Name: Un modelo de linfedema de cola murina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Aprende a establecer un modelo crónico de linfedema en cola de ratón usando nanotransfección tisular para entrega de material genético. Este método permite estudiar mecanismos y desarrollar estrategias terapéuticas innovadoras.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de subvención proporcionados por la Beca Académica de la Asociación Americana de Cirujanos Plásticos y el Departamento de Defensa W81XWH2110135   a AHH. Subvención de la Fundación de Educación e Investigación en Cirugía Estética a MS. NIH U01DK119099, R01NS042617 y R01DK125835 a CKS.

El protocolo sigue las directrices del comité de ética en investigación animal de la institución. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana. Los animales fueron alojados bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con comida y agua ad libitum.
1. Interrupción quirúrgica de los linfáticos de la cola de ratón
<ol><li>Use ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad de igual distribución de género.</li>
	<li>Coloque un ratón bajo anestesia general en una cámara de inducción con 3-4% de isoflurano en oxígeno al 100% seguido de sedación de mantenimiento al 1-3% durante el procedimiento.</li>
	<li>Administrar 0,5 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida (SR) por vía subcutánea para el control del dolor. NOTA: Medicamentos analgésicos adicionales administrados después de la operación: Carprofeno una vez cada 24 h durante al menos 48 h y Bupivacaína una vez después de que se realizó la incisión o antes de cerrar la incisión, aplicado goteando sobre los bordes de la piel (dura hasta 4 – 6 h).</li>
	<li>Coloque el ratón dorsalmente y prepare la cola con alcohol isopropílico al 70%.</li>
	<li>Mida el diámetro de la cola antes del procedimiento en incrementos de 5 mm a partir de 20 mm desde la base de la cola usando una pinza. Estas mediciones se utilizarán para calcular el volumen utilizando la ecuación del cono truncado37.</li>
	<li>Marque una escisión circunferencial de 3 mm en la cola a 20 mm de la base.</li>
	<li>Realice una meticulosa escisión de piel de 3 mm de espesor completo con una cuchilla quirúrgica estéril (tamaño 15), dejando intacta toda la vasculatura subyacente bajo aumento microscópico quirúrgico. Incise la marca circunferencial superior (20 mm desde la base de la cola) primero a través de la dermis seguido de una incisión circunferencial de espesor completo 3 mm distlal a la primera incisión.<ol>
<li>Haga una incisión vertical perpendicular de espesor completo para conectar las dos incisiones. Use una pastilla fina dentada para agarrar un borde de ataque y use microscisores para diseccionar cuidadosamente profundamente dentro del plano avascular a la dermis y superficial a la adventicia venosa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyecte 0,1 ml de azul isosulfán (1%) por vía subcutánea proximal a la punta de la cola.</li>
	<li>Identifique los dos canales linfáticos adyacentes a las venas laterales de la cola bajo el microscopio quirúrgico. Los linfáticos aparecerán azules debido a la inyección de isosulfán. Transecte los linfáticos usando tijeras microquirúrgicas rectas. Use las tijeras para diseccionar cuidadosamente un plano entre la vena lateral y la linfática. Luego pase la punta de una hoja de tijera entre el vaso linfático y la vena lateral y cierre las cuchillas para transectar el vaso linfático.</li>
	<li>Vístase la herida de la cola con un apósito transparente adherente estéril. Revise las incisiones postoperatorias diariamente para asegurarse de que no estén infectadas o sangrando y brinde cuidado de la herida durante 2 semanas.</li>
	<li>Alquila a los animales solos para evitar cualquier lesión adicional en la cola y para evitar que los animales se muerda entre sí, lo que conduciría a complicaciones quirúrgicas.</li>
</ol>2. Evaluación vascular de la cola con imágenes de contraste de manchas láser
<ol><li>Anestesiar el ratón como en el paso 1.2.</li>
	<li>Para usar imágenes de contraste de manchas láser para visualizar la vascularización de la cola, establezca el ancho en 0,8 cm, la altura en 1,8 cm, la densidad de puntos en alta, la velocidad de fotogramas en 44 imágenes / segundo, el tiempo en 30 segundos y la foto en color en 1 por 10 segundos.</li>
	<li>Evaluar la perfusión venosa y arterial para la permeabilidad. Cualitativamente, se debe visualizar la continuidad del flujo.</li>
</ol>3. Evaluación linfática funcional con angiografía láser de infrarrojo cercano
<ol><li>Anestesiar al animal como en el paso 1.2</li>
	<li>Reconstituir el verde de indocianina (ICG) (25 mg/10 ml) y administrar 0,1 ml por vía subcutánea en la cola distal del ratón cerca de la punta.</li>
	<li>Atenúa las luces de la habitación. Coloque la angiografía láser de infrarrojo cercano en un entorno de almacenamiento en búfer seguido de una captura en vivo.</li>
</ol>4. Entrega focal de carga de ácido nucleico a la cola de ratón utilizando TNT
<ol><li>Anestesiar al animal como en el paso 1.2.</li>
	<li>Exfolia la cola de ratón usando crema tópica exfoliante para la piel.</li>
	<li>Sumergir la cola de ratón en solución de colagenasa (10 mg/ml) a 37 °C durante 5 minutos.</li>
	<li>Cargue ADN en el depósito del chip TNT2.0 35.</li>
	<li>Coloque el dispositivo de chip de silicona TNT2.0 sobre el sitio focal deseado de entrega en la cola con nanoagujas en contacto con la cola.</li>
	<li>Coloque una sonda eléctrica positiva en el depósito. Conecte la sonda negativa a una aguja de 30 G e inserte la aguja por vía subcutánea en la cola hasta el sitio de entrega.</li>
	<li>Aplicar estimulación eléctrica de pulso de onda cuadrada (pulsos de 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).</li>
</ol>

<ol><li>Kataru, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+secondary+lymphedema%3A+chicken+or+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Translation+Research%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and secondary lymphedema: chicken or egg.</a> Translation Research. 209, 68-76 (2019).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses en competencia.

El linfedema se clasifica como una lesión primaria (congénita) o secundaria (linfática iatrogénica)38,39. El linfedema secundario comprende el 99% de los casos39. El linfedema secundario es más comúnmente causado por infección (filariasis) o tratamiento post-oncológico con linfadenectomía o radiación4,39. Un modelo animal traslacional es un desafío para el linfedema secundario, ya ...

El linfedema es la hinchazón de las extremidades causada por una disfunción linfática. La extremidad afectada se agranda debido a la acumulación de líquido, adiposo y fibrosis1. El linfedema afecta a 250 millones de personas en todo el mundo2,3,4. Se estima que el 20-40% de las pacientes que se someten a tratamiento para neoplasias malignas sólidas, como cáncer de mama, melanoma, tumores ginecológicos/urológicos o sarcomas, desarrollan linfedema2,4,5. La morbilidad por linfedema incluye infecciones recurrentes, dolor y deformidad6. No hay cura para esta enfermedad progresiva de por vida. Las terapias actuales son varias por efectividad7 e incluyen compresión, terapia descongestiva completa por fisioterapeutas, procedimientos de escisión y operaciones microquirúrgicas, incluida la transferencia vascularizada de ganglios linfáticos y el bypass linfovenoso7,8,9, 10,11,12,13,14. El tratamiento ideal para el linfedema aún no se ha descubierto.
El estudio del mecanismo y la terapia del linfedema ha sido limitado. Hay un retraso promedio de inicio de un año después de la lesión linfática15,16 y la mayoría de los individuos que experimentan lesión iatrogénica con radiación y cirugía no desarrollan linfedema4,6,17. Aunque se han descrito modelos animales grandes, incluidos caninos, ovejas y cerdos18,19,20,el modelo de cola de ratón ha sido el más ampliamente aplicado debido a la facilidad, el costo y la reproducibilidad. Los modelos de ratón para investigar el linfedema incluyen un modelo de cola, ablación linfática mediada por toxina difteria y disección de ganglios linfáticos axilares o poplíteos21,22,23,24,25,26. La mayoría de los modelos de cola utilizan una escisión focal de la piel de espesor completo con recorte del canal linfático que se realiza cerca de la base de la cola22,lo que resulta en hinchazón de la cola y características histológicas similares al linfedema humano24,27,28,29. Sin embargo, el modelo de cola murina estándar típicamente se resuelve espontáneamente en tan solo 20 días y se acompaña de necrosis de cola periódica30. El modelo de cola de ratón con linfedema extiende un linfedema sostenido más allá de las 15 semanas, demuestra permeabilidad arterial y venosa confirmada y permite la evaluación de la disfunción linfática funcional.
Un modelo de linfedema de cola murina permite la evaluación de nuevas terapias para tratar el linfedema. Se han utilizado estrategias basadas en genes en el modelo de ratón mediado por vectores virales31,32. También utilizamos una novedosa tecnología de nanotransfección tisular (TNT) para la entrega de carga genética a la cola linfedematosa del ratón. TNT facilita la entrega directa y transcutánea de genes utilizando un chip con nanocanales en un campo eléctrico de enfoque rápido33,34,35,36. El modelo incluye el uso de TNT2.0 para permitir la entrega focal de genes potenciales terapéuticos basados en genes al sitio de lesión linfática de la cola deratón 35.

<table><tbody><tr><td>Tegaderm Film</td><td></td><td>1626W</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico</td><td>Leica, Wetzlar, Alemania</td><td>MSV266</td><td></td></tr><tr><td>Apósito adherente (Tegaderm)</td><td>3M, St. Paul, Minn.</td><td>1626W</td><td></td></tr><tr><td>Moteado láser (Sistema Pericam PSI)</td><td>Perimed AB, Estocolmo, Suecia)</td><td>PSIZ</td><td></td></tr><tr><td>Láser de infrarrojo cercano (LUNA)</td><td>Stryker (anteriormente Novadaq Technologies, Toronto, Canadá)</td><td>LU3000</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 ratones</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Micro-Adson - 1x2 dientes</td><td>Fine Science Tools (EE. UU.) Inc.</td><td>11019-12</td><td></td></tr><tr><td>V-Hook</td><td>Fine Science Tools (EE. UU.) Inc.</td><td>18052-12</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí SS NO15</td><td>Fischer Scientific</td><td>29556</td><td></td></tr><tr><td>Aguja desechable 30GX1</td><td>Fischer Scientific</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>tijeras Fischer</td><td>Scientific</td><td>12-460-796</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de joyero quirúrgica, Sklar 4-1/2 en</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-118-4255</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte - rectas/afiladas-afiladas/ Herramientas de ciencia fina de 8 mm</td><td>(EE. UU.) Inc.</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Cardiogreen</td><td>Sigma</td><td>I2633-25MG</td><td></td></tr><tr><td>IsosulfánAzul (Linfazurina)&nbsp; 50 mg/5ml</td><td>Mylan</td><td>67457-220-05</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de linfedema de cola murina

A Murine Tail Lymphedema Model

El linfedema es la hinchazón de las extremidades causada por una disfunción linfática. La extremidad afectada se agranda debido a la acumulación de líquido, adiposo y fibrosis. No hay cura para esta enfermedad. Un modelo de cola de ratón que utiliza una escisión focal de piel de espesor completo cerca de la base de la cola, lo que resulta en hinchazón de la cola, se ha utilizado para estudiar el linfedema. Sin embargo, este modelo puede dar lugar a una comprendeción vascular y la consiguiente necrosis de la cola y la resolución temprana de la hinchazón de la cola, lo que limita su traducibilidad clínica. El modelo de linfedema crónico de cola murina induce linfedema sostenido durante 15 semanas y una perfusión confiable a la cola. Las mejoras del modelo tradicional de linfedema de cola murina incluyen 1) escisión precisa de espesor completo y recorte linfático utilizando un microscopio quirúrgico, 2) confirmación de perfusión arterial y venosa postoperatoria utilizando manchas láser de alta resolución, y 3) evaluación funcional utilizando linfangiografía láser de infrarrojo cercano verde de indocianina. También utilizamos la tecnología de nanotransfección tisular (TNT) para la nueva entrega focal no viral, transcutánea y de carga genética a la vasculatura de la cola del ratón.

La técnica para el modelo de cola de ratón para el linfedema sostenido se muestra en la Figura 1. La figura exhibe la anatomía relevante del modelo de cola de ratón. La Figura 2 demuestra la hinchazón progresiva y el linfedema persistente sostenido en la cola del ratón después de la inducción del linfedema. El volumen de la cola del ratón, calculado por la ecuación del cono truncado, alcanza su punto máximo en la semana 4 y se es...

El linfedema es la hinchazón de las extremidades causada por una disfunción linfática. Describimos un modelo de cola murina crónica de linfedema y el uso novedoso de la tecnología de nanotransfección tisular (TNT) para la entrega de carga genética a la cola.

Un modelo de linfedema de cola murina

Lymphedema is extremity swelling caused by lymphatic dysfunction. The affected limb enlarges because of accumulation of fluid, adipose, and fibrosis. ...

El linfedema es una afección crónica sin cura. Afecta a un tercio de las pacientes que se han sometido a una cirugía de ganglios linfáticos axilares y radiación en el tratamiento del cáncer de mama. Tener un modelo animal válido facilita la comprensión del mecanismo y el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento.El modelo de linfedema de cola de ratón es confiable y reproducible con el inicio rápido. Exhibe cambios histológicos consistentes con linfedema humano. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Ganesh Mohan, un post-doctorado de mi laboratorio.Para comenzar, coloque el ratón sedado de ocho semanas de edad por la esternón y prepare la cola con alcohol isopropílico al 70%. Use una pinza para medir el diámetro de la cola en incrementos de cinco milímetros a partir de 20 milímetros desde la base de la cola. Marque una escisión circunferencial de tres milímetros en la cola a 20 milímetros de la base.Bajo aumento microscópico quirúrgico, realice una meticulosa escisión de piel de tres milímetros de espesor completo dejando intacta toda la vasculatura subyacente. Incise la marca circunferencial superior primero a través de la dermis seguida de una incisión circunferencial de espesor completo tres milímetros distales a la primera incisión. Haga una incisión vertical perpendicular de espesor completo para conectar las dos incisiones, luego use una pastilla fina dentada para agarrar un borde de ataque y diseccionar profundamente dentro del plano avascular a la dermis y superficial a la adventicia venosa con micro tijeras.Inyecte 0,1 mililitros de azul isosulfán al 1% por vía subcutánea proximal a la punta de la cola. Identifique los dos canales linfáticos que aparecen azules debido a la inyección adyacente a las venas laterales de la cola. Transecte los linfáticos con cuidado, diseccionando un plano entre la vena lateral y la linfática con tijeras microquirúrgicas rectas.Pase la punta de una hoja de tijera entre el vaso linfático y la vena lateral y cierre las cuchillas para transectar el vaso linfático. Cuando termine, vista la herida de la cola con un direccionamiento transparente adherente estéril. Administrar verde de indocianina 0,1 mililitros por vía subcutánea en la cola distal del ratón cerca de la punta.Atenúe las luces de la habitación y luego coloque la angiografía láser infrarroja cercana en la configuración de almacenamiento en búfer y realice imágenes en vivo. Después de la administración de azul isosulfán en la punta de la cola, los linfáticos exhibieron color azul. Los linfáticos se interrumpieron mientras que las venas laterales adyacentes se conservaron.La hinchazón progresiva y el linfedema persistente sostenido en la cola del ratón después de la inducción del linfedema se muestran aquí. El volumen de la cola del ratón calculado por una ecuación de cono truncado, alcanzó su punto máximo en la semana cuatro y se estabilizó hasta la semana seis, seguida de una mejora gradual que se mantuvo hasta la semana 15. Se realizaron imágenes de contraste de manchas láser de alta resolución para confirmar la perfusión de la cola del ratón en el modelo de cola de linfedema que muestra venas laterales lesionadas y venas laterales intactas para la evaluación de la permeabilidad de la vasculatura de la cola.La linfangiografía con láser de infrarrojo cercano demostró linfáticos intactos preoperatorios y ningún tránsito de ICG más allá del sitio quirúrgico después de la operación, lo que confirma que la hinchazón fue causada por disfunción linfática. La eficiencia de la entrega de carga genética utilizando tecnología de nanotransfección de tejidos se demostró mediante la entrega de ADN etiquetado con amidita de fluoresceína a la cola murina. El uso de adaptaciones para el modelo de linfedema de cola de ratón y la angiografía láser de infrarrojo cercano ICG es un modelo animal clínicamente traducible y emocionante con implicaciones de tratamiento.

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Recientemente desarrollados utilizando técnicas de imagen de fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIRF) puede ayudar a dilucidar el papel del sistema linfático juega en la metástasis del cáncer, la respuesta inmune, la reparación de heridas, y otras enfermedades asociadas linfático.

No invasiva imágenes ópticas de la vasculatura linfática de un ratón

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Aprende a establecer un modelo crónico de linfedema en cola de ratón usando nanotransfección tisular para entrega de material genético. Este método permite estudiar mecanismos y desarrollar estrategias terapéuticas innovadoras.

Un modelo de linfedema de cola murina

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