Name: 大规模培育三维重建人类表皮 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习利用正常人表皮角质形成细胞在气液界面培养15天，构建完全分层的三维重建人类表皮模型。该方法可用于化妆品安全性测试及炎症反应研究，为替代动物实验提供可靠方案。

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本研究由玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议编号为765602的欧盟“地平线2020”研究与创新计划资助。所有作者感谢阿道夫·默克尔基金会、费拉拉大学&#160;以及陶氏有机硅比利时公司提供的支持。感谢Miguel Spuch-Calvar博士协助制备RhE培养过程的示意图。作者谨此感谢Barbara Drasler博士、Franco Cervellati博士和Agnès Tessier博士在技术方面提供的支持与讨论。

在规划和实施涉及本方案的任何研究活动之前，请审查并遵守与使用人体组织或细胞相关的国家和国际伦理准则和条件。 
注意：本方案的所有步骤必须在无菌条件下进行。培养重组人表皮等效物（RhEs）的最低要求是采取生物安全二级（Biosafety Level 2）操作规范。在操作本方案中所述的化学品/试剂时，必须采取所有必要的安全防护措施。
1. 细胞培养基的制备
注意：培养重组人表皮（RhEs）使用三种不同类型的无血清培养基（表1）：（i）用于NHEKs二维培养的低钙水平（60 µM Ca2+）基础培养基；（ii）用于将NHEKs接种至细胞培养插件系统的高钙水平（1.5 mM Ca2+）浸没式培养基；以及（iii）含有高钙水平（1.5 mM Ca2+）、抗坏血酸和角质形成细胞生长因子（KGF）的气液界面（ALI）培养基。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>培养基</td>
			<td>培养基信息</td>
			<td>所需用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">基础培养基</td>
			<td>角质形成细胞生长培养基</td>
			<td rowspan="3">36 mL/24孔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ 1 % [v/v] 100x 抗生素-抗真菌剂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">浸没式培养基</td>
			<td>角质形成细胞生长培养基</td>
			<td rowspan="4">36 mL/24孔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ 1 % [v/v] 100x 抗生素-抗真菌剂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ 1.5 mM Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">气液界面培养基</td>
			<td>角质形成细胞生长培养基</td>
			<td rowspan="6">216 mL/24孔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ 1 % [v/v] 100x 抗生素-抗真菌剂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ 1.5 mM Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ 50 µg/mL 抗坏血酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+ 10 ng/mL 角质形成细胞生长因子</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于培养重组表皮（RhEs）的不同培养基的汇总表。含补充物的不同培养基列表。
<ol>
	<li>配制基础培养基。
	<ol>
		<li>向一瓶500 mL的角质形成细胞生长培养基（材料表）中加入5 mL人角质形成细胞生长添加剂（HKGS），使终浓度达到0.2% [v/v] 牛垂体提取物（BPE）、0.2 ng/mL 人重组表皮生长因子（EGF）、0.18 µg/mL 氢化可的松、5 µg/mL 牛转铁蛋白，以及0.01 µg/mL 人重组胰岛素样生长因子-I（IGF-I）。</li>
		<li>加入5 mL 100倍抗生素-抗真菌溶液，其中含有10,000 单位/mL 青霉素、10,000 µg/mL 链霉素和25 µg/mL 两性霉素B。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制浸没培养基。
	<ol>
		<li>向一瓶500 mL的角质形成细胞生长培养基（材料表）中加入5 mL HKGS，使终浓度达到0.2% [v/v] BPE、0.2 ng/mL 人重组EGF、0.18 µg/mL 氢化可的松、5 µg/mL 牛转铁蛋白，以及0.01 µg/mL 人重组IGF-I。</li>
		<li>加入5 mL 100倍抗生素-抗真菌溶液。</li>
		<li>加入5 mL 0.144 M CaCl2（氯化钙）储备液，使Ca2+终浓度达到1.5 mM。 
		注：在浸没培养阶段即提高钙离子浓度，以促进角质形成细胞的分化并启动分层过程49。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制气液界面（ALI）培养基。
	<ol>
		<li>向一瓶500 mL的角质形成细胞生长培养基（材料表）中加入5 mL HKGS，使终浓度达到0.2% [v/v] BPE、0.2 ng/mL 人重组EGF、0.18 µg/mL 氢化可的松、5 µg/mL 牛转铁蛋白，以及0.01 µg/mL 人重组IGF-I。</li>
		<li>加入5 mL 100倍抗生素-抗真菌溶液。</li>
		<li>加入5 mL 0.144 M CaCl2储备液，使Ca2+终浓度达到1.5 mM。</li>
		<li>加入1 mL 25 mg/mL 抗坏血酸储备液，使抗坏血酸终浓度达到50 µg/mL。</li>
		<li>加入50 µL 含100 µg/mL KGF、1% [w/v] 牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液（PBS）的储备液，使KGF终浓度达到10 ng/mL。 
		注：由于抗坏血酸易被氧化，建议使用稳定的抗坏血酸衍生物，例如镁-L-抗坏血酸-2-磷酸盐59或L-抗坏血酸2-磷酸三镁60。若使用抗坏血酸，建议每次更换培养基前新鲜添加。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 正常人表皮角质形成细胞的培养
注意：由于原代人角质形成细胞在第四或第五代时仍保持增殖能力61，因此使用第三代的正常人表皮角质形成细胞（NHEKs）进行重组人表皮（RhEs）的培养。原代角质形成细胞具有高度敏感性，操作时应格外小心。在任何操作过程中，对细胞悬液进行轻柔且缓慢的移液至关重要，以避免影响细胞状态。
<ol>
	<li>将一支含有 1 × 106 个冻存 NHEK 的冻存管置于 37 °C 水浴中解冻，仅将冻存管部分浸入水中。在水浴中孵育 1–2 分钟，直至仅剩少量冰晶可见。 
	注意：切勿将整支冻存管完全浸入水浴，以避免污染。解冻时间不得超过 2 分钟，否则会降低细胞活力。在将冻存管转移至超净台前，须用 70% 乙醇溶液擦拭管壁。</li>
	<li>通过移液器轻柔吹打 2–3 次，将细胞充分重悬。将细胞悬液转移至两个 T75 培养瓶中，培养瓶中共含有 15 mL 预热的解冻培养基，最终接种密度为 6.7 × 104 个细胞/cm2。 
	注意：在前两次传代及冻存 NHEK 解冻过程中，细胞培养基的使用应遵循供应商的推荐方案。</li>
	<li>将培养瓶放入细胞培养箱中（37 °C、5% CO2、95% 相对湿度（RH））。</li>
	<li>约 24 小时后，用基础培养基替换解冻培养基，以去除角质形成细胞冻存液中的二甲基亚砜（DMSO）。</li>
	<li>每两天更换一次基础培养基。</li>
	<li>培养 4–6 天后，细胞应达到约 80% 汇合度，可准备用于 RhE 构建物的接种。 
	​注意：角质形成细胞的培养汇合度不应超过 80%，以维持其增殖能力62。解冻细胞的数量需综合考虑多个参数，包括细胞代数、解冻后的细胞活力、接种效率以及倍增时间。</li>
</ol>
3. NHEK 的接种
注意：本方案设计用于24孔载体板格式。如果需要其他板格式（例如12孔或6孔格式），应考虑对接种密度和培养基体积进行优化。图1总结了RhE培养的建议时间线，并展示了培养条件。
<img alt="角质形成细胞分化示意图；细胞培养过程、气液界面、培养基更换。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：重建实验方案的示意图时间线。 展示了RhE模型的制备、培养过程及应用（化学物质暴露）。该示意图包含了各步骤所适用的细胞培养基类型。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>使用分液移液器将 1.5 mL 浸没培养基预先加入 24 孔板中。</li>
	<li>从用于培养NHEKs的T75培养瓶中移除基础培养基。</li>
	<li>向每个 T75 培养瓶中加入 5 mL 预热的 PBS 以洗涤细胞。</li>
	<li>从培养瓶中移除 PBS。 
	注意：此步骤至关重要，因为培养基中含有会抑制胰蛋白酶活性的蛋白质和钙。</li>
	<li>向每个T75培养瓶中加入2-3 mL预热的0.05% [v/v] 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。确保胰蛋白酶溶液均匀覆盖培养瓶的细胞培养区域。 
	注意：2 mL 体积基于上述提及的 80% 汇合度。对于汇合度更高的培养瓶，请使用 3 mL。</li>
	<li>将烧瓶置于细胞培养箱中孵育4分钟（37 °C，5% CO2，以及95% RH）。在10倍显微镜下观察细胞是否脱落。轻拍培养瓶底部，使其与手掌接触，以帮助细胞从培养瓶表面脱落。脱落的细胞在胰蛋白酶溶液中呈圆形悬浮状态，可被观察到。 
	注意：细胞在胰蛋白酶中孵育时间不得超过6分钟。过度消化会损伤细胞并降低其贴壁能力。63.</li>
	<li>待所有细胞脱落后，向每个T75培养瓶中加入等体积（即2-3 mL）预热的胰蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>将细胞悬液从培养瓶转移至离心管中。</li>
	<li>用5 mL预热的PBS冲洗烧瓶，并将PBS转移至含有细胞悬液的离心管中。 
	注意：在显微镜下检查培养瓶中残留细胞的数量，以确保大部分细胞已被收集。培养瓶表面应有95%以上为空。若未达到此标准，可重复胰酶消化步骤（3.3–3.9）。但需注意，应尽量避免再次进行胰酶消化。</li>
	<li>将收获的细胞在400 × g离心 x g 5 分钟。</li>
	<li>小心弃去大部分上清液，留下约100-200 µL 在管中。 
	注意：此操作过程中切勿吸出沉淀物. </li>
	<li>轻轻将细胞沉淀重悬于少量浸没培养基中，用移液器上下吹打5-10次，以确保形成均匀的细胞悬液。起始体积应较小（即 500 µL以避免细胞团块的形成，每初始一个 T75 培养瓶最多共加入 1 mL 浸没培养基。 
	注意：用手指轻轻弹击离心管，以小心地将部分细胞沉淀溶解于上清液中。</li>
	<li>使用台盼蓝排斥法对悬浮液中的细胞进行计数。
	<ol>
		<li>将0.4% [v/v]台盼蓝染色液与细胞悬液按1:1比例混合稀释，通过加入 10 µL 0.4% [v/v] 台盼蓝染色剂 10 µL 细胞悬液。加入 10 µL 将溶液加入计数板。在细胞悬液与台盼蓝混合后立即测定细胞数量，因为台盼蓝在作用时间超过1分钟后会开始降低细胞活力。65. 
		警告：台盼蓝被证实具有潜在的致突变性、致癌性和致畸性64小心操作染料，并根据当地实验室规定安全处理废弃物。 
		注意：替代台盼蓝的一种方法是使用无毒染料伊红B66.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用额外的淹没培养基稀释细胞悬液，使其浓度达到 3.525 x 105 细胞/mL，通过加入体积 V 的浸没培养基2 如公式1所示： 
	<img alt="化学稀释方程：V2 = C1 × (V1/C2) - V1；公式，浓度计算。" src="/files/ftp_upload/61802/61802eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
	C1 = 3.12 步骤获得的细胞悬液中的细胞浓度（cells/mL） 
	V1 = 用于重悬 3.12 中细胞沉淀的体积（mL） 
	C2 = 悬液中目标细胞浓度（即，3.525 × 105 cells/mL 
	V2 = 需加入以达到目标细胞浓度的体积（mL） 
	注意：推荐使用的培养小室的表面积为 0.47 cm²2；因此，相应的接种密度为 3.75 x 105 细胞/厘米²2.</li>
	<li>进行第二次细胞计数（C3) 步骤 3.14 所得稀释液的体积。使用公式 2 计算细胞悬液的体积（V4) 接种至培养插件中的细胞数量： 
	<img alt="电压分压公式 V4=C3*(V3/C4)；用于电路分析研究。" src="/files/ftp_upload/61802/61902eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"> 
	C3 = 悬液中目标细胞浓度（即 3.525 × 105 细胞/mL 
	V3 = 需接种至培养插件中的细胞悬液的目标体积（即 0.5 mL） 
	C4 = 步骤 3.14 中获得的稀释悬液的计数细胞浓度（cells/mL） 
	V4 = 需接种至培养插件中的细胞悬液实际体积（mL）</li>
	<li>将24个细胞培养小室悬挂于推荐的载体板最高位置，并将载体板转移至预先加入浸没培养基的24孔板中（参见3.1）。 
	注意：将载体板转移至多孔板时，应确保插入物膜与基底室培养基之间无气泡滞留，否则会影响细胞供能，最终损害重组人上皮组织（RhE）的活性与形态。</li>
	<li>加入已确定的体积 V4 （根据公式2）将细胞悬液加入每个插入式培养小室中。 
	注意：建议使用反向移液技术，以准确地将细胞悬液分配至培养小室中。 
	注意：将细胞悬液加入培养插件时，务必避免损伤膜。建议沿插件系统的壁 dispensing 细胞悬液，不要接触膜表面，以作预防。</li>
	<li>接种后，将24孔板在室温下孵育10–15分钟，以消除边缘效应（即所有孔之间温度分布不均）67）。在此期间不要移动培养板。</li>
	<li>将培养板转移至细胞培养箱（37 °C，5% CO₂2，以及95% RH）。细胞在浸没条件下培养三天。 
	注意：为避免组织差异，接种后切勿将培养板在培养箱中叠放，以确保每个插入式培养小室受热均匀。三天后（即气液界面培养期间），可进行培养板的叠放。</li>
</ol>
4. 气液界面培养
<ol>
	<li>在细胞培养箱（37 °C，5% CO2，95% 相对湿度）中孵育三天后，通过使用抽吸系统和玻璃巴斯德吸管，从顶端腔室移除浸没的培养基，使已贴附于膜表面的细胞暴露于气液界面（ALI）。
	 
	注：也可使用手动移液器移除顶端腔室中的浸没培养基。</li>
	<li>在新的24孔板中加入1.5 mL新鲜预热的ALI培养基，并将带有培养插件的载体板转移至新的多孔板中。</li>
	<li>将多孔板重新放回细胞培养箱（37 °C，5% CO2，95% 相对湿度）中。</li>
	<li>每2–3天更换一次ALI培养基，持续14天。</li>
	<li>更换培养基分为两个步骤进行：1）准备一块新板，每孔加入1.5 mL新鲜预热的ALI培养基；2）将载体板转移至新板中。
	 
	警告：在整个重建过程中，最好不打开覆盖载体板的盖子，以保护重建的人类表皮（RhEs）免受潜在污染。
	 
	注：ALI阶段对于构建分层表皮模型至关重要，因为它可促进角质形成细胞的终末分化68。进入ALI阶段后，需对插件进行目视检查，以判断是否存在“渗漏组织”：即从基底外侧腔室渗出并积聚在组织表面的培养基液滴。若在ALI第3天出现渗漏，应轻柔地从培养插件中移除液体，避免接触组织表面。若渗漏持续存在，建议弃用该渗漏组织，因其表明RhE模型未能形成正确的屏障结构。</li>
	<li>在重建过程结束时，可对组织施加多种应激刺激，以诱导氧化应激或炎症等反应。同时，也可用化学化合物或化妆品成分进行处理。注：在施加刺激/处理期间，组织通常从ALI第14天起维持在浸没培养基中。若预期需进行较长时间的暴露/处理（例如48–72小时），建议：(i) 在ALI培养早期（如第7–9天）开始暴露/处理，以避免活性层变薄和角质层增厚；(ii) 使用ALI培养基孵育组织，以持续促进细胞增殖。</li>
	<li>对于RhE组织的收获，应在目标时间点收集组织和细胞培养基，用于组织学分析、活力检测、蛋白质/RNA提取以及酶联免疫吸附测定（ELISAs）。</li>
</ol>

Marc Eeman 和 Benedetta Petracca 为道康宁比利时公司的员工。其余所有作者均无利益冲突披露。

重建的人类表皮（RhEs）被广泛用作制药和皮肤化妆品领域的筛选工具36, 75,76,77,78。尽管已有数家公司提供商业化的RhEs产品，但其成本仍然较高，且限制了根据新研究问题调整培养参数的可能性&#160;。本文以稳健且可靠的方式描述了实验室自制RhEs的制备流程，并对所获得的组织进行了详细表征，以验证该模型作为动物实验替代方法的相关性。
方案中的某些步骤对于确保正确操作至关重要&#160;角质形成细胞&#160;分化及重建人表皮（RhE）模型的可重复性。这可通过选用最优的细胞、培养基类型及培养条件来实现。在本研究所提出的RhE模型中，选择新生儿原代人表皮角质形成细胞（NHEKs），因其相较于成人NHEKs具有较少的抗原暴露史。此外，角质形成细胞限定为高加索人种，以避免种族间的差异性。通常采用原代角质形成细胞，因其具备良好的分化与多层化能力。79可从商业渠道购买，或通过实验室自行从成人皮肤中分离获得80在聚碳酸酯膜上培养细胞系（如HaCaT）时，细胞无法正常分化，并表现出合成屏障形成所必需脂质的能力受损。81然而，通过引入不同的培养基质，如水凝胶、胶原蛋白、纤维蛋白以及类球体培养，成功构建了三维皮肤模型。78,82,83,84,85,86已证明，永生化细胞系 N/TERT 适用于重建表皮（RhE）的构建35原代角质形成细胞在第四或第五次传代后仍保持增殖能力61，因此本方案包含使用&#160;处于第三代传代的角质形成细胞。De Vuyst 等人已证明，细胞接种密度至关重要，必须足够高（即 ≥ 2.5×10⁴ 细胞/cm²）。5 细胞/厘米²2) 以确保基底外侧腔室的培养基不会扩散至顶端腔室。接种密度过低（即 &#60; 2.5×105 细胞/厘米²2可能导致无法形成适当的屏障，表现为培养基从基底外侧向顶侧室扩散，从而造成培养条件为浸没式而非气液界面（ALI）培养条件62无血清角质形成细胞生长培养基&#160;（参见 材料表出于可重复性的考虑，优选使用化学成分明确的培养基，因其具有降低污染风险的优势。该培养基的钙离子浓度较低（即60 µM），可促进角质形成细胞的增殖87. 在RhE培养的第一步中提高钙离子浓度（即1.5 mM）可促进&#160;角质形成细胞分化、皮肤屏障形成与稳态49此外，气液界面培养基中添加了抗坏血酸，该成分已被证明对角质层脂质的形成至关重要，并可促进细胞分化。52,53,54ALI 培养基还含有 KGF，这是一种由成纤维细胞分泌的生长因子，可与角质形成细胞的跨膜受体结合；在受体激活后，KGF 在细胞分化和伤口修复过程中发挥双重作用。55, 88定期更换气液界面培养基对于为重建人表皮（RhEs）持续提供新鲜营养至关重要。使用载体板系统对于大规模培养RhEs（例如，每板24个插入物）尤为关键，其优势在于节省时间、降低污染风险，并减少人为操作误差的发生。该系统还支持在较大体积的培养基中（例如，1.5 mL）进行RhEs培养，从而减少气液界面培养基的更换频率。此外，该系统允许将整板插入物整体转移至含有新鲜培养基的板中，避免对单个插入物进行直接接触或频繁开启培养板盖。
RhE 模型存在若干局限性，需加以注意。在天然人体皮肤中，基底层角质形成细胞的增殖与角质层角质细胞的脱落（即脱屑）之间存在动态平衡89。然而，在体外培养条件下，脱屑过程不会发生，因此角质细胞持续附着于 RhE 上，形成较厚的角质层，其生理相关性较低。因此，RhE 的培养时间受到限制。此外，该 RhE 模型较为简单，仅包含单一细胞类型，即角质形成细胞，尽管这是表皮中最丰富的细胞类型。但表皮中还存在其他细胞类型，如黑素细胞、树突状细胞（即朗格汉斯细胞）、T 细胞（如 CD8+ 细胞）以及默克尔细胞13。为提高皮肤模型的生理相关性，研究人员已通过引入黑素细胞38、免疫细胞39或患者来源的细胞90，构建了更为复杂的皮肤模型。应注意到，由于角质层脂质组成不同以及屏障通透性更高，人体皮肤模型的屏障特性与天然人体皮肤存在差异91,92,93,94,95。然而，已有若干研究报道&#160;，通过在低氧条件下培养96或降低相对湿度97、使用壳聚糖调节真皮基质98，以及改变培养基中的游离脂肪酸含量99，可改善人体皮肤模型的屏障特性。此外，在简单或更复杂的 RhE 模型中，可通过调节培养条件和培养基成分，以模拟病理状态。通过向模型施加细胞因子，可诱导出异常的组织形态100以及基因和蛋白表达水平的改变，这些特征常见于特应性皮炎和银屑病等皮肤疾病35, 101,102,103,104,105。在启动三维模型重建过程前，对角质形成细胞中的特定基因进行沉默&#160;，是模拟皮肤疾病特征并探索新治疗策略的另一种方法106, 107。除了仅构建表皮层外，还可通过在 RhE 重建前将成纤维细胞包埋于胶原基质中，构建包含真皮层的模型（即人皮肤等效物或全层皮肤模型），从而提高其生理相关性，适用于皮肤老化和伤口愈合相关研究108,109,110。此外，已有研究将肿瘤类球体加入人皮肤等效物中，用于研究黑色素瘤的进展111, 112。皮肤模型领域的最新进展包括生物打印和“芯片上皮肤”技术。多个研究团队近期已成功开发出（可灌注的）生物打印皮肤等效物45, 113, 114。本方案采用 24 孔板和载体板设计，避免了对插入物的单独操作。然而，研究规模仍较为有限，且缺乏自动化。通过引入生物打印或“芯片上皮肤”技术，可实现更小尺寸皮肤模型的高通量、自动化培养。
本方案中描述的重建人表皮（RhE）与已开发且特征明确的商业化表皮模型具有多种相似性。形态学分析表明，尽管所提出的RhE模型中存活细胞层数较天然人皮肤少（即6-7层对比7-14层），但其与EpiDerm RhE模型的层数（即8-12层）相当70。与EpiDerm、EpiSkin和SkinEthic模型类似，该RhE模型的上层显示出致密排列的角质细胞层所形成的篮状编织结构28。此外，透射电镜（TEM）分析显示，所提出的RhE模型中角质层（SC）层数（即15-25层）与EpiDerm模型（即16-25层）相当70。总体而言，所提出的RhE模型在结构上与其他商业化表皮模型相似，能够模拟天然人表皮。通过经皮电阻（TEER）测定的组织完整性处于商业化RhE模型的范围内（即3000-5600 Ω·cm2）71,72,73，也与其他实验室自建的RhE模型（即约5000 Ω·cm2）相近74, 115。所提出的RhE模型表现出良好的分化特征，这由分化标志物和组织黏附标志物的存在及其正确定位所证实。此外，该RhE模型对促炎刺激（如LPS和TNF-α）具有响应性。
总之，本方案展示了如何以可靠的方法并以相对较大的规模生产重组表皮（RhE），以满足学术机构和私营机构研究人员的需求。所提出的RhE模型在形态学、表皮分化以及生物学反应性方面与其他现有的商业化模型相似。当需要获取相关皮肤模型时，该模型可为制药和皮肤化妆品领域提供一种替代工具。

表皮是皮肤的最外层，位于人体与外部环境的直接交界处。其主要功能是提供保护和保湿作用1。表皮作为抵御外界有害因子的有效物理屏障，并防止体内水分过度流失。这些皮肤功能主要依赖于皮肤最外层的细胞排列方式、细胞间脂质的组成及其空间结构2。表皮主要由角质形成细胞构成，这些细胞自深层向组织外侧迁移并经历分化过程。表皮可分为4至5层，各层以其分化阶段为特征。由内向外依次为有活性的表皮层，即基底层（SB）、棘层（SS）和颗粒层（SG），以及最外层无生命活性的角质层（SC）3。基底层主要由增殖活跃且富含角蛋白的角质形成细胞组成，这些细胞在分化后向上迁移进入棘层4。在角质形成细胞成熟过程中，其蛋白表达和结构会发生多种变化。角质形成细胞通过桥粒连接结构相互黏附5。在颗粒层中，板层小体的生成被启动。它们包含对皮肤屏障功能形成至关重要的脂质前体和酶类&#160;6。颗粒层的另一个特征是角质形成细胞胞质中存在透明角质颗粒。在与角质层交界处，板层小体的内容物&#160;被&#160;释放至细胞间隙，其中的非极性脂质（如神经酰胺、胆固醇和游离脂肪酸）排列成堆叠的板层脂双层结构，从而形成细胞外脂质基质7。在角质层中，细胞因酶促降解过程而失去所有细胞器（包括细胞核），并呈现扁平形态。它们被由交联蛋白层构成的角化包膜所包围，被称为角质细胞8, 9。桥粒组分与角化包膜交联形成角化桥粒，将角质细胞彼此连接。该上皮组织持续由干细胞更新，更新周期约为5至6周10。角质形成细胞的分化过程最终形成完全分层的表皮结构，这对皮肤屏障功能的建立至关重要11。
在损伤和炎症过程中，角质形成细胞通过分泌细胞因子、趋化因子和抗菌肽，诱导黏附分子和表面受体的变化，并触发促炎反应12。皮肤不仅是抵御外来物质的物理屏障，还在接触病原体时发挥免疫感应作用。此外，皮肤可调节多种物质在其各层之间的扩散，例如调控水分含量以防止人体脱水。皮肤还参与维生素D的合成，并具有多种其他代谢功能3, 13, 14。
为了评估外源性物质的不良作用，毒理学家数十年来一直依赖动物实验，但如今这种方法已不再是首选。除了对人类毒性的预测能力有限外，动物模型还涉及诸多伦理问题。化妆品行业禁止动物实验，以及研究中应遵循3R原则&#160;（即替代、减少和优化）的建议，推动了基于体外方法的替代测试技术的发展15。最早的体外皮肤细胞模型在20世纪90年代已有描述，此后已取得显著进展，从简单的人角质形成细胞单层培养发展到完全分化的表皮及全层皮肤模型&#160;16。如今，皮肤组织工程技术在制药和皮肤护理化妆品领域均日益重要。在过去二十年中，多家公司已商业化三维（3D）重建人表皮（RhE），这些模型为皮肤相关研究提供了标准化且可重复的工具。根据经济合作与发展组织（OECD）关于皮肤刺激性17， 18（即测试指南43919）和皮肤腐蚀性20（即测试指南43121）的指南，多种商用RhE模型已被接受用于化学品的体外皮肤测试。目前，用于皮肤致敏性22的体外测试（即SENS-IS检测）正处于审批流程并接受同行评审23。此外，还有大量其他检测方法利用商用RhE模型，用于评估光毒性24、测试药物制剂25、化妆品配方及活性成分26、研究皮肤屏障功能27，以及检测皮肤对环境应激因子的生物学反应28，29，30，31。
除了市售的3D皮肤模型外，多个研究团队已开发出各自的人工重建表皮模型（RhEs）32,33,34,35,36,37。自建的RhEs模型具有可根据研究目的调控培养条件的优势。具体而言，研究人员可选择用于重建3D表皮模型的角质形成细胞类型与来源（例如：原代细胞与永生化细胞、新生儿与老年来源、单个供体与混合随机供体、性别、种族、个体生活习惯如吸烟等）。他们还可以调整培养基的组成，并加入可调节目标蛋白或脂质表达的生长因子、维生素或其他化合物。利用自建的RhEs模型，研究人员还能探究生物反应和生物力学特性如何随3D模型的分化状态而变化。除这些直观的参数外，目前仍在持续努力提升3D皮肤模型的复杂性，使其更接近生理状态，例如引入其他表皮细胞类型（如黑素细胞和免疫细胞）38, 39，将角质形成细胞培养在含成纤维细胞的胶原基质上40,41,42，以及整合血管网络的组成部分43,44,45。
尽管可以根据特定需求调整培养条件，但某些参数必须严格遵守，以确保重建人表皮（RhE）组织的质量和相关性。&#160;在培养RhE组织时，将正常人表皮角质形成细胞（NHEKs）接种到特定的可渗透培养插件中，其多孔合成膜将培养孔分为两个区室，即顶端区室和基底外侧区室。膜的孔隙度（即孔径为0.4 µm）允许在顶端区室形成单层细胞，防止细胞迁移至插件的基底侧，同时使培养基中的基本营养物质从基底外侧区室供给角质形成细胞。在重建过程初期，NHEKs在浸没条件下培养数天，以促进其在&#160;膜上的黏附。与用于NHEKs二维培养的钙浓度相比，两个区室中的钙水平均有所提高，以减缓细胞增殖并促进其分化46。表皮钙梯度对于调控屏障形成和稳态至关重要47, 48。高钙水平（即高达1.5 mM）可促进细胞间连接的形成，并在终末分化过程中调节角化包膜的形成49。当角质形成细胞在支撑膜上形成连续且紧密黏附的单层后，移除顶端区室的培养基，培养过程&#160;转为气液界面（ALI）条件，以刺激多层化并建立表皮屏障50, 51。特定的培养条件对于获得完全分层的上皮组织至关重要36。在ALI条件下的重建过程中，基底外侧区室的培养基中添加角质形成细胞生长因子（KGF）、胰岛素、钙和抗坏血酸。抗坏血酸在形成类似于天然人皮肤的适当角质层脂质屏障方面起着重要作用52。在添加抗坏血酸的培养基中生长的角质形成细胞表现出分化的表型，角蛋白透明颗粒数量增加，且角质细胞间隙中形成有序的细胞间脂质板层结构52。此类补充对于通过增加角化包膜含量并防止亲水性抗氧化物质耗竭来改善表皮屏障功能至关重要53, 54。KGF是一种重要的旁分泌因子，可介导表皮的增殖与分化，用于刺激NHEKs55。
自研重建人表皮模型（RhEs）的主要缺点包括不同研究机构之间缺乏标准化，以及劳动强度增加和耗时延长（与即用型商用模型相比，最长可达3周）。本文旨在解决这些不足，为大规模生产奠定基础。除了上述自研RhEs的优势外，本方案还致力于降低组织间的个体差异和批次间差异，减少污染风险，并简化培养流程。
本方案描述了一种使用新生小鼠原代角质形成细胞（NHEKs）可重复且稳健地培养重组表皮（RhEs）的方法。此外，还展示了对RhEs形态、屏障完整性和表皮分化特异性蛋白表达进行表征的代表性结果。采用苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色和透射电子显微镜（TEM）观察RhEs的形态结构。为评估屏障完整性，检测经表皮电阻（TEER）以及Triton X-100暴露时间导致组织活力下降50%的时间（ET50）&#160;。通过免疫荧光（IF）分析桥粒连接结构（如：桥粒芯糖蛋白1）的形成，以评估角质形成细胞的黏附情况。同时采用免疫荧光检测表皮结构蛋白（如：兜甲蛋白、兜缕蛋白和丝聚合蛋白）的表达与分布。这些蛋白参与形成围绕角质层角质细胞的高度交联蛋白包膜，因此是表皮终末分化的关键标志物56, 57。此外，利用免疫荧光分析角蛋白10（keratin 10），该蛋白在颗粒层（SS）早期分化细胞中表达，并存在于所有已分化表皮层中58。最后，研究了RhE对促炎刺激物（如：脂多糖和肿瘤坏死因子α）的反应性，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞培养上清中白细胞介素1α（IL-1α）和白细胞介素8（IL-8）的水平。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>每100 mL伊红溶液中加入1 mL乙酸进行酸化。</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>水溶性伊红Y溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT110280</td><td>每100 mL伊红溶液中加入1 mL乙酸进行酸化。</td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma Aldrich 或 Merck</td><td>C8106 或 1.02378.0500</td><td>配制0.144 M的储存液，过滤除菌后分装保存于-20 &amp;deg;C。&amp;nbsp;建议每6个月重新制备分装液。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>配制100 &amp;mu;g/mL的储存液，分装后于-20 &amp;deg;C保存。工作浓度为1 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>Entellan封片剂</td><td>Merck</td><td>1.07960.0500</td><td>用于H&amp;E染色的封片介质。</td></tr><tr><td>EpiLife培养基（又称角质形成细胞生长培养基）</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>MEPI500CA</td><td>含有0.06 mM Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>任意供应商</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>10%福尔马林</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800770</td><td></td></tr><tr><td>人角质形成细胞生长补充剂（HKGS）（100倍浓缩液）</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>S0015</td><td>终浓度为0.2% [v/v] BPE、0.2 ng/mL人重组EGF、0.18 &amp;mu;g/mL氢化可的松、5 &amp;mu;g/mL牛转铁蛋白和0.01 &amp;micro;g/mL人重组胰岛素样生长因子-I。</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Biosolve B.V.</td><td>0016264102BS</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser无酚甘油明胶</td><td>Merck</td><td>1.08635.0100</td><td>用于免疫荧光染色的封片介质。</td></tr><tr><td>角质形成细胞生长因子（KGF）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>251-KG-050</td><td>将KGF蛋白用含0.1% [w/v] BSA的无菌PBS溶液重悬至100 &amp;mu;g/mL。分装后于-20&amp;deg;C保存。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒</td><td>Roche</td><td>4744926001</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>配制25 mg/mL的储存液，过滤除菌后分装保存于-20&amp;deg;C。建议每6个月重新制备分装液。避光保存。</td></tr><tr><td>脂多糖（LPS），大肠杆菌O55:B5菌株</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4524</td><td>用无菌PBS配制1 mg/mL的储存液，分装后于-20 &amp;deg;C保存。工作浓度为100 &amp;mu;g/mL。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;s苏木精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS80</td><td></td></tr><tr><td>正常人表皮角质形成细胞（NHEKs）</td><td>Lonza</td><td>00192906</td><td>从新生儿包皮组织中分离的人原代角质形成细胞，来自至少三位供体的混合样本。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010056 或 10010-015</td><td>货号因国家而异。</td></tr><tr><td>重组肿瘤坏死因子α（TNF-&amp;alpha;）</td><td>ImmunoTools</td><td>11344483</td><td>用无菌超纯水配制100 &amp;mu;g/mL的储存液。工作浓度为40 ng/mL。</td></tr><tr><td>无菌超纯水</td><td>任意供应商</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td>用无菌PBS配制5 mg/mL的MTT储存液。工作浓度为1 mg/mL。</td></tr><tr><td>曲拉通X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝（0.4% [v/v]）</td><td>任意供应商</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA（0.05% [v/v]）</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>吐温20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG H&amp;L（Alexa Fluor 488）</td><td>Abcam</td><td>Ab150113</td><td></td></tr><tr><td>三水合柠檬酸三钠</td><td>Merck</td><td>1.06448.0500</td><td>用于免疫荧光染色的抗原修复缓冲液。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG H&amp;L（Dylight 488）</td><td>Agrisera</td><td>AS09 633</td><td></td></tr><tr><td>丝聚蛋白小鼠抗体</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-53243</td><td></td></tr><tr><td>兜甲蛋白兔抗体</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-33742</td><td></td></tr><tr><td>角蛋白10小鼠抗体</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-32962</td><td></td></tr><tr><td>桥粒芯糖蛋白-1小鼠抗体&amp;nbsp;</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>MAB944</td><td></td></tr><tr><td>兜壁蛋白兔抗体</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP1-33610</td><td></td></tr></tbody></table>

大规模培养三维重建人表皮

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

一种由新生儿原代角质形成细胞重建的三维人表皮模型被呈现。本文描述了该模型的培养过程及表征方法。将新生儿原代角质形成细胞接种于可渗透的聚碳酸酯插入式培养插件上，在接种后三天将其提升至气液界面进行培养。在含有特定生长因子和抗坏血酸的高钙培养基中刺激培养十四天后，该模型实现完全分化。组织学分析显示，该模型具有完全分层的表皮结构，形态上模拟了天然人皮肤。为表征该模型及其屏障功能，通过免疫荧光检测了与角质形成细胞早期分化（如Keratin 10）、晚期分化（如involucrin、loricrin和filaggrin）以及组织黏附（如desmoglein 1）相关的特异性蛋白表达水平与定位。此外，通过测量跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance）进一步评估了组织屏障的完整性。重建的 人表皮对促炎刺激物（如脂多糖和肿瘤坏死因子α）具有响应性，可导致细胞因子释放增加（如白细胞介素1α和白细胞介素8）。本方案代表了一种简单且可重复的体外培养方法 重建的 人类表皮作为评估环境影响及开展多种皮肤相关研究的工具。

在二维培养条件下，正常人表皮角质形成细胞（NHEKs）呈现典型的多边形形态（图2A）。如上所述，当NHEKs达到约80%融合度时，将其接种至培养插件中。通过苏木精-伊红（H&amp;E）染色和透射电子显微镜（TEM）分析重建人表皮（RhE）的形态结构。在气液界面（ALI）培养15天后，获得完全分层的表皮组织，其具有表皮的四个主要层次：基底层（SB）、棘层（SS）、颗粒层（SG）和角质层（SC）（图2B）。在SB层中，细胞呈柱状。从第二层向上至RhE的上层，NHEKs发生分化，表现为细胞形态的变化（从SB层的柱状逐渐转变为SS层的棘状）。在SG层中，细胞形态更加扁平，并可见透明角质颗粒（KG），在细胞质中表现为紫色颗粒。其典型的圆形和星状形态在H&amp;E图像中由白色箭头标出（图2C）。SC层中的细胞为终末分化细胞，完全扁平且无细胞核。分层的RhE总厚度为84.3 ± 2.4 µm，其SC层厚度为19.6 ± 3.2 µm（图2D）。这些数值与天然人体皮肤的报道值相近，分别为60–120 µm和10–20 µm69。活细胞层数为6–7层，低于天然人体皮肤的约7–14层70。在重建方案的不同时间点（即第7、10、13和15天）对RhE进行超微结构分析，显示RhE的角化过程随时间推移角质细胞层数逐渐增加（图2E）。在ALI培养15天后，RhE组织的SC层由约15–25层组成，与天然人体皮肤的报道值（15–20层）相当69。
<img alt="组织学与显微镜分析、上皮组织与生长阶段、厚度比较的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：原代角质形成细胞与重建的人表皮。（A）接种至插入式培养小室前原代角质形成细胞的相差显微镜图像。比例尺为 50 µm。（B-C）重建人表皮（RhE）的苏木精-伊红（H&E）明场显微镜图像。比例尺分别为 50 µm（B）和 25 µm（C）。（D）RhE 与角质层（SC）厚度的定量分析（均值 ± 标准误，n=3）。（E）在气液界面培养 7、10、13 和 15 天后 RhE 横切面的透射电子显微镜图像。比例尺为 4 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
根据其分化阶段，三维培养的NHEKs表现出不同的蛋白质表达谱。通过免疫荧光染色检测了RhEs中早期角质形成细胞分化特异性蛋白（如角蛋白10）、晚期角质形成细胞分化特异性蛋白（如兜甲蛋白、兜缕蛋白和丝聚蛋白）以及角质形成细胞黏附相关蛋白（如桥粒芯糖蛋白1）的表达。兜甲蛋白的表达主要出现在颗粒层（SG层），因其在分化过程的较早阶段即开始表达（图3D），而丝聚蛋白和兜缕蛋白则在上层表达（图3B-C）。角蛋白10在除角化层（SB层）外的所有活细胞层中均有表达（图3E）。RhEs表现出功能性的桥粒连接结构，这由桥粒芯糖蛋白1在表皮活细胞层间细胞间隙中的表达所证实（图3F）。综上所述，这五种标志物均在相应的表皮层中正确表达和定位，表明存在正常的表皮分化过程。
<img alt="显示皮肤组织层的组织学和免疫荧光图像，突出显示蛋白质标志物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：重建人表皮的表皮分化、组织黏附性和组织完整性。（A）RhE的H&amp;E明场显微镜图像。共聚焦荧光显微镜图像显示（B）丝聚合蛋白（FLG）、（C）兜甲蛋白（LOR）、（D）内披蛋白（INV）、（E）角蛋白10（K10）和（F）桥粒芯糖蛋白1（DSG-1），均以品红色表示。细胞核染色（DAPI）以蓝色表示。比例尺为25 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
通过评估RhE模型的组织活力和完整性，研究其屏障特性。培养15天后，使用伏特欧姆计测量经皮电极电阻（TEER）以确定组织完整性。RhE模型记录的电阻值为2567 ± 415 Ω·cm2，表明已形成连续的屏障结构（图4A）。该数值范围与文献报道的RhE模型结果一致71,72,73,74。此外，采用噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT）法测定细胞毒性参照化学品（即Triton X-100）使组织活力降低50%所需的暴露时间（ET50）。RhE模型测得的ET50值为2.1小时，该数值处于其他已验证可用于可靠预测刺激性分类的3D表皮模型的可接受范围内（OECD指南439）19。
<img alt="重组人表皮电阻的箱线图及随时间变化的组织活力图，显示ET&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt;分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：重组人表皮的屏障特性。（A）通过跨上皮电阻（TEER）测量组织完整性（均值 ± 标准误，n=6）。（B）通过局部暴露于78.3 µL的1% Triton X-100后测定组织活力（即MTT法）确定ET50（均值 ± 标准误，n=3）。
采用已知的促炎性刺激物检测了重组人表皮（RhEs）的反应性。对RhEs进行系统性处理，即在基底外侧区室的培养基中添加刺激物，所用刺激物为100 µg/mL的大肠杆菌脂多糖（LPS）和40 ng/mL的肿瘤坏死因子α（TNF-α）。刺激24小时后，收集细胞培养基。通过乳酸脱氢酶（LDH）检测法测定细胞毒性，并与已知膜破坏剂Triton X-100去垢剂处理组的数值进行比较（图5）。结果显示，经Triton X-100处理的RhEs中LDH活性显著升高（p &lt; 0.05，单因素方差分析，Dunnett多重比较检验），而LPS和TNF-α处理组均未表现出细胞毒性。
<img alt="LDH 活性柱状图；TX-100、LPS、TNF-α；相对于 CTRL；统计学比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：通过乳酸脱氢酶（LDH）检测法测定的细胞毒性。数据以未处理对照组组织（CTRL）的相对值表示；均值 ± 标准误（SEM），n=9（Triton X-100），n=8（LPS），n=3（TNF-α）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及 Dunnett 多重比较检验进行显著性检验。星号表示与 CTRL 组相比具有统计学显著差异，****p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
使用 ELISA 法对 RhE 培养基中白细胞介素 1α（IL-1α）和白细胞介素 8（IL-8）的释放量进行定量分析。图6展示了 RhE 经 LPS 和 TNF-α 刺激后，IL-1α 和 IL-8 的定量释放水平及相对释放水平。LPS 处理可显著诱导 IL-8（9.6 ± 1.0 倍增加）和 IL-1α（2.7 ± 1.3 倍增加）的释放，差异具有统计学意义（p &lt; 0.05，非配对 Student's T 检验）。TNF-α 处理未显著诱导 IL-8 释放，尽管观察到 IL-8 水平升高的趋势（2.3 ± 0.8 倍增加）；然而，TNF-α 可显著触发 IL-1α 的释放（1.8 ± 0.5 倍增加），差异具有统计学意义（p &lt; 0.05，非配对 Student's T 检验）。
<img alt="IL-8、IL-1α 表达量柱状图；LPS、TNF-α 对浓度的影响；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6重建人表皮中的促炎反应 经LPS刺激24小时后RhE释放IL-8的浓度A）和 TNF-α（B). 数据以均值 ± 标准误表示，n=8（LPS），n=3（TNF-α）。C数据表示为与对照组未处理组织（CTRL）相比的相对值的平均值 ± 标准误，n=8（LPS），n=3（TNF-α）。在LPS刺激24小时后，RhE中IL-1α释放的浓度D）和 TNF-α（E). 数据以均值 ± 标准误表示，n=8（LPS），n=3（TNF-α）。F数据以相对于对照组（CTRL）的均值 ± 标准误表示，n=4（LPS），n=3（TNF-α）。采用非配对 Student's T 检验进行显著性检验。星号表示与对照组相比具有统计学显著性差异，*p<0.05 &lt; 0.05，****p &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了一种简便的方法，可重复且稳定地培养三维重建人表皮。此外，还对表皮屏障模型的结构-功能关系进行了表征。同时展示了重建人表皮在受到促炎刺激后的生物学反应。

介绍了一种由新生儿原代角质形成细胞重建的三维人表皮模型。本文提供了该培养过程的详细方案……

体外构建的人类表皮模型最早于20世纪90年代开发，其主要目标是建立替代动物实验的检测方法。目前，这些3D表皮模型已广泛用于化妆品原料安全性和功效性的测试。尽管可从多家组织供应商处购买，但在实验室中自行重建3D模型可为特定研究终点提供更大的灵活性。已有若干研究文章简要描述了三维表皮模型的重建方案，但迄今为止，尚无视频展示该重建过程中的关键步骤。这正是本视频论文发表的原因。自行制备重建人表皮模型可在培养过程中提供极大的灵活性，例如可改变培养基成分、引入促炎或氧化应激刺激、沉默特定目的基因，以及抑制或激活某些生物过程。首先，将一管含有100万个冻存的正常人表皮角质形成细胞（NHEKs）的冻存管部分浸入37摄氏度的水浴中，进行解冻。将冻存管在水浴中孵育1至2分钟，直至仅剩少量冰晶可见。用移液器轻柔吹打2到3次，将细胞重新悬浮。将细胞悬液转移至两个T75培养瓶中，共加入15毫升预热的复苏培养基，使接种密度达到每平方厘米6.7 × 10⁴个细胞。使用排液移液器，提前在24孔板中每孔加入1.5毫升浸没培养基。当细胞培养至80%融合度时，即可用于插入物中接种，以构建重组人表皮（RHEs）。移除含有NHEKs的T75培养瓶中的基础培养基。向每个T75培养瓶中加入5毫升预热的PBS，洗涤细胞，然后吸去培养瓶中的PBS。向每个培养瓶中加入2至3毫升预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，确保胰蛋白酶溶液均匀覆盖培养瓶的细胞培养区域。将培养瓶放入细胞培养箱中孵育 4 分钟，然后在 10 × 放大倍数下使用显微镜检查细胞是否已脱落。轻敲培养瓶以帮助细胞从瓶壁表面脱落。待所有细胞完全脱落后，向每根 T75 培养瓶中加入等体积预热的胰蛋白酶抑制剂，并将细胞悬液从培养瓶转移至离心管中。用五毫升预热的 PBS 清洗烧瓶，并将液体转移至含有细胞悬液的离心管中。在 400 × g 条件下离心 5 分钟以收集细胞。小心弃去大部分上清液，管中保留约 100 至 200 微升。用手指轻轻弹击离心管，小心地松动沉淀物。用少量悬浮培养基将细胞沉淀重新悬浮，上下吹打5至10次，以确保形成均匀的细胞悬液。起始体积宜小，以避免细胞聚集体的形成，每瓶初始T75培养瓶最多可加入1毫升悬浮培养基。使用台盼蓝排斥法对悬液中的细胞进行计数。根据文稿中提供的第一个公式，用额外的浸没培养基稀释细胞悬液，使其浓度达到每毫升3.525 × 10⁵个细胞。对稀释后的溶液进行第二次细胞计数，并利用文稿中的第二个公式计算需接种到培养插件中的细胞悬液体积。将24孔培养插件悬挂在载体板的最高位置，并将载体板转移至预先加入浸没培养基的24孔板中。向每个插件中加入确定体积的细胞悬液，注意不要触碰插件。接种后，将24孔板在室温下孵育10至15分钟，以克服边缘效应。在此期间不要移动培养板。将培养板转移至细胞培养孵箱中，并在浸没条件下培养三天。在细胞培养孵箱中孵育三天后，使用吸液系统和玻璃巴斯德吸管从顶端腔室中移除浸没的培养基，使已贴附于膜表面的细胞暴露于气液界面（air liquid interface, ALI）。将新的24孔板中加入1.5毫升新鲜预热的ALI培养基，然后将带有培养插件的载体板转移至新的多孔板中。将多孔板放回细胞培养孵育箱。每2至3天更换一次ALI培养基，持续14天。二维培养的角质形成细胞呈现典型的形态，具有均匀的多边形形状。在气液界面（ALI）培养15天后，重建的人表皮形成完全分层的组织，表现为四个主要表皮层。在重建方案的不同时间点对重建人表皮进行超微结构分析，揭示了角化过程，随时间推移角质层结构的数量逐渐增加。表皮中的角质形成细胞根据其分化阶段表现出不同的蛋白质表达谱。内披蛋白的表达主要出现在颗粒层（SG层），而丝聚合蛋白和兜甲蛋白的表达则位于更上层。角蛋白-10的表达存在于除棘层（SB层）以外的所有活细胞层中。重建的人表皮显示出具有功能性的桥粒连接，这通过在活性表皮层细胞间区域表达桥粒芯糖蛋白-1得以证实。通过使用已知的屏障破坏剂进行局部处理后评估组织活性，以及评估组织完整性，来研究重建表皮模型的屏障特性。组织完整性在15天后通过使用电压计测量经皮电阻（TEER）来确定。研究了表皮对脂多糖和肿瘤坏死因子α的反应性。与Triton X-100对照相比，LPS和TNFα处理均无细胞毒性。使用IL裂解法对RHE培养基中白细胞介素-1α和白细胞介素-8的释放进行定量。LPS处理导致白细胞介素-1α和白细胞介素-8的释放量显著上调，具有统计学意义。TNFα处理仅导致白细胞介素-1α的释放量显著上调，具有统计学意义。然而，在 TNF alpha 刺激下，也观察到白细胞介素-8 水平升高的明显趋势。按照本方案，可通过测量 TEER 来评估屏障完整性。细胞活力或细胞毒性可通过 MTT 或 LDH 检测等方法进行测定。上清液可用于检测细胞因子或其他蛋白质的分泌情况。此外，还可利用该组织研究目的蛋白质或基因的表达。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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