Desarrollo y pruebas de ensayos cuantitativos de PCR específicos de especies para aplicaciones de ADN ambiental

Los ensayos bien optimizados son vitales para la interpretación adecuada de los datos de ADN ambiental. Este protocolo describe los pasos de diseño y prueba necesarios para desarrollar un ensayo de este tipo. En general, el ADN ambiental es un método no invasivo para detectar una especie o conjunto de especies en particular.

Puede reducir costos y ser más sensible en comparación con los métodos de encuesta convencionales. Este método puede ayudar a la conservación y el manejo de la vida silvestre a través de la detección de ADN de una especie de interés, lo que permite inferir potencialmente la presencia de la especie en el área muestreada. Debido a la gran sensibilidad de la PCR cuantitativa, la contaminación puede ocurrir fácilmente y se necesitan controles negativos para identificar los pasos en los que se introdujo la contaminación.

El eDNA es un campo plagado de jerga y términos taquigráficos. Para aquellos que no tienen experiencia en biología molecular o qPCR, las demostraciones visuales pueden ayudar a la planificación de un diseño experimental desde la conceptualización hasta la generación de datos. La demostración del procedimiento estará a cargo de Dannise Ruiz Ramos, bióloga de nuestro laboratorio, y Trudi Frost, auxiliar de laboratorio estudiantil.

Para comenzar, busque y descargue secuencias de múltiples regiones genéticas para especies de interés utilizando la base de datos de nucleótidos del NCBI. Seleccione todas las secuencias que coincidan con las especificaciones y seleccione Enviar a.Elija Completar registro, Archivo, Formato de descarga como GenBank o FASTA, luego Crear archivo. Estas secuencias ahora se guardan en la computadora.

Repita estos pasos para todas las especies de interés. Mantenga las secuencias de cada región génica en un archivo separado, ya que se analizarán por separado. Para alinear las secuencias de cada región génica por separado, importe los archivos de secuencia descargados a un programa de alineación de secuencias, como el software Geneious Prime.

Cree carpetas separadas para cada región génica y, a continuación, seleccione todas las secuencias dentro de una carpeta que contenga secuencias de una región génica. Utilice la herramienta Alineación múltiple para crear una alineación de nucleótidos, como Geneious o MUSCLE de las secuencias seleccionadas. Elija regiones prometedoras para el diseño de ensayos a través de la visualización de datos de secuencia alineados.

Seleccione una región que tenga una gran cantidad de datos de secuencia disponibles para la especie de interés, que sea muy divergente entre las especies y que muestre una baja variación dentro de la especie. A continuación, diseñe los cebadores y la sonda del ensayo. Utilice el software de diseño de ensayos de qPCR para diseñar cinco conjuntos de ensayos de qPCR.

Pegue la secuencia seleccionada en el cuadro Entrada de secuencia. Si la alineación ha creado espacios, elimínelos de la secuencia. Seleccione la sonda de cebadores qPCR 2 en la opción Elija su diseño y, a continuación, descargue los ensayos recomendados.

Copie las secuencias del cebador directo del primer ensayo y busque esta secuencia de cebadores en la alineación creada anteriormente. Si utiliza Números primos geneiosos, utilice la herramienta Anotar predicción para agregar la región del cebador a la alineación. Haga esto para todas las combinaciones de cebador y sonda.

Inspeccione estas regiones de la alineación para ver si hay variación dentro de las especies objetivo, así como dentro de las especies coexistentes. Pruebe los cebadores in silico a través de Primer-BLAST de NCBI. Pegue los cebadores en el cuadro de uso de mi propio cebador en Parámetros del cebador.

En las opciones de Parámetros de comprobación de especificidad del par de cebadores, seleccione NR como Base de datos y escriba el orden taxonómico o la familia del organismo de interés en el cuadro Organismo. Asegúrese de que no es probable que los cebadores seleccionados amplifiquen especies no objetivo. Pruebe la eficiencia del ensayo in vitro mediante la creación de una curva estándar y determine la eficiencia y el rango lineal de la curva.

Pruebe al menos seis diluciones diez veces mayores de un patrón de ADN sintético que contenga la secuencia objetivo, a razón de aproximadamente una a un millón de copias por reacción. Utilice el software qPCR para trazar el valor CQ de cada patrón en el eje Y, y el logaritmo en base 10 de la concentración estándar inicial en copias por reacción en el eje X. El software qPCR debe ejecutar automáticamente una regresión lineal.

Calcule la eficiencia a partir de la pendiente de la regresión. Inspeccione visualmente la curva estándar en busca de sesgos o de bajo rendimiento, medido por la eficiencia y los valores de R cuadrado. Utilice un control positivo interno para probar la inhibición de PCR de muestras de campo reales, lo que puede provocar una disminución de la sensibilidad y falsos negativos.

Determine los límites de detección y cuantificación para cada ensayo. Pruebe ensayos con especies no objetivo para verificar la especificidad y asegurarse de que el ensayo funciona bien con una CIP multiplexada. Los ensayos con buena sensibilidad, especificidad y eficiencia pueden pasar a los siguientes pasos.

Para realizar pruebas in situ del ensayo, obtenga varias muestras de agua y procéselas para qPCR. Ejecute el ensayo cuantitativo de PCR y compare la concentración de eDNA y la frecuencia de detección con las diferencias conocidas en el sitio en cuanto a ocurrencia y abundancia. Confirme todas las detecciones por secuenciación.

Se descargaron y alinearon las secuencias disponibles de todas las especies de Unionidae en el río Clinch. Después de diseñar varios ensayos, se agregaron cinco juegos de cebadores y sondas a la alineación para la evaluación visual. Los juegos de cebadores y sondas se probaron in silico e in vitro.

En el laboratorio, todos los ensayos se probaron utilizando extracciones de ADN de 27 especies disponibles para verificar la especificidad. Un ensayo amplificó con éxito solo las especies objetivo. Aquí se muestra un ensayo exitoso con buena eficiencia y valores de R cuadrado.

El LOD y el LOQ para el ensayo seleccionado fueron cinco copias por reacción. Por el contrario, se descartaron los ensayos que producían una curva estándar con poca eficiencia. En una qPCR de calidad, las diluciones estándar amplifican a ciclos uniformemente espaciados valores de cuantificación de aproximadamente 3,3 ciclos por cada diferencia de diez veces en la concentración.

En una qPCR deficiente, los patrones pueden mostrar una variación desigual en los valores de cuantificación del ciclo entre diluciones. La amplificación de la IPC para muestras desconocidas debe compararse con los resultados de la IPC de control de plantilla negativa. Si no hay inhibidores presentes en las muestras, toda la amplificación de IPC debe tener una agrupación estrecha en el gráfico, con valores de cuantificación de ciclo casi iguales a los del control sin plantilla.

Para la prueba in situ del ensayo, los sitios de ubicación incluyeron el fondo del lecho de mejillones en el arroyo, el fondo del lecho muscular cerca de la orilla, 100 metros aguas abajo del lecho en el arroyo, 500 metros aguas abajo del lecho en el arroyo y 500 metros aguas abajo del lecho cerca de la orilla. Los ensayos cuantitativos de PCR para el ADN ambiental pueden ayudar en el seguimiento de especies invasoras y en peligro de extinción, así como mejorar nuestra comprensión de los cambios espaciales y temporales en la detección de especies sin tener que capturar físicamente el organismo individual.