Polarización de células y análisis de células y análisis derivados de monocitos humanos M1 y M2 con citometría de flujo sobre la infección por mycobacterium tuberculosis

Este protocolo ofrece la oportunidad de seguir la polarización inmunitaria de células derivadas de monocitos humanos basándose en la visualización y caracterización profunda de Mtb marcado con proteínas fluorescentes verdes en diversos subconjuntos de macrófagos utilizando citometría de flujo de 10 colores. Esto representa un método eficiente y reproducible para estudiar las respuestas a la infección por Mtb en macrófagos polarizados M1 o M2, incluida la evaluación del fenotipo y la función antes y después de la infección. Para aislar PBMC de las capas leucocitarias de donantes humanos, use una pipeta para superponer lentamente 15 mililitros de sangre de la capa leucocitaria por el costado de un tubo de 50 mililitros en 15 mililitros de medio de gradiente de densidad y separe las células por centrifugación.

Utilice una pipeta Pasteur estéril para extraer la capa superior de plasma y transfiera con cuidado la capa de células mononucleares a un nuevo tubo de 50 mililitros. Agregue medio RPMI sin suero a las células hasta un volumen final de 50 mililitros e invierta suavemente el tubo varias veces antes de centrifugar. A continuación, vuelva a suspender las células en 20 mililitros de medio sin suero para contar.

Para iniciar la diferenciación de macrófagos, diluya las células a una concentración de 5 veces 10 a la sexta células por mililitro de medio libre de suero y siembre dos mililitros de células en pocillos individuales de una placa de seis pocillos. Coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante dos o tres horas para permitir que las células se adhieran al fondo de los pocillos. Al final de la incubación, lavar los pocillos tres veces con un mililitro de medio libre de suero por lavado, y agregar dos mililitros de medio RPMI completo suplementado con 50 nanogramos por mililitro de GM-CSF o 50 nanogramos por mililitro de M-CSF para la diferenciación M1 o M2 respectivamente a cada pocillo de células adherentes.

Tres días después del inicio de la polarización, reemplace cuidadosamente un mililitro de sobrenadante de cada pocillo con un mililitro de medio completo fresco suplementado con los factores de crecimiento apropiados. En el sexto día de cultivo, agregue 50 nanogramos por mililitro de interferón gamma y 10 nanogramos por mililitro de LPS a los pocillos tratados con GM-CSF y 20 nanogramos por mililitro de IL-4 a los pocillos tratados con M-CSF. Compruebe la morfología de los cultivos celulares derivados de monocitos con regularidad mediante microscopía óptica para asegurarse de que los monocitos más pequeños se diferencian en células más grandes similares a los macrófagos.

Para establecer un cultivo de Mtb, en una instalación de nivel III de bioseguridad, mezcle una alícuota de un mililitro de suspensión de bacterias descongeladas con nueve mililitros de medio completo de TB en un tubo de tapa filtrada de 50 mililitros para una incubación de 24 horas en el tubo de la incubadora de cultivos celulares. Al día siguiente, recoja las bacterias por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 15 a 20 mililitros de medio completo de TB fresco en un nuevo tubo de cultivo con tapón filtrado de 50 mililitros antes de devolver las bacterias a la incubadora de cultivo celular. Después de siete a 10 días de cultivo, lavar las bacterias dos veces en 35 a 40 mililitros de tampón de lavado estéril por lavado, resuspendiendo las bacterias en un mililitro de medio RPMI sin suero después del segundo lavado.

Agregue otros nueve mililitros de medio RPMI sin suero a las bacterias y sonique las bacterias en un sonicador de baño de agua en la cabina de bioseguridad de Clase II durante cinco minutos a 37 grados centígrados. A continuación, mida la densidad óptica de un mililitro de suspensión bacteriana a una longitud de onda de 600 nanómetros en un espectrofotómetro colocado dentro de la cabina de bioseguridad. Para infectar las células derivadas de monocitos, diluya las bacterias a una concentración de 5 veces 10 a la 6ª unidades formadoras de colonias por mililitro en medio libre de suero y reemplace el sobrenadante en cada pocillo de la placa de cultivo celular de seis pocillos con un mililitro de medio fresco libre de suero y un mililitro de suspensión de bacterias por pocillo para obtener una multiplicidad de infección de cinco.

Después de una incubación de cuatro horas en la incubadora de cultivos celulares, lave cada pocillo tres veces con un mililitro de tampón de lavado estéril por lavado, inclinando la placa con cuidado para eliminar todo el volumen de tampón de las esquinas de los pocillos después de cada lavado. A continuación, resuspender las células derivadas de monocitos infectadas con Mtb en dos mililitros de medio completo sin antibióticos. Para teñir las células para la citometría de flujo, incubar las células infectadas con un mililitro de tampón FACS suplementado con 0,5 milimolares de EDTA por pocillo durante al menos 30 minutos.

Al final de la incubación, recoja las células separadas con un pipeteo suave y transfiera las células a tubos de microcentrífuga individuales con tapón de rosca para la centrifugación. Resuspender las células en aproximadamente 50 microlitros de cóctel de anticuerpos antihumanos conjugados con fluorocromo y colorante de viabilidad de interés e incubar las células durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, protegidas de la luz. Después del lavado, fije las celdas con 200 microlitros de tampón de fijación recién preparado durante 30 minutos a temperatura ambiente protegidas de la luz.

Después de la fijación y el lavado, vuelva a suspender las células en 400 microlitros de tampón FACS y transfiera las células a tubos de microcentrífuga de un mililitro. Para analizar las células, use perlas de compensación para compensar la señal fluorescente para cada anticuerpo conjugado con fluorocromo en el cóctel y use celdas sin teñir para establecer la puerta para la población de células negativas. A continuación, adquiera un mínimo de 50.000 células por muestra.

Las células derivadas de monocitos M1 y M2 muestran un cambio vertical hacia una mayor granularidad y un tamaño de célula reducido tras la infección por Mtb. También se observa una mayor muerte celular en las células M1 y M2 infectadas con Mtb a una multiplicidad de infección de cinco en comparación con las células M0 no infectadas. Cabe destacar que se observa una expresión de GFP Mtb sustancialmente mayor en las células M2 después de cuatro horas de infección en comparación con las células M1.

Las células M1 y M2 no infectadas se pueden caracterizar por su coexpresión de receptores CD64 y CD86 o CD200 y CD163, respectivamente. Después de cuatro horas de infección por Mtb, se observa un aumento en la frecuencia de células positivas para el receptor CD200 en las células polarizadas M1 positivas para GFP Mtb, mientras que la expresión de CD163 se reduce en las células M2. Las bacterias Mtb GFP también se pueden observar en las células M1 CD64 positivas y en las células M2 CD163 positivas mediante microscopía confocal.

análisis UMAP revela que cuatro horas de infección por Mtb no son suficientes para afectar a la polarización de los macrófagos, mientras que 24 horas de infección dan lugar a grupos claramente separados de células M1 y M2 infectadas y no infectadas que expresan distintos perfiles de expresión de marcadores de superficie. Además, el análisis de PhenoGraph muestra que 24 grupos diferentes de diferentes tamaños se distribuyen de forma única entre las células M1 y M2 no infectadas y las infectadas con Mtb. La eficacia de la polarización M1 o M2 o de la infectividad de Mtb puede variar sustancialmente entre los donantes humanos.

Y por lo tanto, se recomienda la inclusión de al menos dos donantes en cada experimento para reducir las variaciones experimentales. Este modelo permite la evaluación simultánea de macrófagos humanos mediante citometría de flujo, microscopía confocal, análisis de expresión de ARNm, ensayos multiplex de factores solubles y cuantificación bacteriana utilizando unidades de expresión de GFP o de formación de colonias.