Generación de neuronas humanas y oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes para modelar las interacciones neuronal-oligodendrocitos

Se espera que los protocolos aquí descritos faciliten futuros estudios sobre defectos oligodendrogliales, en la patogenia de la neurodegeneración. Se trata de un método mejorado que puede utilizarse para generar células funcionales del linaje de oligodendrocitos humanos en sólo tres o cuatro semanas, y establecer un sistema de cocultivo para modelar las conexiones de los oligodendrocitos neuronales. El protocolo se puede utilizar para estudiar no solo la enfermedad de Alzheimer, sino cualquier otro aspecto asociado a la enfermedad de las interacciones de los oligodendrocitos neuronales.

Para comenzar, coloque aproximadamente un millón de células HEK293T en cada matraz T75 para lograr un 40% de confluencia, luego transfectérelas con plásmidos que expresen NGN2 inducible por tetraciclina y el gen transactivador de tetraciclina resistente a la puromicina, junto con los tres plásmidos auxiliares. Utilice PEI para la transfección. Cambie el medio después de 16 horas.

Harvest liberó partículas virales recolectando medios de cultivo todos los días y reemplazándolos con medios frescos durante tres días. Agrupe los medios recolectados para la purificación, luego filtre el virus a través de un filtro de 0,22 micrómetros y centrifugue a 49.000 veces G durante 90 minutos. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en el volumen adecuado de glucosa PBS.

Utilice células madre embrionarias humanas H1 disponibles en el mercado para realizar la inducción de neuronas. Cultive las células en placas de 6 pocillos recubiertas con solución de matriz extracelular con medio de mantenimiento ESL e incube las placas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Dos días antes de la inducción de la diferenciación, se separan las células madre embrionarias añadiendo un mililitro de solución de desprendimiento de células e incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Transfiera las células a un tubo, luego lave el pocillo con dos mililitros de medio y agréguelo al mismo tubo. Centrifugar las células a 300 veces G durante cinco minutos. A continuación, vuelva a suspender el pellet en el medio y coloque las células en placas de 6 pocillos recubiertas de matriz con una densidad de asiento de una vez 10 a la quinta celda por pocillo.

Al día siguiente, agregue lentivirus, que expresan NGN2 más puro. R, y el transactivador de tetraciclina junto con polibreno en medio de mantenimiento de células madre embrionarias frescas. En el día cero, añadir dos microgramos por mililitro de doxiciclina en medio DMEM/F-12 suplementado con N2 y sin morfógenos.

El primer día, agregue puromicina en DMEM/F-12 fresco, más N2 y doxiciclina hasta la concentración final de un microgramo por mililitro. Seleccione las células transducidas en puromicina durante al menos 24 horas. En el segundo día, separe las neuronas diferenciadoras con solución de desprendimiento de células y vuelva a colocarlas en placas de 24 pocillos recubiertas con solución de matriz.

Manténgalos en medio MBA B27 sin doxiciclina. Cultivo de neuronas inducidas puras en las placas, recubiertas con soluciones extracelulares basadas en matriz. Para llevar a cabo la generación de células progenitoras neurales, se cultivan células madre embrionarias humanas H1 y se transdiferencian en células progenitoras neurales, como se describe en el manuscrito del texto.

En el primer día negativo, siembre de 0,5 a un millón de células en un medio de mantenimiento de células madre embrionarias en cada pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta con una solución de matriz reducida en factor de crecimiento. En el día cero, trate las células durante 24 horas con medio de mantenimiento de células madre embrionarias suplementado con 2% de DMSO. En los días uno a seis, cambie el medio completo con un medio de inducción neuronal tibio que contenga algunos inhibidores del TDA de un kit comercial.

En el séptimo día, pase a los NPC usando solución de desprendimiento de celdas y póngalos en una placa a una densidad de asiento de una a dos veces 10 a la quinta celda por pocillo de una placa de 24 pocillos. Evaluar la eficiencia de diferenciación mediante tinción inmunohistoquímica para detectar la ausencia de marcadores de pluripotencia y la presencia de marcadores NPC. Para generar las células precursoras de oligodendrocitos, se colocan las NPC en un medio de inducción neuronal caliente con algunos inhibidores de adición de un kit comercial.

En el octavo día, prepare una solución de DMSO al 1% en el medio de diferenciación OPC y trate los NPC plateados durante 24 horas. En el día nueve, reemplace el medio con un medio de diferenciación OPC fresco sin DMSO, luego alimente las células cada dos días hasta el día 15. Si las celdas alcanzan la confluencia antes del día 15, páselas a la densidad de asiento de una a dos veces 10 a la quinta celda por pocillo.

En el día 14, coloque OPC en un medio de diferenciación de OPC a una densidad de una a dos veces 10 a la quinta celda por pocillo, en una placa de 24 pocillos. Células de prueba para detectar la presencia de marcadores específicos de OPC mediante tinción IHQ o qPCR, y para detectar la ausencia de marcadores NPC. En el día 15, reemplace el medio con el medio de maduración OL.

Cambie el medio cada dos días o todos los días. Cuando las células alcancen el 90% de confluencia, divídalas en una proporción de uno a tres durante un máximo de dos pasajes o hasta que la división celular se ralentice sustancialmente. Si las OPC se dividen demasiado rápido y alcanzan la confluencia en menos de tres días, agregue Ara-C a una concentración de dos a cinco micromolares durante uno a tres días.

El día 14, coloque los IOPC a una densidad de una vez 10 a la quinta celda por pocillo en una placa de 24 pocillos en medio de diferenciación OPC. Al día siguiente, separe las neuronas humanas inducidas con una solución de desprendimiento de células. Agregue neuronas a las OPC cultivadas, colocando placas a la densidad de asiento de dos veces 10 a la quinta celda por pocillo.

Utilice un medio de cocultivo que contenga medio neurobasal A, un suplemento de 2%B27 y 100 nanogramos por mililitro de triyodotironina T3. Cambie el medio al día siguiente y luego cada dos días. Si las OPC proliferan demasiado rápido y alcanzan la confluencia en menos de tres días, agregue de dos a cinco micromolares Ara-C.

Es importante que las células madre pluripotentes humanas iniciales exhiban un alto grado de pluripotencia para la generación exitosa de neuronas inducidas, u OPC y oligodendrocitos. Por lo tanto, las células deben teñirse para marcadores específicos, como OCT-4 y SOX2, antes de iniciar cualquiera de los protocolos de inducción. Se utilizaron células H1 humanas para obtener neuronas excitadoras inducidas del prosencéfalo.

Las neuronas puras en cultivo comenzaron a expresar sinapsis en una sola a los 14 a 16 días. Los FIDAC se generaron en dos semanas y los oligodendrocitos maduros en cuatro o cinco semanas. El tratamiento con DMSO enriqueció el número de células en la fase G1 temprana para una mejor integración de la señalización.

Los marcadores OPC específicos se detectaron tan pronto como dos semanas después de la siembra de las células ES H1. La población de FIDAC a las dos semanas era bastante homogénea, con más del 95% de las células positivas para la tinción 04 y un alto nivel de inmunorreactividad para otros marcadores. Tras el inicio de la maduración de los oligodendrocitos, se detectaron marcadores específicos de oligodendrocitos a partir del día 28.

Las densidades ideales de siembra para las neuronas inducidas, y los IOPC, deben determinarse con una serie de titulaciones del número de células para lograr una diferenciación adecuada. Después de cuatro semanas, en cocultivos, los IOPC deben diferenciarse adecuadamente en oligodendrocitos que sean positivos para marcadores específicos como MBP. Este sistema de cocultivo puede aumentar considerablemente el número de sinapsis, lo que indica que los IOPC proporcionan un apoyo neuronal a través del contacto físico o la liberación de factores tróficos.

Este procedimiento descrito puede ser más sofisticado mediante la adición de diferentes tipos de células cerebrales. Por ejemplo, las células madre derivaron astrocitos humanos para modelar aspectos novedosos de las interacciones gliales de las neuronas en la salud y la enfermedad.