Ingeniería genómica de células B humanas primarias usando CRISPR/Cas9

Este protocolo permite a los investigadores eliminar con precisión un gen en las células B, estudiar la pérdida de función, los efectos de ese gen o insertar un gen trans para la expresión estable de genes trans que se puede utilizar con fines terapéuticos o de investigación. La principal ventaja de este método es que proporciona una plataforma universal que permite diseñar células B de forma fácil y precisa con altas eficiencias. Este método se puede utilizar para diseñar células B para que expresen anticuerpos recombinantes o enzimas y luego transferir esas células B para tratar infecciones o enzimopatías.

Para comenzar, descongele las células B en un baño de agua a 37 grados centígrados. Mientras espera, transfiera dos mililitros de FBS precalentado a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Una vez que las células B estén completamente descongeladas, agregue inmediatamente un mililitro de FBS precalentado, gota a gota, a la muestra.

Incubar a temperatura ambiente durante un minuto. Pipetear suavemente para volver a suspender la muestra y transferir todo el volumen, gota a gota, a un tubo cónico que contiene dos mililitros de FBS precalentado. Lleve el volumen a 15 mililitros con PBS estéril, luego tape el tubo e inviértalo suavemente dos o tres veces.

Centrifugar la muestra a 400 veces G durante cinco minutos, luego desechar el sobrenadante sin alterar la pastilla de celda. Vuelva a suspender el pellet con un mililitro de medio de expansión de células B preequilibrado y cuente las células. El número total de celdas debe ser aproximadamente de 10 a la séptima celda.

Transfiera las células a un matraz que contenga 20 mililitros del medio de expansión de células B preequilibrado. La concentración final de las células, debe ser aproximadamente de cinco veces 10 a la quinta célula por mililitro. Incubar el matraz verticalmente en una incubadora de cultivo de tejidos.

Prepare el sustrato de transfección CRISPR/Cas9 mezclando un microgramo de sgRNA modificado químicamente con 1,5 microgramos de ARNm del núcleo Cas9 de Streptococcus pyogenes modificado químicamente por reacción de transfección. Para el control, agregue un microlitro de tampón TE, en lugar de sgRNA, en un tubo de 0,2 mililitros de una tira de ocho tubos. Encienda un electroporador y prepare los reactivos para infecciones nucleares.

Cuente y transfiera 1 millón de células B por reacción de transfección, a un tubo cónico estéril. Lleve el volumen a 15 mililitros con PBS estéril y centrifugue a 400 veces G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender las células con 10 mililitros de PBS estéril y centrifugue a 400 veces G durante cinco minutos, luego deseche el sobrenadante por completo sin alterar la pastilla celular. Agregue 0,5 microgramos de ARNm GFP modificado químicamente por cada 1 millón de células B al pellet de la célula. Vuelva a suspender el pellet con 20 microlitros de reactivo de transfección de células primarias por 1 millón de células B y mezcle suavemente pipeteando de cinco a seis veces.

Transfiera 20,5 microlitros por reacción de transfección a los tubos de 0,2 mililitros que contienen el reactivo CRISPR/Cas9. Pipetea hacia arriba y hacia abajo una vez para mezclar y transferir todo el volumen a una cubeta de transfección. Tape y golpee suavemente la cubeta en el banco para asegurarse de que el líquido cubra la parte inferior de la cubeta.

Utilice el protocolo de células B primarias humanas en el electroporador para la transfección. Deje reposar las celdas electroporadas en la cubeta a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, transfiera 80 microlitros del medio de expansión de células B preequilibrado a la reacción de transfección en la cubeta.

Coloque la cubeta en la incubadora de cultivo de tejidos durante 30 minutos. Coloque suavemente el cabezal un par de veces para mezclar y transferir todo el volumen de la muestra de la cubeta a un pocillo apropiado de una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos que contenga un mililitro del medio de expansión de células B. La concentración final de las células debe ser de 1 millón de células por mililitro.

Realizando un experimento de knock-in de genes, transfiera el vector viral de tipo seis asociado a adeno recombinante a 500.000 multiplicidades de infección al pocillo apropiado que contiene células electroporadas. Coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con humedad. En el experimento de knockout, el recuento de células B mostró más del 80% de células viables con una ligera reducción en la recuperación de células tanto en las muestras de control como en las muestras de knockout CD19 a las 24 horas después de la electroporación.

Las células B se recolectaron en el quinto día después de la transfección para la citometría de flujo y el análisis de mareas. Los diagramas de dispersión representativos de las muestras de control y knockout mostraron 14 y 95% de células negativas para CD19 respectivamente, lo que demuestra una reducción significativa en la expresión de CD19 en las muestras knockout. Los cromatogramas de secuenciación genómica mostraron picos dobles en las células B knockout CD19, lo que indica inserciones o deleciones de nucleótidos después de las roturas de doble cadena mediadas por CRISPR/Cas9.

El análisis de Indel de los cromatógrafos de las muestras knockout mostró un alto porcentaje de formación de indel en el locus CD19, lo que es consistente con el porcentaje de pérdida de proteínas CD19 detectado por citometría de flujo. Las células B del experimento knock-in se recolectaron el día 12, después de la ingeniería. Los diagramas de dispersión mostraron un 64% de células positivas para EGFP en la muestra que recibió el vector viral de tipo seis asociado a adeno recombinante, junto con RNP, mientras que se observó una positividad mínima o nula para EGFP en las muestras de control y solo vector, respectivamente.

Una amplificación de PCR de unión mostró amplicones de par de 1,5 kilobases en la muestra knock-in y no se observó ningún producto de PCR en la muestra de control o solo vectorial. Los recuentos de células mostraron que el proceso de ingeniería afecta la recuperación de células en la muestra knock-in más que en las muestras de control o de solo vectores. Sin embargo, todas las muestras se recuperaron rápidamente dentro de los tres días posteriores a la ingeniería.

Este procedimiento también se puede utilizar para introducir agentes editores de bases para alterar pares de bases individuales con el fin de inducir o corregir mutaciones de un solo punto en el genoma de las células B. También podría usarse para introducir codones de parada prematuros o para alterar los sitios de empalme, lo que permite múltiples eliminaciones de genes sin el riesgo de translocaciones cromosómicas. Antes de que se desarrollara esta técnica, la ingeniería de células B humanas indagaba en el uso de otros enfoques de ingeniería genética más desafiantes.

Esta técnica es una alternativa más fácil, menos costosa y más rápida. También podría utilizarse para sintetizar productos de terapia celular para uso clínico.