Análisis del repertorio inmune del receptor de células T y B mediante secuenciación de próxima generación
12 de enero de 2021
El protocolo actual describe un método para el aislamiento del ADN de muestras de sangre y biopsias intestinales, la generación de bibliotecas de TCRβ y IGH PCR para la secuenciación de próxima generación, la realización de una ejecución de NGS y el análisis de datos básicos.
Este método permite la exploración de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos y, por lo tanto, puede identificar cambios dinámicos en las poblaciones de linfocitos y parámetros de diversidad en diferentes trastornos. La ventaja de la secuenciación de próxima generación es la capacidad de identificar clones únicos de células T o B y rastrearlos en diferentes sitios anatómicos o en diferentes individuos. Esto tiene el potencial para la identificación de nuevos biomarcadores en diversas enfermedades.
Demostrando ese procedimiento estará Naomi Salamon, una asistente de investigación de mi laboratorio. Comience por realizar la digestión y la lisis celular de las biopsias intestinales. Recupere biopsias intestinales recién recolectadas o almacenadas a 20 u 80 grados centígrados negativos.
Si usa biopsias congeladas, descongelarlas en hielo. Añadir 600 microlitros de solución de lisis de núcleos a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,7 mililitros, refrigerado sobre hielo. Luego coloque una biopsia en el tubo e incubarlo a 65 grados Celsius durante 15 a 30 minutos.
Agregue 17.5 microlitros de 20 miligramos por mililitro proteinasa K, e incube el tubo durante la noche a 55 grados Celsius, con un temblor suave. Después de la incubación, deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante cinco minutos. Para el aislamiento del ADN de la sangre, mezcle suavemente el tubo hasta que se mezcle completamente.
Luego transfiera sangre a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros que contiene nueve mililitros de solución de lisis celular. Invierta el tubo varias veces durante un período de incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. Centrífuga a 600g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Luego deseche tanto sobrenadante como sea posible sin molestar el pellet blanco visible. Vórtice el tubo vigorosamente durante 15 segundos hasta que se resuspended por completo. Agregue tres mililitros de solución de lisis de núcleos y pipetee varias veces, haciendo que la solución se vuelva viscosa.
Agregue tampón de precipitación de proteínas a la muestra. Luego vórtice vigorosamente durante 20 segundos, e incubarlo en hielo durante cinco minutos. Centrífuga a 16, 000g durante cuatro minutos para formar un pellet apretado que contiene las proteínas precipitadas.
Transfiera cuidadosamente el sobrenadante sin molestar el pellet a un nuevo tubo de 1.7 mililitros. Agregue un mililitro de 2-propanol al tubo que contiene el sobrenadante y mézclelo suavemente invirtiendo. El ADN debe hacerse visible como una sustancia flotante blanca.
Centrífuga a 16, 000 veces g durante un minuto, y retire el sobrenadante por completo. Agregue un mililitro de etanol al 70% recién preparado e invierta el tubo varias veces. Centrifugarlo a 16,000g durante un minuto a temperatura ambiente.
A continuación, deseche cuidadosamente el sobrenadante. Repita el lavado de etanol. Luego deje que el pellet de ADN se seque al aire durante 10 a 15 minutos.
Agregue 50 microlitros de agua ultra-pura al ADN y realice la cuantificación del ADN como se describe en el manuscrito del texto. Utilice 150 nanogramos de ADN para preparar la biblioteca para la secuenciación. Coloque pipetas y puntas en la campana con luz UV durante 15 minutos para descomponer el ADN residual.
Mientras tanto, permita que los diferentes tubos de índice y adn polimerasa se descongele en el hielo. En una campana biológica, agregue 45 microlitros de los diferentes tubos índice a los tubos de PCR, teniendo cuidado de evitar la contaminación cruzada. A continuación, agregue 0,2 microlitros de la ADN polimerasa y cinco microlitros del ADN preparado en los tubos de PCR.
Ejecute PCR utilizando un programa preestablecido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice perlas magnéticas para la eliminación del exceso de cebadores, nucleótidos y enzimas. Caliente las perlas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos y prepare suficiente etanol fresco al 80% para 400 microlitros por muestra.
Agregue las perlas a cada tubo de PCR y mezcle pipeteando 10 veces. Incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Coloque la muestra mixta en el soporte magnético durante cinco minutos.
Luego aspire el líquido claro y deseche. Aspirar el líquido restante usando una punta de 10 microlitros. Agregue 200 microlitros de etanol al 80% a cada muestra e incube durante 30 segundos.
Aspirar 195 microlitros de etanol, y desechar. Luego aspire el líquido restante usando una punta de 10 microlitros. Repita el lavado de etanol.
Luego abra las tapas de los tubos y déjelos secar al aire durante cinco minutos. Después de cinco minutos, retire las muestras del soporte magnético y agregue 25 microlitros de tampón de elución. Mezclar mediante pipeteo hasta que sea homogéneo, e incubar a temperatura ambiente durante dos minutos.
Coloque los tubos en el soporte magnético durante cinco minutos. Luego transfiera 22 microlitros a un nuevo tubo de PCR y mida la concentración de ADN. Cuantifique el amplicon como se describe en el manuscrito del texto.
Después de calcular la concentración final de ADN y el tamaño en pares de bases del pico del producto, prepare una nueva mezcla de dilución para cada muestra y transfiera dos microlitros de la misma a una nueva mezcla de piscina. Prepare una solución fresca de 0,2 hidróxido de sodio normal y agregue 10 microlitros a la biblioteca diluida. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar el ADN de doble cadena.
Luego agregue 980 microlitros de tampón pre-refrigerado del kit al tubo que contiene ADN y vórtice brevemente. Cargue 600 microlitros de la biblioteca final en el cartucho designado y coloque las muestras en la máquina. Para realizar el análisis de secuenciación, descargue las métricas de secuenciación del secuenciador y compruebe que los datos están dentro de los intervalos adecuados.
Repita la ejecución para los ejemplos que no cumplen los criterios. Este protocolo fue utilizado para realizar un análisis básico de la sangre autóloga representativa y de las muestras rectales de un paciente con deficiencia del receptor IL10 y una historia del infantil-inicio severo IBD. Las muestras fueron probadas para el repertorio TCR-beta y IGH.
Todos los clones pueden ser identificados por su secuencia única a nivel de nucleótidos o aminoácidos. Estas secuencias se pueden comparar entre diferentes pacientes en busca de clones compartidos o en el mismo paciente entre diferentes sitios anatómicos. Los cinco clones más frecuentes para cada muestra se muestran aquí.
Se generaron imágenes de TreeMap para una amplia visión general del repertorio. Cada cuadrado de color representa un clon diferente, y el tamaño se correlaciona con su frecuencia. Estas imágenes de TreeMap demuestran la extensión clónica en el repertorio intestinal de IGH.
En cambio, en el repertorio TCR-beta, la extensión clónica marcada se observa en la sangre en comparación con el intestino autólogo. A nivel de genes, NGS proporciona información sobre el uso de V, D y J a nivel de cualquier gen, familia o alelo. Por otra parte, las combinaciones específicas de VDJ se pueden inferir de los datos para los repertorios TCR-beta y IGH, revelando patrones diferenciados del uso del gen en varias condiciones.
Este protocolo se puede aplicar en la DNA y el ARN y se puede utilizar para generar la TCR-alfa, la TCR-gamma, y los repertorios de IGL. También es compatible con otros órganos después de ligeras modificaciones de digestión.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para aislar ADN de muestras de sangre y biopsias intestinales, generar bibliotecas de PCR de TCRβ y IGH para secuenciación de próxima generación (NGS) y realizar un análisis básico de datos. Permite explorar la dinámica de las células T y B a nivel de nucleótidos o aminoácidos, facilitando la identificación de clones únicos en diferentes sitios anatómicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Genómica
- Secuenciación de Nueva Generación
Antecedentes
- La secuenciación de nueva generación permite un análisis detallado de las poblaciones de linfocitos.
- Este método puede revelar cambios dinámicos en las respuestas inmunitarias a través de diversas enfermedades.
- La identificación de clones únicos de células T o B puede conducir al descubrimiento de nuevos biomarcadores.
- El procedimiento es demostrado por un asistente de investigación en el laboratorio.
Objetivo del estudio
- Aislar ADN de muestras biológicas para secuenciación.
- Analizar la diversidad de células T y B en diferentes enfermedades.
- Seguimiento de clones de células inmunitarias en diversas localizaciones anatómicas.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de ADN a partir de sangre y biopsias intestinales.
- Generación de bibliotecas de PCR de TCR尾 e IGH.
- Realización de corridas de secuenciación de nueva generación.
- Análisis básico de los resultados de secuenciación.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de ADN a partir de muestras.
- Generación de bibliotecas adecuadas para NGS.
- Identificación de clones únicos de células T y B.
- Información sobre la diversidad de linfocitos en diversas enfermedades.
Conclusiones
- Este método mejora la comprensión de la dinámica inmune.
- Proporciona un marco para identificar biomarcadores en enfermedades.
- El enfoque puede adaptarse para diversas aplicaciones de investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis del repertorio inmune de los receptores de células T y B mediante secuenciación de nueva generación proporciona a la I+D de biofármacos una visión de alta resolución sobre la dinámica inmune adaptativa, permitiendo la reducción mecanicista de riesgos en la validación de dianas y el descubrimiento de biomarcadores. Al cuantificar la clonalidad, el uso de genes y la diversidad del repertorio en diferentes estados de enfermedad, este método respalda la confianza predictiva en las decisiones tempranas de descubrimiento y traslación. Esta capacidad es directamente aplicable a líneas de desarrollo enfocadas en inmunología, que buscan vincular las respuestas inmunitarias con los resultados terapéuticos en condiciones inflamatorias, infecciosas, oncológicas y autoinmunes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el seguimiento de clones de linfocitos T y B específicos para antígenos en diferentes sitios anatómicos y puntos temporales.
- Valor operativo: Proporciona una resolución a nivel de nucleótidos o aminoácidos de los repertorios inmunitarios para aclarar el compromiso funcional del blanco y la reducción del riesgo biológico.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al identificar poblaciones clonalmente expandidas que se correlacionan con el fenotipo de la enfermedad o la respuesta al tratamiento.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera perfiles estandarizados y cuantitativos del repertorio inmune adecuados para la estandarización de ensayos y la evaluación de la reproducibilidad.
- Valor operativo: Permite la preparación de sistemas biológicos validados a partir de sangre y tejido para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Valor técnico: Produce métricas de clonalidad y diversidad que sirven como lecturas confiables para campañas de cribado de compuestos o productos biológicos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor Translacional: Mantiene la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el seguimiento de la dinámica clonal en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita la identificación de clones compartidos o expandidos entre pacientes, apoyando el descubrimiento traslacional de biomarcadores en trastornos inmunitarios.
- Avance Ajustado al Riesgo: Informa las decisiones de continuar o no continuar al revelar diferencias en el uso de genes VDJ y patrones de expansión clonal asociados con la fisiopatología.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana de dianas hasta la identificación de compuestos líder y los estudios preclínicos, especialmente en las líneas de investigación en inmunología e inmuno-oncología, donde es fundamental reducir los riesgos asociados con los mecanismos inmunitarios.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al revelar la selección y expansión clonal impulsadas por antígenos en los compartimentos de linfocitos T y B.
- Secuenciación: Permite la preparación estandarizada de bibliotecas y la secuenciación de repertorios de TCR e IGH a partir de ADN aislado, facilitando la disponibilidad de ensayos.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos que incluyen clonalidad, uso de familias génicas (V, D, J) y seguimiento de clones únicos para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traslacional: Se conecta con la continuidad preclínica al permitir el seguimiento longitudinal de clones inmunitarios en compartimentos sanguíneos y tisulares.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad de plataforma reutilizable, aplicable en múltiples áreas de enfermedades y tipos de muestras tras la adaptación del protocolo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas mediada por el sistema inmunitario mediante la medición directa de la dinámica del repertorio.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante procedimientos controlados de aislamiento de ADN, preparación de bibliotecas y flujos de trabajo de NGS.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la identificación temprana de clones inmunológicamente activos, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al vincular los cambios en el repertorio inmunitario con los mecanismos de la enfermedad y la intervención terapéutica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en inmunogenómica, preparación de bibliotecas de secuenciación de nueva generación (NGS) y análisis bioinformático de datos del repertorio inmune.
- Depende del acceso a secuenciadores de NGS, sistemas de purificación basados en perlas magnéticas y entornos laboratoriales controlados para el manejo de ADN.
- Necesita estandarización entre equipos de inmunología, genómica y ciencia de datos para un análisis consistente del repertorio.
- Requiere adaptación de los protocolos de digestión de tejidos para órganos no intestinales, manteniendo el rendimiento y la integridad del ADN.
- Las limitaciones prácticas incluyen los requisitos de cantidad de ADN de entrada y el posible sesgo introducido por la amplificación por PCR durante la preparación de la biblioteca.
