Enfoque sistemático para identificar nuevas moléculas antimicrobianas y antibiócidas de extractos y fracciones de plantas para prevenir caries dentales

El protocolo presentado se utiliza para la detección y análisis correctos de candidatos bioactivos en productos naturales para controlar biofilms orales. También se puede adaptar para aplicaciones en otros campos de investigación de biofilm. Este método de cribado y análisis de almidón más permite eliminar componentes bioactivos simultáneamente.

Caries dentales es una dieta de biofilm derivada, altamente prevalente, enfermedad crónica. Este protocolo puede ayudar a identificar productos naturales para controlar biofilms y, en consecuencia, caries dentales. Comience preparando el disolvente de extracción con una mezcla hidroalcohólica.

Muestrea concentraciones entre 50 y 100 miligramos por mililitro del disolvente de extracción y realice extracciones asistidas por ultrasonido de 15 minutos en microtubos. Repita la extracción tres veces. Después de cada paso de extracción, centrífuga la muestra para decapar los residuos sólidos y eliminar el sobrenadante.

Combine los sobrenautas de cada paso de extracción y filtrelos. Guarde las alícuotas para análisis químicos y bioensayos. Para el fraccionamiento, diluya la muestra de extracto de crudo para obtener una solución de 100 miligramos por mililitro, utilizando el disolvente de extracción inicial.

A continuación, transfiera un mililitro de esta muestra a un cartucho de extracción de fase sólida precondicionado con un gramo de absorbente y una capacidad de seis mililitros. Realice el fraccionamiento, utilizando alrededor de tres volúmenes muertos de cada LUN de extracción y recopile una fracción por composición lun. Ahorre coácuotas para análisis químicos y bioensayos.

Retire el disolvente bajo vacío, flujo de nitrógeno o liofilización, y registre el peso y el rendimiento. Reconstituir la materia seca con los mejores disolventes posibles. Calcular la concentración de disolvente para la solución de stock, utilizando la fórmula en el manuscrito de texto.

Reactivar la cepa microbiana de S.mutans UA 159 en agar sanguíneo, y cultivarla en medio de cultivo líquido. Realice una dilución de uno a 20 del cultivo inicial utilizando el mismo medio de cultivo e incubarlo hasta que llegue a la fase de crecimiento de mediados del registro. Preparar el inoculum con una población definida en TYEG para ensayos antimicrobales y TYE con 1% sacarosa para ensayos de biofilm.

Para la actividad antimicrobírica, defina la concentración de la muestra para su análisis y agréguela a una placa de 96 pozos. Incluya un conjunto de controles en cada placa, como se describe en el manuscrito de texto. Usando TYEG, ajusta el volumen a 100 microlitros, inocula 100 microlitros de cultivo microbiano e incuba la placa durante 24 horas a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%.

Analizar el crecimiento bacteriano de acuerdo con la turbidez mediante la inspección visual de los pozos. Inocular una alícuota de la dilución deseada en placas de agar específicas en duplicados, e incubar las placas. Después de la incubación, realizar recuentos de colonias.

Pesar las cuentas de hidroxiapatita en microtubos y esterilizarlas. A continuación, lave las cuentas, usando el búfer de adsorción Ab.Add 500 microliters de saliva en los microtubos para formar una película salival, e incubar a 37 grados Celsius con 24 rotaciones por minuto durante 40 minutos. Retire el sobrenadante de saliva y lave las cuentas tres veces con Ab para prepararlas para los ensayos posteriores.

Añadir 500 microlitros de la muestra o el control en cada microtubo que contenga cuentas con pellicle salival, e incubarlas a 24 rotaciones por minuto y 37 grados centígrados durante 30 minutos. Lave las cuentas tres veces con Ab.Add 500 microliters de cultivo microbiano a cada microtubo e incuba los tubos en condiciones similares durante una hora. A continuación, lave las celdas sin enlazar tres veces con ab buffer.

Resuspend cada muestra con un mililitro de ab buffer, y centicade a siete vatios durante 30 segundos. Diluya en serie las alícuotas de cada suspensión, diez veces, y éles una placa en placas de agar específicas. Incubar las placas durante 48 horas a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono, y contar las colonias.

Para el análisis de datos, introduzca los datos sin procesar de los bioensayos en una hoja de cálculo y calcule el registro de la inhibición del crecimiento microbiano por cada tratamiento y el porcentaje de registro de la inhibición del crecimiento microbiano, en comparación con el control. Corrija la densidad óptica de las lecturas y calcule el porcentaje de inhibición de la biomasa. El perfil químico de la detección biológica de la cantidad de diterpenos de tipo Clerodane y flavonoides glicosilados en tres variedades de extractos de C.sylvestris, a saber, sylvestris, intermedio y lingua, se muestran aquí.

Después del análisis de los datos sin procesar, cuatro extractos mostraron una respuesta favorable. Los datos cromatográficos de estos cuatro extractos muestran la presencia simultánea de diterpenos de tipo Clerodane y flavonoides glicosilados. Además, incluyen el mismo bioma y variedad.

El porcentaje calculado de CFU de células planctónicas tratadas, el porcentaje de biomasa de los biofilms tratados y el porcentaje de CFU del biofilm tratado se muestran aquí. Ningún extracto crudo afectó significativamente la eliminación de células S.mutans adheridas al pellicle salival. La adhesión de las células S.mutans a la matriz glucana se debilitó por tres de los extractos crudos.

Dado que cada especie de planta requiere métodos de análisis químicos optimizados y específicos, la mejor fracción solvente y método analítico deben seleccionarse de informes anteriores o definirse mediante diseño experimental. Es fundamental preparar formulaciones con el extracto crudo y fracciones más activos y probarlas en modelos complejos para evitar el desarrollo de biofilms y cavidades.