Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza

Nuestro enfoque de detección de ADN, ARN y proteínas basado en células inmunofluorescentes múltiples nos permite visualizar simultáneamente proteínas y ácidos nucleicos de diferentes tipos y trenzaciones dentro de células individuales. Antes de la siembra, incube los cubreobjetos en etanol durante cinco minutos, seguidos de dos lavados de dos minutos en PBS. Después del segundo lavado, sumerja completamente el cubreobjetos en 20 microgramos por mililitro de poli-D-lisina durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, retire el exceso de solución de la matriz con dos lavados en PBS y diluya las celdas de interés a 1 x 10 hasta la sexta celda por cada 50 microlitros de PBS por concentración de cubreobjetos. A continuación, siembre 50 microlitros de las células de interés en cada cubreobjetos recubierto de poli-D-lisina para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lavar las células tres veces en PBS antes de fijarlas en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos.

Al final de la incubación, lavar las células dos veces en PBS antes de permeabilizar las células con 500 microlitros de 0,1%Tween 20 en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave cada cubreobjetos dos veces con 500 microlitros de PBS fresco por lavado. Para inmovilizar el portaobjetos de la cubierta en un portaobjetos de vidrio, coloque una pequeña gota de esmalte de uñas transparente en un portaobjetos de vidrio esterilizado y coloque un borde del lado sin celdas del portaobjetos sobre la gota de esmalte de uñas y baje el cubreobjetos sobre el lado de la celda del portaobjetos hacia arriba.

Agregue unas gotas de PBS en el cubreobjetos inmovilizado para evitar que las células se deshidraten y use un bolígrafo de barrera hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor del exterior del cubreobjetos. Cuando se haya estirado la barrera, reemplace el PBS con 100 microlitros de proteasa III y coloque el portaobjetos en una incubadora a 40 grados centígrados durante 15 minutos. Al final de la incubación, lave los portaobjetos dos veces en PBS fresco durante dos minutos por lavado con mecedoras.

Después del segundo lavado, diluir la sonda de interés en 200 microlitros de tampón de hibridación a 67 grados centígrados durante 10 minutos. Al final de la incubación, agregue 50 microlitros de la solución de la sonda a cada cubreobjetos y coloque los portaobjetos en un horno humidificado a 40 grados centígrados durante dos horas. Al final de la incubación, lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado fresco y mecerá durante dos minutos por lavado.

Después del segundo lavado, golpee los portaobjetos para eliminar el exceso de tampón y trate secuencialmente los cubreobjetos con una gota de los amplificadores para los canales fluorescentes 1, 2 y 3 para una incubación de 30 minutos, 40 grados Celsius por amplificador con dos lavados de dos minutos en tampón de lavado fresco con balanceo por lavado entre tratamientos. Después del último lavado, agregue una gota del amplificador de canal fluorescente 4 al cubreobjetos para una incubación de 15 minutos en el horno a 40 grados centígrados y lave el portaobjetos dos veces con tampón de lavado y una vez con PBS como se demuestra. Para la inmunotinción de las proteínas de interés, después del último lavado, tratar cada cubreobjetos con 200 microlitros de tampón de bloqueo durante una incubación de una hora a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, decantar el tampón bloqueante y añadir 200 microlitros del anticuerpo primario de interés diluido en PBS más Tween 20 suplementado con albúmina sérica bovina al 1%. Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente, lavar los portaobjetos con dos lavados de 10 minutos en PBS fresco más Tween 20 con agitación por lavado antes de etiquetar las muestras con un anticuerpo secundario adecuado durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los portaobjetos dos veces con PBS fresco más Tween 20 durante 10 minutos agitando por lavado.

Después del segundo lavado, teñir los núcleos con un tinte nuclear apropiado durante un minuto a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. Para montar las muestras para la obtención de imágenes, coloque una gota de solución antidecoloración en un nuevo portaobjetos de vidrio estéril por muestra y extienda la solución para cubrir un área aproximadamente del tamaño de los cubreobjetos. Separe los cubreobjetos de sus portaobjetos y sumérjalos en PBS.

Usa pinzas para quitar cualquier residuo de esmalte de uñas y seca la parte posterior del cubreobjetos con una toallita de laboratorio. A continuación, coloque suavemente cada cubreobjetos con el lado de la muestra hacia abajo sobre la solución antidecoloración y deje que las muestras se sequen durante la noche. Como prueba de concepto de este procedimiento, el ADN, el ARN y la proteína del VIH-1 se marcaron y visualizaron simultáneamente al microscopio a nivel de una sola célula.

En este ejemplo, dos genomas de ADN del VIH-1 se pueden visualizar dentro de una sola célula, ya que están transcribiendo activamente el ARN viral. El ARN viral se exportó a través del complejo de poros nucleares y la proteína viral se sintetizó en el citoplasma. Como se observó, se observa muy poca o ninguna reactividad cruzada entre los conjuntos de sondas de los dos virus, a pesar de estar marcados con dos retrovirus con un potencial de reactividad cruzada de sondas.

Además, la tinción de ARN viral puede eliminarse si las células se tratan con ARNasa durante la preparación de la muestra. A continuación, se puede cuantificar la intensidad media de fluorescencia integrada de la señal de anticuerpo por célula en cada imagen. Como se ha observado, la cantidad de ARN pregenómico del VHB y el ARN total del VHB aumenta en el transcurso de la infección por el VHB.

Las imágenes de infección por VHC también se pueden realizar a través de microscopía confocal utilizando un objetivo de inmersión en aceite 60X para detectar los fluoróforos de interés. Este enfoque altamente específico también permite el seguimiento de procesos virales o celulares con una alta resolución temporal espacial. Además, esta técnica se puede utilizar para el estudio de múltiples virus y otros patógenos.