diferentes tamaños de nanopartículas de oro. Los rangos y los medios generales para cada tamaño de nanopartícula de oro se muestran aquí.
El valor máximo de la puntuación Z para lambda max fue reportado por el laboratorio tres para las nanopartículas de tamaño de 5 nanómetros, y la puntuación z más alta para la máxima absorbancia fue reportada por el laboratorio uno para las nanopartículas de tamaño 40 nanómetros. La mayoría de los socios calcularon que el tamaño de la nanopartícula desconocida era de 76 a 80 nanómetros, y el laboratorio cinco informó un tamaño atípico mayor de 109 nanómetros. Los puntajes Z para tamaños desconocidos se calcularon entre menos 0.25 y menos 0.56 para todos los laboratorios, con la única excepción reportada por el laboratorio cinco, que mostró el puntaje Z positivo más alto de 2.03.
Asegúrese de que los parámetros y la configuración se hayan ajustado correctamente. Las muestras diluidas deben prepararse frescas antes de la medición con el UV-Vis. UV-Vis se puede combinar fácilmente con otras herramientas, como TEM, DLS y AFM para medir una gran variedad de atributos si los usuarios desean caracterizar su muestra de manera más completa.
Resumen
Este estudio establece como referencia una comparación interlaboratorios (ILC) para evaluar el procedimiento operativo estándar (SOP) de dispersiones coloidales de oro (Au) utilizando espectroscopía UV-Vis. Seis socios del proyecto H2020 ACEnano participaron en el estudio, centrándose en la preparación de muestras, la medición y el análisis de resultados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Nanomateriales
- Química Analítica
- Comparaciones Interlaboratorios
Antecedentes
- La espectrofotometría UV-Vis es una técnica ampliamente utilizada para caracterizar nanomateriales.
- El método es no invasivo y permite la evaluación en tiempo real de las características de la muestra.
- Mediciones simples de absorción proporcionan información sobre el tamaño, la concentración y el estado de agregación.
- Los procedimientos operativos estándar son esenciales para obtener resultados consistentes entre laboratorios.
Objetivo del estudio
- Evaluar el procedimiento operativo estandarizado para dispersiones de coloides de oro en múltiples laboratorios.
- Evaluar la repetibilidad y fiabilidad de las mediciones UV-Vis.
- Analizar los resultados e identificar discrepancias en las mediciones del tamaño de nanopartículas.
Métodos Utilizados
- Preparación de muestras de nanopartículas de oro y sus diluciones.
- Calibración del espectrómetro UV-Vis y mediciones del blanco.
- Realización de múltiples escaneos de espectros para cada muestra.
- Extracción y análisis de datos para determinar los tamaños de las nanopartículas.
Resultados principales
- Repetibilidad cercana en las mediciones de longitud de onda máxima entre laboratorios.
- Variabilidad en los resultados de absorbancia máxima para diferentes tamaños de nanopartículas.
- La mayoría de los laboratorios estimaron tamaños de nanopartículas desconocidas entre 76 y 80 nanómetros.
- El laboratorio cinco reportó un valor atípico de 109 nanómetros.
Conclusiones
- El estudio destaca la importancia de procedimientos estandarizados para mediciones UV-Vis.
- Las discrepancias en los datos de absorbancia sugieren la necesidad de una investigación adicional.
- La colaboración entre laboratorios puede mejorar la precisión y confiabilidad de las mediciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La espectroscopía UV-Vis permite un cribado rápido y no invasivo del tamaño, la concentración y el estado de agregación de nanomateriales, apoyando la caracterización fisicoquímica en etapas tempranas del desarrollo de nanomedicinas. Los protocolos estandarizados mejoran la reproducibilidad entre laboratorios, reduciendo la variabilidad en la evaluación preclínica de nanomateriales. Esto aumenta la confianza predictiva en la selección de candidatos líderes y mitiga los riesgos asociados con el comportamiento inconsistente de los nanomateriales en sistemas biológicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las propiedades fisicoquímicas de nanomateriales que influyen en las interacciones biológicas y en la unión al objetivo.
- Valor operativo: Proporciona una evaluación inicial rápida y de bajo costo para priorizar candidatos de nanomateriales en evaluaciones posteriores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de absorción adecuados para establecer curvas de calibración y relaciones entre tamaño y concentración.
- Valor operativo: Apoya la estandarización de ensayos mediante rangos definidos de longitudes de onda, velocidades de escaneo y anchos de rendija para mediciones consistentes.
- Valor estratégico: Facilita la preparación para cribado de alto rendimiento al permitir la monitorización en tiempo real de agregación y estabilidad.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Proporciona métricas de tamaño y agregación repetibles, fundamentales para correlacionar las propiedades de los nanomateriales con la eficacia y los resultados de toxicidad en estudios preclínicos.
- Valor operativo: Permite la comparación de datos entre laboratorios cuando se siguen los procedimientos operativos estándar, apoyando estudios preclínicos multilaboratorio.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
La caracterización UV-Vis se integra en el continuo de descubrimiento desde la síntesis inicial de nanomateriales hasta la evaluación preclínica, especialmente cuando se combina con técnicas ortogonales como TEM o DLS para un perfilado completo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre cómo el tamaño y la agregación afectan la absorción celular y la unión al blanco.
- Selección: Permite la preparación del ensayo al proporcionar retroalimentación rápida y en tiempo real sobre la estabilidad del nanomaterial durante la incubación del compuesto.
- Análisis: Proporciona resultados de longitud de onda máxima y absorbancia que permiten estimar el tamaño y el estado de agregación mediante curvas de calibración.
- Investigación Traductiva: Se conecta con la continuidad preclínica al ofrecer un método estandarizado para rastrear las propiedades del nanomaterial en distintas condiciones de formulación y almacenamiento.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad escalable y reutilizable para el control de calidad de nanomateriales en las etapas de descubrimiento y desarrollo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en el comportamiento de los nanomateriales al reducir la ambigüedad mecanicista derivada de muestras mal caracterizadas.
- Valor operativo: Promueve la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad entre laboratorios y proyectos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos fisicoquímicos confiables desde las primeras etapas del desarrollo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo basada en perfiles consistentes de tamaño y agregación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en espectrofotometría y manejo de nanomateriales para garantizar la preparación adecuada de muestras y la calibración correcta del instrumento.
- Depende de una fuente de luz estable y de la precisión en la longitud de onda, lo que exige un calentamiento regular del instrumento y mantenimiento periódico.
- Necesita un acuerdo entre los equipos sobre los procedimientos operativos estandarizados (POE) para factores de dilución, selección de cubetas y formatos de exportación de datos, a fin de asegurar la comparabilidad.
- Debe tener en cuenta las limitaciones para detectar nanomateriales menores a 5 nm o en matrices biológicas complejas sin una previa purificación.
- Se beneficia de la integración con técnicas complementarias (por ejemplo, MET, DLS) para lograr una caracterización fisicoquímica completa cuando la espectrofotometría UV-Vis por sí sola no es suficiente.
