Un ensayo de citometría de flujo basado en ADN/Ki67 para el análisis del ciclo celular de células T CD8 específicas de antígeno en ratones vacunados
5 de enero de 2021
La expansión clonal es una característica clave de la respuesta de las células T específicas del antígeno. Sin embargo, el ciclo celular de las células T que responden a los antígenos ha sido poco investigado, en parte debido a limitaciones técnicas. Describimos un método citométrico de flujo para analizar células T CD8 específicas de antígeno en expansión clonal en bazo y ganglios linfáticos de ratones vacunados.
Nuestro protocolo proporciona un enfoque práctico mediante el cual el bazo de ratón y los ganglios linfáticos se pueden utilizar para reflejar la dinámica de la respuesta de las células T mayor que proporcionar una instantánea fenotípica en estado estacionario. Nuestra técnica detecta sensiblemente las células T CD8 específicas del antígeno que participan en una respuesta continua. Las células T CD8 en proliferación se miden sin los posibles efectos de confusión del tratamiento farmacológico in vivo o la transferencia celular.
Nuestra técnica puede proporcionar una ventana en la dinámica inmune en varios entornos. Por ejemplo, en relación con la respuesta a la vacunación y las infecciones, las enfermedades autoinmunes y la inmunoterapia contra el cáncer. Prepare un tampón de lavado de permeabilización fresco 1x diluyendo el tampón de permeabilización 10x con agua destilada y filtre a través de un filtro de 0.45 micrómetros para eliminar agregados.
Diluir el anticuerpo monoclonal Ki67 FITC en 1 tampón de lavado de permeabilización según lo determinado con un experimento de titulación para un volumen final de 100 microlitros por muestra. Agregue 3 mililitros del tampón de lavado de permeabilización 1x a cada tubo con células y centrífuga a 400 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.
Nuevamente, agregue el tampón de lavado de permeabilización 1x y la centrífuga para granular las células. Luego, deseche el sobrenadante. Agregue 100 microlitros de anticuerpo monoclonal diluido Ki67 FITC al pellet, luego vórtice e incube durante 30 minutos en la oscuridad.
Después de la incubación, lave las células dos veces con 4 mililitros de tampón de permeabilización 1x, centrifugando después de cada lavado y deseche el sobrenadante. Agregue 350 microlitros de PBS al pellet celular para que las muestras se adquieran directamente en el citómetro de flujo y 250 microlitros de PBS al pellet celular para que las muestras se incuben con Hoechst para la tinción de ADN. Prepare la solución de Hoechst y PBS y agréguela a cada muestra para que la concentración final sea de dos microgramos por mililitro.
Vórtice e incube las muestras durante 15 minutos en la oscuridad. Luego, centrifugue las muestras durante cinco minutos y agregue 350 microlitros de PBS al pellet celular. Abra el software y cree diferentes grupos correspondientes a los diferentes órganos que se analizarán haciendo clic en Crear grupo" en la sección de la cinta del espacio de trabajo.
Abra la ventana del grupo modificado haciendo doble clic en el nombre del grupo y sincronice los grupos recién creados insertando una marca de verificación en la función sincronizada. Arrastre cada archivo FCS a su grupo correspondiente y, a continuación, cree una estrategia de cierre que comience con el grupo a-LN. Abra la ventana del gráfico haciendo doble clic en la muestra completamente teñida para mostrar los eventos no restringidos adquiridos para la muestra en un diagrama de puntos.
Tenga en cuenta que los ejes x e y están etiquetados como en los archivos FCS, como se indica en la tabla dos del archivo de configuración del citómetro de flujo de este manuscrito. Compruebe que se muestra un número suficiente de eventos para una visualización adecuada. Si es necesario, abra las preferencias haciendo clic en el icono del corazón en la cinta del espacio de trabajo, seleccione Gráficos, luego Trazado de puntos "como tipo de gráfico" y verifique que el número de puntos dibujados en el cuadro correspondiente sea correcto o cámbielo.
Muestre los eventos no protegidos en la ventana del gráfico en un diagrama de puntos con DNA-A en el eje x y DNA-W en el eje y. Utilice la escala lineal para ambos ejes. Si es necesario, cambie la escala de logarítmica a lineal haciendo clic en el cuadro indicado con una T cerca de cada eje en la ventana del gráfico.
Seleccione una población de una sola celda haciendo clic en el rectángulo en la sección de la herramienta de cierre y luego haga doble clic en el centro de la puerta rectangular para mostrar celdas individuales en un diagrama de puntos con el parámetro FSC-A en el eje X y el troquel de celda muerta en el eje y. Haga clic en el polígono para seleccionar la población de células vivas, que son negativas para la muerte de células muertas. Haga doble clic en el centro de la puerta del polígono para mostrar las celdas en un diagrama de puntos con el parámetro FSC-A en el eje x y el parámetro SSC-A en el eje y.
Haga clic en el rectángulo y cree una puerta relajada para incluir todas las celdas vivas individuales en ese gráfico. Haga doble clic en el centro de la puerta relajada para mostrar las celdas en un diagrama de puntos con CD3 en el eje X y CD8 en el eje Y. Utilice la escala de acceso adecuada para la visualización en la ventana del gráfico.
Si es necesario, modifique la escala x e y haciendo clic en el cuadro, indicado con una T cerca de cada eje, elija Personalizar función de acceso y modifique las décadas de neg adicionales con bases y décadas positivas según sea necesario. Seleccione las celdas CD3+CD8+ haciendo clic en polígono. Haga doble clic en el centro de la puerta CD3+CD8+ para mostrar las celdas en un diagrama de puntos con Tetr-gag en el eje X y Pent-gag en el eje y.
Seleccione las células T CD8 específicas del antígeno haciendo clic en el polígono. Haga doble clic en el centro de la puerta específica de la mordaza para mostrar las células en un diagrama de puntos con ADN-A en el eje X y Ki67 en el eje y. Seleccione las celdas en las diferentes fases del ciclo celular haciendo clic en Quad" en la sección de la herramienta de cierre de la ventana del gráfico.
Copie la estrategia de cierre creada en una muestra al grupo correspondiente para aplicar las puertas a todas las muestras del grupo. A continuación, copie las estrategias de cierre para los grupos de bazo b y CBM, como se describe en el manuscrito de texto. Verifique que todas las puertas sean apropiadas para cada muestra de los tres grupos.
Si es necesario, desincronice el grupo y modifique las puertas como se describe en el manuscrito. Muestre las células BM de la puerta relajada en un diagrama de puntos con ADN-A en el eje x y Ki67 en el eje y. Visualice los resultados haciendo clic en Editor de diseño" en la sección de la cinta del espacio de trabajo.
Arrastre cada puerta de la estrategia de cierre en el panel de ejemplo al editor de diseño y coloque los gráficos de acuerdo con la secuencia del cierre. Si es necesario, cambie el tipo de gráfico haciendo doble clic en el gráfico correspondiente en el diseño y seleccionando el tipo apropiado en la ventana de definición del gráfico. Haga clic en el grupo e itere por funciones en la cinta de diseño para visualizar los resultados obtenidos en las células T CD8 específicas del antígeno de cada órgano y comparar diferentes muestras.
Visualizar resultados de células de médula ósea que representan un control positivo. Un ejemplo típico de análisis del ciclo celular de las células de la médula ósea se muestra aquí. El protocolo produjo un bajo coeficiente de variación de G0 a G1 y G2 a M picos de ADN, lo que indica una excelente calidad de la tinción de ADN.
Se empleó una estrategia de cierre de cinco pasos para identificar células CD8 específicas del antígeno. Se utilizaron dos multímeros para mejorar la sensibilidad de la detección de células T CD8 específicas de gag en ratones vacunados sin aumentar el fondo de tinción en ratones no tratados. Las células T CD8 específicas de Gag en los ganglios linfáticos drenantes y en el bazo contienen una alta proporción de células en las fases S-G2 / M en el tercer día después del impulso.
Además, las células T CD8 específicas de gag en las fases S-G2 / M tenían fsc-A y SSC-A altos cuando se superponían a las células T CD8 totales del mismo órgano. Los histogramas offset mostraron que la expresión de CD62L por las células T CD8 específicas de gag fue baja, como se esperaba para las células T activadas, a excepción de unas pocas células en G0 en los ganglios linfáticos. Este método está diseñado para que las células T logren una excelente calidad de tinción de ADN junto con la membrana y la tinción de Ki67.
El análisis de datos de citometría de flujo es un punto clave. Asegúrese de utilizar el control adecuado para el posicionamiento de la puerta. Usando este método, descubrimos células T en fases S-G2 / M del ciclo celular en sangre periférica de ratón y humano.
Esta técnica fue útil en estudios de inmunomonitorización en diabetes tipo 1, mononucleosis infecciosa y COVID-19.
Resumen
Este estudio presenta un método de citometría de flujo para analizar linfocitos T CD8 específicos de antígeno que se expanden clonalmente en el bazo y los ganglios linfáticos de ratones vacunados. La técnica permite la detección de respuestas de linfocitos T sin los efectos confusos del tratamiento con fármacos in vivo o de la transferencia de células.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Citometría de flujo
- Biología de linfocitos T
Antecedentes
- La expansión clonal es crucial para las respuestas de los linfocitos T específicos frente a antígenos.
- El ciclo celular de los linfocitos T en respuesta ha sido poco explorado debido a desafíos técnicos.
- Comprender la dinámica de los linfocitos T es esencial para obtener conocimientos sobre las respuestas inmunitarias.
- Este estudio aborda la necesidad de un método para analizar las respuestas de los linfocitos T en tiempo real.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para analizar linfocitos T CD8 específicos para antígenos in vivo.
- Proporcionar información sobre la proliferación de linfocitos T durante las respuestas inmunitarias.
- Facilitar el estudio de la dinámica de los linfocitos T en diversos contextos inmunológicos.
Métodos Utilizados
- Preparación de tampón de lavado de permeabilización fresco para la tinción celular.
- Uso del anticuerpo monoclonal Ki67 FITC para detectar linfocitos T en proliferación.
- Análisis citométrico por flujo para evaluar las poblaciones de linfocitos T y sus estados de activación.
- Estrategias de selección por compuertas para aislar linfocitos T CD8 específicos para antígenos a partir de poblaciones mixtas.
Resultados principales
- El método detecta con éxito linfocitos T CD8 específicos frente a antígenos que participan en respuestas activas.
- La proliferación de linfocitos T CD8 se puede medir con precisión sin variables de confusión.
- La técnica revela información sobre la dinámica de los linfocitos T durante la vacunación y la infección.
- Los resultados demuestran la utilidad de este método para estudiar enfermedades autoinmunes y la inmunoterapia contra el cáncer.
Conclusiones
- El método citométrico de flujo desarrollado es efectivo para analizar las respuestas de las células T.
- Este enfoque mejora la comprensión de la dinámica inmunitaria en diversos entornos.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para explorar el comportamiento de las células T en la salud y la enfermedad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la cuantificación precisa de la proliferación de linfocitos T CD8 específicos para un antígeno in vivo, abordando una laguna crítica en el inmunomonitorización para el desarrollo de vacunas y terapias inmunológicas. Al distinguir las fases G0, G1 y S-G2/M sin depender de análogos de nucleótidos ni de la dilución de colorantes, proporciona una instantánea mecanicista de la dinámica de expansión clonal. Esto respalda la validación de dianas y la identificación de candidatos principales al vincular el reconocimiento del antígeno con estados funcionales de proliferación en modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la correlación entre la especificidad del antígeno y la progresión del ciclo celular en linfocitos T respondientes.
- Valor operativo: Proporciona una lectura reproducible por citometría de flujo para la validación funcional del blanco, independiente de las limitaciones de BrdU o CFSE.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al cuantificar la proporción de linfocitos T específicos para el antígeno comprometidos con la mitosis frente a aquellos en G1 o G0.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayos: Genera salidas cuantitativas estandarizadas (ADN-A frente a Ki67) adecuadas para cribado de alto rendimiento de candidatos a vacunas o inmunomoduladores.
- Reproducibilidad: Utiliza Hoechst 33342 para una discriminación de alta resolución de picos de ADN, asegurando una separación consistente de G0/G1 y G2/M entre muestras.
- Escalabilidad: Compatible con el análisis de múltiples órganos (bazo, ganglios linfáticos, médula ósea) y adaptable a especies preclínicas para comparaciones entre estudios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Aplicable a estudios de eficacia de vacunas, como se ha demostrado en ratones vacunados con vectores HIV-gag que muestran enriquecimiento en la fase S-G2/M de linfocitos T CD8 específicos del antígeno.
- Continuidad traslacional: Conecta las fases de descubrimiento y preclínica al proporcionar una medida cinéticamente resuelta de la expansión de linfocitos T, predictiva de la magnitud de la respuesta inmunitaria.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Permite criterios de avance/no avance basados en la cinética proliferativa de clones específicos del antígeno, reduciendo la dependencia exclusiva de marcadores fenotípicos de punto final.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo la evaluación temprana de la capacidad proliferativa de los linfocitos T tras la inmunización e informando la optimización de candidatos líderes mediante el perfilado inmune funcional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al vincular el reconocimiento del antígeno (mediante multímeros de MHC) con el estado del ciclo celular, aclarando si el acoplamiento induce proliferación o anergia.
- Selección: Proporciona datos cuantitativos sobre la distribución del ciclo celular listos para ensayos, que permiten comparar plataformas de vacunas o los efectos de adyuvantes sobre la expansión de linfocitos T.
- Análisis: Genera lecturas multiparamétricas (contenido de ADN, Ki67, dispersión, especificidad antigénica) que permiten la comparación estadística de índices proliferativos entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica al identificar subpoblaciones de linfocitos T activados en división celular que se correlacionan con inmunidad protectora en modelos de infección y cáncer.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma inmunomonitorizadora reutilizable para estudios longitudinales en programas de enfermedades autoinmunes, infecciosas y de inmuno-oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al resolver la heterogeneidad proliferativa dentro de poblaciones de linfocitos T específicos del antígeno.
- Valor operativo: Proporciona estandarización mediante una estrategia de selección fija y tinción de ADN basada en Hoechst, minimizando la variabilidad entre ensayos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en candidatos inmunomoduladores basándose en la cinética funcional de los linfocitos T.
- Impacto en la cartera: Orienta el avance ajustado al riesgo mediante la cuantificación de la fracción proliferativa de linfocitos T específicos del antígeno como biomarcador de la calidad de la respuesta.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en citometría de flujo multicolor, incluyendo controles de compensación para las señales de FITC-Ki67 y Hoechst.
- Necesita acceso a un citómetro de flujo capaz de excitación UV para la detección de Hoechst 33342 y conjuntos de filtros adecuados.
- Exige protocolos estandarizados de permeabilización y lavado para preservar la integridad del epítopo para Ki67, multímeros y marcadores de superficie.
- Implica la optimización de la concentración de Hoechst (2 µg/mL) y del tiempo de incubación para evitar citotoxicidad mientras se logra una resolución óptima de los picos de ADN.
- Depende de una jerarquía adecuada de selección de eventos, comenzando con la exclusión de células simples y células vivas, para garantizar la identificación precisa de linfocitos T específicos del antígeno.
