Perfil celular de alto rendimiento de compuestos de degradación de proteínas específicas utilizando líneas celulares HiBiT CRISPR

Este enfoque permite la monitorización celular de la degradación de proteínas y la detección rápida de compuestos degradadores. La dinámica de la degradación se puede monitorear en un contexto celular de una manera altamente sensible y cuantitativa, lo que permite una determinación precisa de los parámetros clave de degradación. Estos métodos permiten la elaboración de perfiles HTS de la actividad del compuesto degradador, lo que permite el triaje en la fase temprana de descubrimiento terapéutico.

También proporcionan información para cualquier persona que quiera estudiar la modulación de los niveles objetivo endógenos, ya sea en aumento o en disminución. La comprobante del procedimiento estará a cargo de Celia Bisbach, científica investigadora de mi laboratorio. Comience por preparar y colocar en placas las células adherentes o en suspensión de mamíferos.

Ajuste la densidad de celdas a 2,22 veces 10 por la quinta celda por mililitro y dispense en placas con un mínimo de tres pocillos por condición experimental y de control. Prepare PROTAC diluido en serie, o placas de compuestos de prueba degradantes, a una concentración de 1000x en 100% DMSO. A continuación, diluirlo hasta una concentración final 10 veces mayor en el medio de cultivo celular.

Agregue un volumen igual de DMSO al medio para crear un control DMSO sin compuestos. Agregue la cantidad apropiada de compuesto 10x o solución de control a las celdas en la placa e incube las placas a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono. Para medir la señal luminiscente del punto final, prepare 2 reactivos de detección lítica agregando 20 microlitros de sustrato lítico y 10 microlitros de proteína LgBiT por cada mililitro del tampón lítico.

Prepare suficiente reactivo para todos los pocillos que se van a analizar, incluido el volumen adicional para tener en cuenta el error de pipeteo. Agregue el reactivo de detección lítico preparado a las células y mezcle la placa en un mezclador de vórtice de microplacas durante 10 a 20 minutos a 350 RPM. Mida la luminiscencia en un luminómetro capaz de leer una placa de 96 o 384 pocillos.

Si utiliza la multiplexación de viabilidad celular, hágalo antes de agregar el reactivo lítico. De 30 a 40 minutos antes de la medición del punto final deseado, prepare una solución de reactivo de detección de viabilidad celular 6x agregando 10 microlitros del sustrato a dos mililitros del tampón de ensayo. Agregue el reactivo preparado a los pocillos y mezcle brevemente en un mezclador de vórtice de microplacas.

Luego incube la placa durante 30 minutos en una incubadora a 37 grados centígrados. En el punto final deseado, mida la fluorescencia en un instrumento capaz de leer la fluorescencia en formato de 96 o 384 pocillos. Prepare 2 reactivos líticos como se describió anteriormente.

A continuación, añada el reactivo a los pocillos y mezcle la placa en un mezclador de vórtice de microplacas durante 10 a 20 minutos. Después de mezclar, use un luminómetro para medir la luminiscencia. Para demostrar el análisis de degradación lítica de punto final de concentración única, varias proteínas diana de CDK se marcaron endógenamente con HiBiT y se trataron con PROTAC TL12-186 basado en la panquinasa cereblon.

Se midió el nivel de proteína CDK en diferentes puntos temporales y se determinó la RLU fraccional. Para comprender cómo las proteínas CDK se comparan directamente entre sí en términos de pérdida de proteínas, las RLUs fraccionales se calcularon como porcentaje total de degradación. Se realizó un análisis de degradación cinética mediante el marcaje endógeno de proteínas miembros de la familia BET con células HiBiT y HEK293 que expresan de manera estable la proteína LgBiT.

A continuación, las células se trataron con tres concentraciones diferentes de los PROTAC pan-BET. el dBET6 basado en el cerebro, y el ARV-771 basado en la BVS. Aquí se muestran los perfiles cinéticos de degradación de la dosis-respuesta de las células Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat que expresan de manera estable la proteína LgBiT tratadas con cuatro compuestos de pegamento molecular diferentes.

Se observan diferencias significativas en la respuesta a la degradación entre los compuestos, así como entre las series de concentración. Para evaluar cuantitativamente la degradación y el orden de clasificación de los compuestos, se utilizaron los perfiles de dosis-respuesta para calcular los parámetros clave de degradación, incluida la tasa de degradación, el máximo de degradación y los valores de Dmax50. Los ensayos multiplex de viabilidad celular no mostraron pérdida de viabilidad celular para las concentraciones analizadas.

Los pasos más importantes de este protocolo son la determinación de la RLU fraccional o la degradación porcentual por normalización al control DMSO. Siguiendo este protocolo, se podría realizar un ensayo fenotípico para comprender cómo la pérdida de una proteína en particular puede afectar la salud o la función celular. Además, estas líneas celulares HiBiT también se pueden utilizar para estudiar las interacciones de proteínas o la unión de moléculas pequeñas mediante la tecnología NanoBRET.