基于载体辅助的一锅法小量人源细胞靶向蛋白质组学样品制备

摘要

一种基于蛋白质载体辅助的“一锅法”样品制备方法，结合液相色谱（LC）-选择反应监测（SRM），称为cLC-SRM，是用于少量细胞（包括单个细胞）多重靶向蛋白质组学分析的便捷方法。该方法利用过量外源蛋白质作为载体，并结合高特异性的LC-SRM实现靶向定量。

摘要

对少量人类细胞进行蛋白质分析主要依赖基于抗体的免疫测定法实现靶向蛋白质组学，但该方法存在固有局限性（例如多重检测能力低，且缺乏针对新蛋白质的可用抗体）。基于质谱（MS）的靶向蛋白质组学作为一种替代方法应运而生，因其无需抗体、具有高重数、高特异性和高定量准确性。近年来质谱仪器的进步使得基于质谱的靶向蛋白质组学能够实现对单个细胞中高丰度蛋白质的多重定量。然而，在进行质谱分析时，如何有效处理单细胞并最大限度减少样品损失仍存在技术挑战。为解决这一问题，我们近期开发了一种便捷的蛋白质载体辅助“一锅法”样品制备方法，并结合液相色谱（LC）-选择反应监测（SRM），称为cLC-SRM，用于少量人类细胞的靶向蛋白质组学分析。该方法利用过量外源蛋白质作为载体，结合低体积“一锅法”处理，显著减少表面吸附损失；同时采用高特异性LC-SRM，有效应对因添加外源载体蛋白而增大的动态浓度范围。该方法已成功实现对少量细胞（例如10–100个细胞）中中等丰度蛋白质以及单个细胞中高丰度蛋白质的准确定量。该方法易于实施，且无需专用设备，因此大多数蛋白质组学实验室均可快速采用。本文提供了cLC-SRM分析少量人类细胞的详细实验方案，包括细胞分选、细胞裂解与消化、LC-SRM分析及数据分析。未来仍需进一步提升检测灵敏度和样品通量，以推动靶向单细胞蛋白质组学的发展。我们预期cLC-SRM将在生物医学研究和系统生物学中得到广泛应用，并有望促进精准医学的发展。

引言

基因组学（转录组学）领域的近期技术进步使得能够在单细胞水平上对基因组（转录组）进行全面而精确的分析^1,2,3。然而，单细胞蛋白质组学技术的发展远远落后于基因组学（转录组学）技术，但其重要性与后者相当^4,5,6,7,8。此外，蛋白质丰度并不能必然从mRNA丰度推断得出⁹，且蛋白质组比转录组更为复杂和动态¹⁰。鉴于这些挑战，目前通常使用大量混合的细胞群体（即群体细胞）来生成全面的蛋白质组数据^11,12,13。然而，此类群体测量会平均化单个细胞之间的随机变异，从而掩盖了重要的细胞间差异性（即细胞异质性）⁴....

方案

注意：逐步的 cLC-SRM 分析见图1。

1. PCR 管的预处理

1. 向 PCR 管中加入 100 µL 非人类来源（例如 Shewanella oneidensis）的细胞裂解物消化液，浓度为 0.2 µg/µL。在室温下孵育过夜，以包被 PCR 管表面。
2. 用移液器吸除细胞裂解物消化液，用 HPLC 级水清洗 PCR 管 3 次，然后在通风橱中将 PCR 管自然晾干。
3. 将包被后的 PCR 管储存于 4 ˚C 冰箱中，待后续使用。

2. FACS 分选

1. 使用可被激光激发的荧光染料标记的荧光微球，将荧光激活细胞分选仪（FACS）（参见材料表）校准至96孔PCR板中，以提供可靠的参考信号。
2. 确认FACS仪器能够准确地将细胞分选至PCR板孔的底部。
   1. 将分选液流角度设置为尽可能小，以最大化细胞落入孔底的成功率，避免细胞撞击孔壁。
   2. 通过测试液流将PBS缓冲液液滴（例如100个液滴）“分选”到空板的孔中，以确认收集的液滴位于孔底。如果液滴未落在正确位置，需重新校准细胞分选仪，并重复操作，直至分选液流中的液滴被正确收集。
3. 将包被好的PCR管放入9....

结果

首先使用少量 MCF7 细胞裂解液（0.5–20 ng，相当于 5–200 个细胞），通过靶向定量 EGFR/MAPK 信号通路蛋白来评估 cLC-SRM 的性能，因为与通过 FACS 分选的少量细胞相比，细胞裂解液更加均一且变异较小。如图 2A所示，XIC 结果清晰显示了来源于每个 MCF7 细胞约含有 220,000 个拷贝的 GRB2 蛋白的肽段 ATADDELSFK 的 SRM 转化信号³⁴。cLC-SRM 能够对低至相当于 5 个 MCF7 细胞的内源性 ATADDELSFK 进行可重复定量，信噪比（S/N）为 14，定量灵敏度约为 1,800 zmol。所得校准曲线表现出优异的线性关系，高丰度的 GRB2 蛋白的定量下限（LOQ）为 5 个细胞，中等丰度的 PTPN11 蛋白为 20 个细胞（图 2B）。所有数据点中各目标肽段的 SRM 技术变异系数（CV）中位数约为 9%，与标准 LC-SRM.......

讨论

cLC-SRM 是一种便捷的靶向蛋白质组学方法，可实现对少量细胞（包括单个细胞）的准确多重蛋白质分析。该方法利用蛋白质载体辅助的“一步式”样品制备流程，其中细胞收集、多步细胞裂解与消化以及肽段消化产物转移至毛细管液相色谱柱进行质谱分析等所有步骤均在一个容器（例如单个管或单个孔）中完成（图1）。这种“一体化”的低体积单管处理方式通过显著减少可能的表面吸附损失，有效提高了少量细胞在靶向蛋白质组学分析中的回收率。

cLC-SRM 分析有两个关键步骤：1）在 FACS 分选后，必须立即进行离心，以确保收集的细胞位于管底或孔板底部，因为处理少量细胞时所用体积较小（约 15 µL）；2）在加入胰蛋白酶进行消化前，需将 TFE 浓度降低至 ≤10%，以实现有效的消化。为避免样品干燥导致不可逆的损失，建议在 SpeedVac 浓缩过程中频繁检查样品体积（剩余体积约 4 µL）。通过省略还原和烷基化步骤，可进一步简化“一步法”样品制备流程，且对消化效率的影响可忽略不计。但其缺点是无法选择含半胱氨酸的肽段作为目标蛋白的替代肽段。为避免使用 S.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mL 玻璃液相色谱小瓶	Microsolv	9502S-WCV	用于盛装 PCR 管以进行自动进样
BSA	Sigma-Aldrich	P0834-10×1mL	载体蛋白，可显著减少表面吸附损失
DTT	Thermo Scientific	A39255	还原反应试剂
甲酸	Thermo Scientific	28905	用于终止酶反应的试剂
IAA	Thermo Scientific	A39271	烷基化试剂
肽段内标物	New England Peptide		用于 EGFR/MAPK 通路蛋白的靶向定量
RT-PCR 管	GeneMate Bioexpress	T-3035-1	0.2 mL PCR 管，用于单管样品制备
Skyline 软件	华盛顿大学		公开可用的 SRM 数据分析软件
超声破碎仪	Hielscher 超声技术公司	UTR200	冰上超声处理以实现细胞裂解
真空离心浓缩仪	Thermo Scientific		降低 TFE 比例以实现有效的胰蛋白酶消化
TFE	Sigma-Aldrich	18370-10×1mL	60% TFE 用于细胞裂解
带加热盖的热循环仪	Peltier Thermal Cycler	PTC-200	用于蛋白质变性的加热装置
Trypsin Gold	Promega	V528A	用于蛋白质消化的酶
Waters BEH C18 色谱柱	Waters		用于肽段分离的 C18 色谱柱