El cultivo de una epidermis humana reconstruida tridimensional a gran escala

El modelo de epidermis humana in vitro o construida se desarrolló por primera vez en los años noventa con el objetivo principal de desarrollar métodos de prueba alternativos a la experimentación con animales. Esos modelos epidérmicos 3D ahora se utilizan comúnmente para probar tanto la seguridad como la eficacia de los ingredientes cosméticos. Mientras que se puede comprar a varios proveedores de tejidos, poder reconstituir un modelo 3D en un laboratorio da más flexibilidad al punto final de interés.

Hay varios artículos de investigación que describen brevemente el protocolo de reconstitución de un modelo epidérmico 3D, pero hasta la fecha no había ningún video disponible que mostrara los pasos críticos del proceso de reconstitución. Esta es la razón detrás de la publicación de este documento de vídeo. La preparación de la epidermis humana reconstruida internamente permite mucha libertad en el proceso de cultivo, como cambios en la composición del medio de cultivo, desencadenantes de estrés proinflamatorio u oxidativo, silenciamiento de genes de interés y la inhibición o estimulación de ciertos procesos biológicos.

Para comenzar, descongele un vial con 1 millón de queratinocitos epidérmicos humanos normales crioconservadores, o NHEKs, en un baño de agua a 37 grados Celsius sumergiendo parte del vial en agua. Incubar el vial durante uno o dos minutos en el baño de agua, hasta que solo sea visible una pequeña astilla de hielo. Resuspend las células muy cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces.

Transfiera la suspensión celular en dos frascos T75 que contengan un total de 15 mililitros de medio de descongelación pre-advertido, lo que resulta en una densidad de siembra de 6,7 veces 10 a las cuartas celdas por centímetro cuadrado. Prellene 24 placas de pocillos con 1,5 mililitros de medio sumergido, idealmente utilizando una pipeta dispensadora. Después de cultivar las células al 80% de confluencia, están listas para la siembra en inserciones para el cultivo de epidermis humana reconstruida, o RHEs.

Retire el medio basal de los matraces T75 con los NHEKs. Enjuague las células agregando cinco mililitros de PBS precalentado a cada matraz T75 y, a continuación, retire el PBS de los matrazes. Agregue de dos a tres mililitros de EDTA de tripsina-EDTA precalentado al 0,05% a cada matraz, asegurándose de que la solución de tripsina esté distribuida equitativamente en el área de cultivo celular del matraz.

Coloque los frascos en la incubadora de cultivos celulares durante cuatro minutos, luego verifique si las células se desprenden usando el microscopio a un aumento de 10 X. Rap el matraz para ayudar a las células a liberarse de la superficie del matraz. Una vez que todas las células estén separadas, agregue un volumen igual de inhibidor de tripsina precalentado a cada matraz T75 y transfiera la suspensión celular de los frascos a un tubo de centrífuga.

Enjuague los frascos con cinco mililitros de PBS precalentado y transfiéndalo al tubo de la centrífuga que contiene la suspensión celular. Centrifugar las células cosechadas a 400 veces G durante cinco minutos. Deseche cuidadosamente la mayor parte del sobrenadante dejando aproximadamente de 100 a 200 microlitros en el tubo.

Mueva suavemente el tubo con los dedos para aflojar cuidadosamente el pellet. Resuspend suavemente el pellet de células en un volumen bajo de medio sumergido, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 a 10 veces para asegurar una suspensión celular uniforme. Comience con un volumen bajo para evitar la formación de agregados celulares y sume hasta un mililitro de medio sumergido por matraz T75 inicial.

Cuente las celdas de la suspensión utilizando el método de exclusión de tripano azul. Diluir la suspensión celular con medio sumergido adicional para alcanzar una concentración de 3.525 veces 10 a las quintas células por mililitro, utilizando la primera ecuación proporcionada en el manuscrito del texto. Realice un segundo recuento de celdas de la solución diluida y utilice la segunda ecuación en el manuscrito de texto para calcular el volumen de suspensión celular que se sembrará en el inserto de cultivo.

Cuelgue las inserciones de cultivo de 24 pocillos en la posición más alta de la placa portadora y transfiera la placa portadora a la placa de 24 pocillos prellenada con medio sumergido. Agregue el volumen determinado de la suspensión celular a cada inserto, teniendo cuidado de no tocar el inserto. Después de la siembra, incube las placas de 24 pocillos durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente para superar un efecto de borde.

No mueva las placas durante este tiempo. Transfiera las placas a la incubadora de cultivos celulares y déjelas en condiciones sumergidas durante tres días. Después de una incubación de tres días en la incubadora de cultivo celular, exponga las células que se han adherido a la superficie de la membrana a la interfaz de líquido de aire, o ALI, eliminando el medio sumergido del compartimento apical con un sistema de aspiración y una pipeta Pasteur de vidrio.

Llene las nuevas placas de 24 pocillos con 1,5 mililitros de medio ALI precalentado fresco, y transfiera las placas portadoras con las inserciones de cultivo a las nuevas placas de múltiples pozos. Transfiera las placas de múltiples pozos de vuelta a la incubadora de cultivos celulares. Actualice el medio ALI cada dos o tres días, durante 14 días.

Los queratinocitos en cultivo 2D muestran una morfología tradicional con una forma poligonal consistente. Después de 15 días en ALI, la epidermis humana reconstruida forma un tejido completamente estratificado, que es indicado por sus cuatro capas epidérmicas principales. El análisis ultraestructural de la epidermis humana reconstruida en diversos puntos del tiempo en el protocolo de la reconstitución revela el proceso de la cornificación, con un número creciente de capas del sitio de la córnea en un plazo dado.

Los queratinocitos en la epidermis muestran diferentes perfiles de expresión de proteínas según su etapa de diferenciación. La expresión de involucrina aparece más predominantemente en la capa SG, mientras que la expresión de filaggrina y loricrina se encuentra en las capas superiores. La expresión de queratina-10 se encontró en todas las capas viables a excepción de la capa SB.

La epidermis humana reconstruida exhibe uniones desmosómicas funcionales, según lo indicado por la expresión de Desmoglein-1 en el espacio intercelular de las capas epidérmicas viables. Las propiedades de la barrera del modelo reconstruido de la epidermis fueron investigadas evaluando la viabilidad del tejido sobre el tratamiento tópico con un disruptor sabido de la barrera, y evaluando la integridad del tejido. La integridad tisular se determinó después de 15 días midiendo el TEER con un voltímetro.

La sensibilidad de la epidermis al lipopolisacárido y a la alfa del factor de necrosis de tumor fue investigada. Los tratamientos alfa de los LPS y de TNF eran no tóxicos. en relación con el control Triton X-100.

El lanzamiento de la alfa Interleukin-1 y de Interleukin-8 en el medio rhe fue cuantificado usando lisis de IL. El tratamiento de los LPS dio lugar a una para arriba-regulación estadístico significativa en el lanzamiento de la alfa Interleukin-1 y de Interleukin-8. El tratamiento alfa de TNF dio lugar a una para arriba-regulación estadístico significativa en solamente el lanzamiento de la alfa Interleukin-1.

Sin embargo, una tendencia clara de los niveles crecientes Interleukin-8 también fue observada sobre el estímulo con la alfa de TNF. Siguiendo este protocolo, TEER se puede medir como un valor para la integridad de la barrera. La viabilidad o citotoxicidad se puede medir mediante un ensayo MTT o LDH, por ejemplo.

El sobrenadante se puede utilizar para medir la secreción de citoquinas u otras proteínas. Además, el tejido se puede utilizar para estudiar la expresión de proteínas o genes de interés.