Flujo de trabajo de tomografía de matriz para la adquisición dirigida de información de volumen mediante microscopía electrónica de barrido

El análisis de microscopía electrónica es a menudo complejo. Creemos que nuestro protocolo facilita el procesamiento y la adquisición de los datos EM de la gran superficie de muestra y el volumen intermedio. Nuestro protocolo ayuda a encontrar estructuras objetivo en secciones en serie.

El registro de datos se limita a lo necesario. En comparación con la adquisición de datos en bloques de tejido entero, el tiempo de registro se reduce y el análisis de datos es más fácil. Dada la facilidad general del enfoque, creemos que se puede utilizar para abordar no solo cuestiones científicas, sino también como herramienta de diagnóstico.

Para generar una matriz para el análisis, primero sujete la muestra en un soporte de ultramicrotomo y use una cuchilla de afeitar para recortar aproximadamente la resina alrededor de la muestra. Use una herramienta de recorte de diamante para recortar la muestra y use cuchillos de recorte de inclinación de 20 o 90 grados para asegurarse de que las superficies superior e inferior del bloque sean paralelas al filo de corte del cuchillo. Mezcle xileno y pegamento en una proporción de 3: 1 y use una pestaña unida a un palillo de dientes para aplicar la mezcla en los bordes superior e inferior del bloque recortado.

Mientras la mezcla se está secando, use una herramienta de escisión de obleas para cortar un trozo de oblea al tamaño apropiado para el análisis. Limpie la oblea en agua destilada para enjuagar cualquier residuo y limpie la superficie con plasma después de que la oblea esté seca. Para preparar un cuchillo de tomografía de matriz, use cinta adhesiva espumosa para unir una aguja al fondo de un cuchillo jumbo histo y coloque el cuchillo en el soporte de ultra microtomo a cero grados.

Ajuste el borde de la cuchilla paralela a la superficie del bloque y lleve el bloque recortado al borde de la cuchilla en una posición lista para la sección. Coloque la oblea limpia en el recipiente del cuchillo y llene el recipiente con agua al mismo nivel que el filo del cuchillo, luego, deje que el borde de diamante del cuchillo se humidifique correctamente, usando la jeringa adjunta para agregar o extraer agua según sea necesario. Para la seccionamiento de la matriz, configure el microtomo en un rango de corte de 50 a 100 nanómetros y una velocidad de corte de 6 a 1 milímetros por segundo, y comience la sección para obtener una cinta lo suficientemente larga como para cubrir un volumen Z objetivo.

Dependiendo del tamaño del bloque, la homogeneidad del tejido y el tipo de resina, la cinta será aproximadamente recta. Use una punta limpia y no pegajosa de una pestaña para separar las cintas del filo del cuchillo. Use la pestaña para mover suavemente la cinta hacia el centro del medio de soporte.

Se puede usar cloroformo o una pluma calefactora para estirar la sección si es necesario. Después del estiramiento, retraiga la jeringa para comenzar a drenar el agua. Para cintas más delicadas, o una retracción de agua más lenta, separe la jeringa de la manguera para dejar que el agua gotee.

Cuando el nivel del agua alcance el nivel de la oblea, empuje suavemente la cinta hacia el centro de la cuenca y continúe drenando hasta que toda el agua restante se elimine por completo de la cuenca. Deje que la oblea se seque en un ambiente limpio. El secado dura aproximadamente 30 minutos.

Cuando la muestra esté completamente seca, transfiera la matriz a una caja bien cerrada para protegerla de la contaminación por suciedad. Y coloque la caja en un horno de 60 grados centígrados durante al menos 30 minutos. Para adquirir un mapa general de imágenes SEM que revele las ubicaciones de las secciones en la oblea, use la cámara óptica incorporada para adquirir una imagen SEM que cubra una cinta de secciones.

Para crear un mosaico, haga clic y arrastre la imagen de la cámara de la muestra e inicie la adquisición automática. Adquiera descripciones generales a mayor resolución para encontrar estructuras objetivo. Si solo es necesario crear imágenes de unas pocas secciones, utilice el visor con zoom para ver las imágenes adquiridas en sus ubicaciones originales.

Una vez que se haya identificado una sección que debe visualizarse en alta resolución, haga clic y arrastre para crear una región de imágenes, luego seleccione Configuración de imágenes de alta resolución y almacene la configuración en una plantilla Para encontrar eventos raros particularmente pequeños o difíciles de detectar, use la configuración de imágenes de alta resolución en cada 10ª sección o en una sección por cinta para crear manualmente una región de imágenes y adquirir las imágenes. A continuación, revise las imágenes y marque las secciones que contienen la región de interés. Para adquirir más de 10 secciones consecutivas, utilice el buscador de secciones para localizar todas las secciones automáticamente.

Si las imágenes de vista general no muestran regiones claras de interés, adquiera imágenes de mayor resolución de las secciones y utilice la función de vista previa de secciones para crear y adquirir las imágenes automáticamente. Para determinar la configuración óptima de la imagen, active la imagen en vivo en el software de control del microscopio y navegue a una región de interés, luego ajuste la configuración de la imagen hasta que las imágenes muestren regiones claras de interés, pero sin una adquisición de imagen excesivamente larga, de acuerdo con las pautas del fabricante. Para optimizar el posicionamiento de las regiones de imagen en secciones consecutivas, haga zoom a la imagen de interés y haga clic en Iniciar refinamiento de posición para aumentar la precisión de las ubicaciones de sección registradas.

Para definir una región de imagen, haga clic y arrastre en cualquier sección mientras mantiene presionada la tecla Alt y seleccione Crear matriz de conjunto de mosaicos en el menú contextual emergente. El software creará regiones de imágenes en la misma ubicación relativa en todas las secciones que se han encontrado o marcado previamente. A continuación, configure el recuento de píxeles, el tamaño de píxel, el diseño de mosaico y el tiempo de permanencia de píxeles en cada serie de imágenes según sea necesario.

Para configurar la función automática, cree una serie de imágenes independiente para las funciones automáticas, como se ha demostrado, y mueva la serie de imágenes a una posición en la sección que contenga estructuras de alto contraste. Establezca la serie de imágenes en 1024 x 884 píxeles y seleccione un tamaño de píxel correspondiente a la resolución más alta utilizada en la serie de imágenes. En la lista de funciones automáticas, marque Enfoque automático y Estigmatizador automático.

Seleccione Bisección en los controles de secuencia de adquisición y confirme que la imagen de la función automática es el primer elemento de la lista y, a continuación, haga clic en Adquirir todo para iniciar la adquisición de imágenes. Cuando se hayan creado y configurado todas las series de imágenes, las series se enumerarán en una cola de trabajos. La adquisición de baja resolución se puede realizar de forma manual o automática directamente en partes seleccionadas de la sección o en una sección completa utilizando imágenes individuales o en mosaico, seguidas de costuras.

Las imágenes del área seleccionada se pueden adquirir utilizando parámetros de alta resolución para visualizar mitocondrias, núcleos y microvellosidades, por ejemplo, Después de que se haya seleccionado la adquisición automática de mapas de mosaico resueltos, se pueden recortar varias regiones de interés o usarse para definir áreas de imágenes locales adicionales dentro de las regiones. Aunque diferentes tipos de células especializadas en el intestino de Drosophila se distribuyen al azar, se pueden distinguir visualmente después de examinar las imágenes utilizando parámetros de alta resolución, ya sea de secciones individuales o como una colección de imágenes en serie. Después de la alineación, las pilas se pueden renderizar utilizando diferentes soluciones de software.

El análisis de tomografía de matriz permite generar muchas secciones secuenciales en una sola oblea y examinarse utilizando parámetros de baja resolución para localizar las áreas generales de interés. Estas áreas pueden ser objeto de análisis posteriores utilizando parámetros de adquisición avanzados. Por ejemplo, las divisiones mitóticas en el notum no son fáciles de localizar en el nivel ultraestructural, ya que las células son relativamente grandes en comparación con la zona de abscisión.

Sin embargo, utilizando este método, las imágenes automáticas de visión general de resolución media de los saltos de 20 a 40 secciones se pueden usar para localizar las células en división. El procedimiento de tomografía de matriz proporciona un análisis de datos de microscopía electrónica más sencillo. Alentamos a los espectadores a invertir en dominar la regeneración y familiarizarse con el flujo de trabajo relacionado con los mapas En nuestra experiencia, pocos temas de investigación requieren el análisis ultraestructural de animales enteros u órganos completos.

Nuestro método ayuda con la localización rápida de las células y sus socios de interacción en los tejidos.