Name: Evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprende ensayos accesibles para evaluar el metabolismo lipídico en ratones mediante ayuno y muestreo de sangre. Estos métodos simples facilitan estudios metabólicos in vivo sin equipos especializados.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH), subvención R00-DK114498, y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), subvención CRIS: 3092-51000-062 a Y. Z.

Los animales se alojan en condiciones estandarizadas siguiendo protocolos experimentales y de cuidado animal aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Baylor College of Medicine (BCM). Los animales son alimentados con una dieta estándar o especial, agua ad libitum, y mantenidos con un ciclo día/noche de 12 horas.
1. Medición de lípidos séricos en ayunas
<ol><li>Transfiera los ratones a una nueva jaula después de las 5 PM y rápido con acceso gratuito al agua, durante la noche (con alrededor de 16 horas de ayuno antes del experimento). El ayuno nocturno asegura el vaciado completo de los tractos gastrointestinales de los ratones. NOTA: Los ratones comen sus heces durante el ayuno, por lo que la abstinencia de alimentos no puede garantizar que estén adecuadamente ayunados.</li>
	<li>A la mañana siguiente, agarre el ratón por la cola y colóquelo en una superficie. Tire suavemente hacia atrás en la cola del ratón para colocar el ratón en el reteneddor. Coloque la sujeción nasal para volver a entrenar el movimiento del ratón mientras permite que el ratón respire. Apriete la perilla de la sujeción de la nariz. Controle los movimientos del pecho para asegurarse de que el animal esté respirando normalmente y minimizar el tiempo que un ratón pasa en los sujetadores.</li>
	<li>Haga una incisión superficial (nick) en la vena de la cola del ratón que se mueve libremente y extraiga 25 μL de sangre de la incisión en un capilar de vidrio (llenando aproximadamente 1/3 del capilar) sin restringir al ratón. Sople rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Detenga el sangrado con polvos estípticos, vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés.</li>
	<li>Complete la extracción de sangre para todos los ratones.</li>
	<li>Deje que la sangre coagule dejándola sin perturbar a temperatura ambiente durante 1 hora. Girar las muestras de sangre coaguladas a 2.000 x g a 4 °C durante 10 minutos en una microcentrífuga de sobremesa refrigerada y transferir sobrenadante (suero) para su análisis. NOTA: El suero se puede almacenar a –20 °C durante varias semanas hasta el análisis. Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga el suero a –70 ° C.</li>
	<li>Analice cada metabolito lipídico utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante.</li>
</ol>2. Prueba de tolerancia intralipídica oral
<ol><li>Después de las 5 PM, pese a los ratones para el cálculo del volumen intralípido que se les administrará al día siguiente. Luego, transfiera los ratones a una nueva jaula y ayunarlos durante la noche (16 horas).</li>
	<li>A la mañana siguiente, marque las colas de los ratones alojados en una jaula para ayudar a identificarlos en los pasos de sangrado posteriores.</li>
	<li>Haga un corte en la vena de la cola y extraiga 15 μL de sangre de la incisión en un capilar de vidrio (llenando aproximadamente 1/5 del capilar), y sople rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga para T = 0 suero. NOTA: No hay necesidad de detener el sangrado durante el ensayo a menos que los ratones muestren sangrado excesivo.</li>
	<li>Ratones de gavage 20% intralipídicos usando una aguja de gavage 18G en una proporción de 15 μl por gramo de peso corporal, utilizando el peso corporal previo al ayuno. Apila cada ratón en 1 minuto. NOTA: Pese al animal y determine el tamaño apropiado de la aguja de sonda. En general, una aguja de sonda de calibre 18 es apropiada para ratones >25 g, y una aguja de sonda de calibre 20-22 sería más apropiada para animales más pequeños. Desaliña el ratón, agarrando la piel sobre los hombros para mantener la cabeza del animal en su lugar. Coloque la aguja de sonda en la boca y luego avance suavemente a lo largo del paladar superior, hasta que se alcance el esófago. El tubo debe pasar sin resistencia. Una vez que se alcanza la profundidad adecuada, el Intralipid se puede administrar lentamente. Retire suavemente la aguja siguiendo el mismo ángulo durante la inserción de la aguja después de administrar el Intralipid. Devuelva al animal a la jaula y controle si hay signos de dificultad para respirar u otra angustia. NOTA: Los investigadores que no tienen experiencia con técnicas de sonda oral o sangrado de la cola pueden apilar cada ratón por 2 minutos o incluso más.</li>
	<li>Extraer sangre a T = 1, 2, 3, 4, 5 y 6 horas: Extraer 15 μL de sangre (1/5 capilar) por ratón a través del sangrado de la cola, y soplar rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Gire las muestras de sangre a 2.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos en una microcentrífuga. Transfiera el sobrenadante, incluida la capa de grasa flotante, a un tubo de PCR para su almacenamiento. El sobrenadante puede almacenarse a –20 °C durante varias semanas hasta el análisis. NOTA: El sobrenadante debe ser plasma. Si algunas muestras ya se han coagulado en el momento de la centrifugación, no afecta la medición de triglicéridos.</li>
	<li>Después de la última recolección de sangre, detenga el sangrado con polvos estípticos, vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés extremo.</li>
	<li>Cargue 2 μL de triglicéridos estándar y recoja los sobrenadantes en una placa de 96 pozos.</li>
	<li>Agregue 200 μL de reactivo de triglicéridos y deje que la placa se incube durante 5 minutos a 37 ° C para el desarrollo del color.</li>
	<li>Mida la absorbancia a 500 nm con una longitud de onda de referencia de 660 nm en un lector de placas de laboratorio y calcule la concentración de la muestra.</li>
</ol>3. β3 Agonista del receptor adrenérgico CL 316,243 Ensayo de lipólisis estimulada
<ol><li>Preparar CL 316,243 como una solución de caldo de 5 mg/ml (50x) en solución salina estéril, y almacenar a –20°C hasta su uso.</li>
	<li>Por la mañana, pesa a los ratones para calcular la cantidad de solución diluida de CL 316,243 necesaria para el experimento. El ratón recibirá 10 μL por gramo de peso corporal de CL diluido 316.243, para una dosis final de 1 mg/kg de peso corporal.</li>
	<li>Transfiera los ratones a una nueva jaula con acceso gratuito al agua y ayuna durante 4 horas.</li>
	<li>Haga suficiente solución 1x CL 316,243 de 50x stock usando solución salina. La concentración final de 1 solución CL 316.243 es de 0,1 mg/ml. Use solución salina para el grupo de tratamiento de control.</li>
	<li>Marque las colas de los ratones alojados en la misma jaula para una fácil identificación durante los pasos de sangrado.</li>
	<li>Haga un corte en la vena de la cola y extraiga 15 μL de sangre de la incisión en un capilar de vidrio (llenando aproximadamente 1/5 del capilar), y sople rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga para T = 0 muestra. NOTA: No hay necesidad de detener el sangrado durante el ensayo a menos que los ratones muestren sangrado excesivo.</li>
	<li>Inyecte la solución diluida de CL 316,243 (o control si se incluye en el experimento) por vía intraperitoneal a un volumen de 10 μL/g de peso corporal. Apila cada ratón en 1 minuto. Use un máximo de 5 ratones para cada experimento de 60 minutos, o 10 ratones para un equipo de dos personas.</li>
	<li>Extraer sangre en T = 5, 15, 30, 60 minutos: extraer 15 μL de sangre (1/5 capilar) por ratón a través del sangrado de la cola.</li>
	<li>Después de la última recolección de sangre, detenga el sangrado con polvos estípticos, vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés extremo.</li>
	<li>Girar muestras de sangre a 2.000 x g a 4 °C durante 5 minutos en una microcentrífuga refrigerada. Transfiera el sobrenadante a un tubo de PCR para su almacenamiento. El sobrenadante se puede almacenar a –20 °C durante varias semanas hasta el análisis.</li>
	<li>Cargue 1 μL de 2x estándares de glicerol diluido en serie (concentraciones equivalentes a trioleína de 0,156, 0,312, 0,625, 1,25 y 2,5 mg/ml) y recoja los sobrenadantes en una placa de 96 pozos. Agregue 100 μL de reactivo de glicerol libre y deje que la placa se incube durante 5 minutos a 37 ° C para que el color se desarrolle.</li>
	<li>Mida la absorbancia a 540 nm utilizando un lector de placas de laboratorio y calcule la concentración de la muestra.</li>
</ol>

<ol><li>Dixon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+chylomicron+uptake+into+lacteals%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, Suppl 1 52-57 (2010).</li>
<li>Nuno, J., de Oya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+lipase%3A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Cl%C3%ADnica+Espa%C3%B1ola%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein lipase: review.</a> Revista Clínica Española. 170 (3-4), 83-87 (1983).</li>
<li>Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+processes+that+handle+--+and+mishandle+--+dietary+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).</li>
<li>Burla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS-based+lipidomics+of+human+blood+plasma%3A+a+community-initiated+position+paper+to+develop+accepted+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines.</a> Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).</li>
<li>Umpleby, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+measurement+guidelines%3A+Tracing+lipid+metabolism%3A+the+value+of+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes.</a> Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).</li>
<li>Mitchell, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paired+sibling+analysis+of+the+beta-3+adrenergic+receptor+and+obesity+in+Mexican+Americans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).</li>
<li>Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caloric+restriction+in+C57BL%2F6J+mice+mimics+therapeutic+fasting+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans.</a> Lipids in Health and Disease. 5, 13(2006).</li>
<li>Hayek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fat+increases+high+density+lipoprotein+%28HDL%29+levels+both+by+increasing+the+transport+rates+and+decreasing+the+fractional+catabolic+rates+of+HDL+cholesterol+ester+and+apolipoprotein+%28Apo%29+A-I.+Presentation+of+a+new+animal+model+and+mechanistic+studies+in+human+Apo+A-I+transgenic+and+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).</li>
<li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+B%3A+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).</li>
<li>Tall, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+cholesterol+ester+transfer+protein+and+relationship+to+coronary+artery+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk.</a> Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).</li>
<li>Singh, A. K., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+and+cardiovascular+risk%3A+A+critical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal.</a> Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).</li>
<li>Miller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglycerides+and+cardiovascular+disease%3A+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).</li>
<li>Dron, J. S., Hegele, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Genetics of Hypertriglyceridemia.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 11, 455(2020).</li>
<li>Dole, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relation+between+non-esterified+fatty+acids+in+plasma+and+the+metabolism+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose.</a> Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).</li>
<li>Bartelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+activity+controls+triglyceride+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance.</a> Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).</li>
<li>de Souza, C. J., Burkey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+3-adrenoceptor+agonists+as+anti-diabetic+and+anti-obesity+drugs+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans.</a> Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).</li>
<li>Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-adrenergic+control+of+lipolysis+and+thermogenesis+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues.</a> Journal of Experimental Biology. 221, Pt Suppl 1 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los tres ensayos descritos funcionan de manera robusta en el laboratorio, con algunas consideraciones críticas. Se requiere ayuno nocturno para determinar los niveles de lípidos séricos en ayunas y la prueba de tolerancia intralipídica oral. Para la prueba de tolerancia intralipídica oral, es fundamental hacer girar la sangre a temperatura ambiente para minimizar la formación de una capa de grasa, especialmente en los puntos de tiempo de 1 y 2 horas; es importante no descartar esta capa de grasa si se forma. Asegúrese de...

Los carbohidratos y los lípidos son dos sustratos principales para el metabolismo energético. El metabolismo aberrante de los lípidos resulta en muchas enfermedades humanas, incluida la diabetes tipo II, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades del hígado graso y los cánceres. Los lípidos dietéticos, principalmente los triglicéridos, se absorben a través del intestino hacia el sistema linfático y entran en la circulación venosa en los quilomicrones cerca del corazón1. Los lípidos son transportados por partículas de lipoproteínas en el torrente sanguíneo, donde las partes de ácidos grasos son liberadas por la acción de la lipoproteína lipasa en órganos periféricos como el músculo y el tejido adiposo2. Las partículas remanentes restantes ricas en colesterol son eliminadas por el hígado3. Los ratones han sido ampliamente utilizados en laboratorios como modelo de investigación para estudiar el metabolismo de los lípidos. Con conjuntos de herramientas genéticas completas disponibles y un ciclo de reproducción relativamente corto, son un modelo poderoso para estudiar cómo se absorben, sintetizan y metabolizan los lípidos.
Debido a la complejidad del metabolismo de los lípidos, los sofisticados estudios de lipidómica o los estudios de trazadores isotópicos se utilizan generalmente para cuantificar colecciones de especies lipídicas o flujos y destinos metabólicos relacionados con los lípidos4,5. Esto crea un desafío masivo para los investigadores sin equipo especializado o experiencia. En este artículo, presentamos tres ensayos que pueden servir como pruebas iniciales antes de que se utilicen técnicas técnicamente desafiantes. Son procedimientos no terminales para los ratones y, por lo tanto, muy útiles para identificar diferencias potenciales en la capacidad de manejo de lípidos y reducir los procesos afectados.
En primer lugar, medir las moléculas de lípidos séricos en ayunas puede ayudar a determinar el perfil lipídico general de un ratón. Los ratones deben ayunar, porque muchas especies de lípidos aumentan después de las comidas, y el alcance del aumento se ve fuertemente afectado por la composición de la dieta. Muchas moléculas de lípidos, incluyendo el colesterol total, los triglicéridos y los ácidos grasos no esterificados (NEFA), se pueden medir utilizando un kit comercial y un lector de placas que puede leer la absorbancia.
En segundo lugar, una prueba de tolerancia intralipídica oral evalúa la capacidad de manejo de lípidos como un efecto neto de la absorción y el metabolismo. Un intralípido administrado por vía oral causa un aumento en los niveles circulantes de triglicéridos (1-2 horas), después de lo cual los niveles séricos de triglicéridos vuelven a los niveles basales (4-6 horas). Este ensayo ofrece información sobre qué tan bien un ratón puede manejar los lípidos exógenos. El corazón, el hígado y el tejido adiposo marrón son consumidores activos de triglicéridos, mientras que el tejido adiposo blanco lo almacena como una reserva de energía. Los cambios en estas funciones darán lugar a diferencias en los resultados de las pruebas.
Por último, promover la lipólisis para movilizar los lípidos almacenados se considera una posible estrategia para la pérdida de peso. La vía de señalización del receptor β3-adrenérgico en el tejido adiposo juega un papel importante en la lipólisis de adipocitos, y la genética humana ha identificado un polimorfismo de pérdida de función Trp64Arg en el receptor β3-adrenérgico correlacionado con la obesidad6. CL 316,243, un agonista específico y potente del receptor β3-adrenérgico, estimula la lipólisis del tejido adiposo y la liberación de glicerol. La evaluación de la respuesta de un ratón a CL 316,243 puede proporcionar información valiosa sobre el desarrollo, la mejora y la comprensión de la eficacia del compuesto.
Colectivamente, estas pruebas se pueden utilizar como una prueba inicial para detectar cambios en el estado metabólico lipídico de los ratones. Se eligen por la accesibilidad de los instrumentos y reactivos. Con los resultados derivados de estos ensayos, los investigadores pueden formar una imagen general de la aptitud metabólica de sus animales y decidir sobre enfoques más sofisticados y específicos.

<table><tbody><tr><td>20% Intralipid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I141</td><td></td></tr><tr><td>BD Jeringas estériles de punta deslizante 1ml</td><td>Shaotong</td><td>B07F1KRMYN</td><td></td></tr><tr><td>CL 316,243 Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5976</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de alimentación curvas (calibre 18)</td><td>Kent Scientific</td><td>FNC-18-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de glicerol libre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Solución estándar de glicerol</td><td>Sigma</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>SERIE HR NEFA-HR(2)REACTIVO DE COLOR A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>SERIE HR NEFA-HR(2)REACTIVO DE COLOR B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>SERIE HR NEFA-HR(2)DISOLVENTE A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>SERIE HR NEFA-HR(2)DISOLVENTE B</td><td>Fujifilm Wako Diagnóstico</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Kit de referencia de química Matrix Plus</td><td>Verichem</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tubos de centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-168</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de microhematrocrito, no heparanizado</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td></td></tr><tr><td>SOLUCIÓN ESTÁNDAR NEFA</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de triglicéridos Thermo Scientific Reactivos</td> para el colesterol total <td>Fisher Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientifi</td><td>TR13421</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

La evaluación del metabolismo lipídico es una piedra angular de la evaluación de la función metabólica, y se considera esencial para los estudios de metabolismo in vivo. Los lípidos son una clase de muchas moléculas diferentes con muchas vías involucradas en su síntesis y metabolismo. Se necesita un punto de partida para evaluar la hemostasia lipídica para la investigación de la nutrición y la obesidad. Este artículo describe tres métodos fáciles y accesibles que requieren poca experiencia o práctica para dominar, y que pueden ser adaptados por la mayoría de los laboratorios para detectar anomalías en el metabolismo de los lípidos en ratones. Estos métodos son (1) medir varias moléculas de lípidos séricos en ayunas utilizando kits comerciales (2) evaluar la capacidad de manejo de lípidos en la dieta a través de una prueba de tolerancia intralipídica oral, y (3) evaluar la respuesta a un compuesto farmacéutico, CL 316,243, en ratones. Juntos, estos métodos proporcionarán una visión general de alto nivel de la capacidad de manejo de lípidos en ratones.

Mostramos con tres extractos que cada ensayo ofrece información valiosa sobre el metabolismo lipídico de los ratones. Para los ratones machos C57BL / 6J, desafiados por ocho semanas de alimentación con dieta alta en grasas (HFD) a partir de las ocho semanas de edad, los niveles de colesterol total se elevaron significativamente, mientras que los triglicéridos séricos y NEFA no lo fueron (Tabla 1), lo que sugiere que los triglicéridos y NEFA en la sangre no están regulados predominantemente por un desafío...

Este documento proporciona tres ensayos fáciles y accesibles para evaluar el metabolismo de los lípidos en ratones.

Evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

La evaluación del metabolismo lipídico es una piedra angular de la evaluación de la función metabólica y se considera esencial para los estudios del metabolismo in vivo. Debido a la complejidad del metabolismo de los lípidos, generalmente se utilizan estudios lipidómicos sofisticados o estudios de trazadores isotópicos, lo que crea un desafío masivo para los investigadores sin equipo o experiencia especializados. Este protocolo demuestra ensayos fáciles y accesibles para evaluar el metabolismo de los lípidos en ratones.La demostración del procedimiento estará a cargo de Mingyang Huang, asistente de investigación del laboratorio Zhu. Comience transfiriendo ratones a una nueva jaula y ayunándolos durante la noche con libre acceso al agua durante 16 horas antes del experimento, lo que asegura el vaciado completo del tracto gastrointestinal de los ratones. A la mañana siguiente, haz una incisión superficial en la vena de la cola del ratón.Y extraiga 25 microlitros de sangre de la incisión en un capilar de vidrio. Sople rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga. Detenga el sangrado con polvos sépticos, luego vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés extremo.Realice la extracción de sangre en todos los ratones. Deje que la sangre se coagule dejándola sin tocar a temperatura ambiente durante una hora, luego centrifuga las muestras de sangre coaguladas a 2000 x g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos en una microcentrífuga de sobremesa refrigerada. Recoger el sobrenadante para el análisis de metabolitos lipídicos.Después de las 17:00 horas, pesar a los ratones para calcular el volumen intralipídico que se les dará al día siguiente. Luego, transfiérelos a una nueva jaula y asúbralos durante la noche. A la mañana siguiente, marque las historias de los ratones alojados en una jaula para ayudar a identificarlos en los siguientes pasos de sangrado.Haga una muesca en la vena de la cola y deje caer 15 microlitros de sangre de la incisión en un capilar de vidrio, y sople rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga para obtener suero T 0. Ratones sonda nasogástrica con 20% de intralípidos utilizando una aguja de sonda nasogástrica de calibre 18 en una proporción de 15 microlitros por gramo de peso corporal utilizando el peso corporal previo al ayuno. Extraiga sangre a las 1, 2, 3, 4, 5 y 6 horas.Centrifugar las muestras de sangre a 2000 x g durante 10 minutos en una microcentrífuga. Transfiera el sobrenadante, incluida la capa de grasa flotante, a un tubo de PCR para su almacenamiento. El sobrenadante puede almacenarse a menos 20 grados centígrados durante varias semanas hasta el análisis.Después de la última recolección de sangre, detenga el sangrado con polvos sépticos, vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés extremo. Cargue dos microlitros de triglicéridos estándar y sobrenadantes recolectados en una placa de 96 pocillos. Agregue 200 microlitros de reactivo de triglicéridos y deje que la placa se incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados para el desarrollo del color.Mida la absorbancia a 500 nanómetros con una longitud de onda de referencia de 660 nanómetros en un lector de placas y calcule la concentración de la muestra. Por la mañana, pesa los ratones para calcular la cantidad de solución compuesta diluida de CL 316, 243 necesaria para el experimento. Transfiera a los ratones a una nueva jaula con libre acceso al agua y acúchelos durante cuatro horas.Prepare suficiente solución compuesta 1X CL a partir del caldo 50X que se preparó disolviendo cinco miligramos de CL 316, polvo 243 en un mililitro de solución salina estéril o PBS. Utilice solución salina estéril o PBS para el grupo de tratamiento de control. Filtre a través de una unidad de filtro de membrana PES de 0,22 micras Millipore para esterilizar la solución.Marque las historias de los ratones alojados en la misma jaula para facilitar su identificación durante el paso de sangrado. Haga una muesca en la vena de la cola y extraiga 15 microlitros de sangre de la incisión en un capilar de vidrio, luego haga fluir rápidamente la sangre hacia un tubo de microcentrífuga para la muestra T 0. Inyectar solución compuesta de CL diluida por vía intraperitoneal a un volumen de 10 microlitros por gramo de peso corporal.Use un máximo de cinco ratones para cada experimento de 60 minutos o 10 ratones para un equipo de dos personas. Extraiga sangre a los 5, 15, 30 y 60 minutos después de la inyección. Después de la última recolección de sangre, detenga el sangrado con polvos sépticos, vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés extremo.Centrifugar las muestras de sangre a 2000 x g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos en una microcentrífuga refrigerada, luego transferir el sobrenadante a un tubo de PCR para su almacenamiento. El sobrenadante puede almacenarse a menos 20 grados centígrados durante varias semanas hasta el análisis. Cargue un microlitro de 2 veces los estándares de glicerol diluidos en serie y los sobrenadantes recolectados en una placa de 96 pocillos.Agregue 100 microlitros de reactivo de glicerol libre y deje que la placa se incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados para que se desarrolle el color. Mida la absorbancia a 540 nanómetros utilizando un lector de placas de laboratorio y calcule la concentración de cada muestra. Cuando los ratones machos C57BL6/J fueron desafiados por ocho semanas de una dieta alta en grasas, los niveles de colesterol total se elevaron significativamente.Mientras tanto, los triglicéridos séricos y los NEFA no lo fueron, lo que sugiere que los triglicéridos y los NEFA en la sangre no están predominantemente influenciados por el desafío crónico de la dieta alta en grasas. En la segunda cohorte de ratones, las subcepas de C57BL6 fueron alimentadas con la dieta alta en grasas durante ocho semanas a partir de las ocho semanas de edad. Se compararon sus niveles séricos de triglicéridos después de una exposición intralipídica oral.La subcepa 6/J tuvo un pico significativamente más alto en comparación con la subcepa 6/N, lo que indica una mayor absorción o un aclaramiento de triglicéridos mucho más lento. Para ratones C57BL6/J de ocho semanas de edad alimentados con comida normal, un solo tratamiento con CL 316, 243 condujo a un aumento significativo del glicerol sérico. Sin embargo, el pretratamiento intraperitoneal diario de ratones con el compuesto CL durante una semana condujo a una reacción embotada al tratamiento con el compuesto CL, lo que sugiere un rápido desarrollo de resistencia al compuesto.La simplicidad es tanto el poder como la debilidad de este protocolo. No impone un obstáculo técnico significativo a los experimentadores, pero los resultados necesitan una interpretación cuidadosa. Para los estudios de seguimiento, se debe realizar la medición de una molécula lipídica específica mediante espectrometría de masas o lipidómica más completa.Por lo general, se utiliza una técnica de rastreo de isótopos para comprender el flujo del metabolismo de los lípidos.

assessing-whole-body-lipid-handling-capacity-in-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Se presentan sólidos métodos bioquímicos y microscópicos para el estudio...

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

De la lipogénesis de novo y la oxidación de ácidos grasos β-constituyen vías metabólicas claves en los hepatocitos, las vías que son perturbados en varios trastornos metabólicos, incluyendo la enfermedad de hígado graso. Aquí se demuestra el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón y describimos cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β-y la lipogénesis.

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Aquí, se describen métodos optimizados para generar modelos in vivo e in vitro de esteatosis hepática y para analizar los fenotipos esteatóticos y los parámetros fisiológicos relacionados.

Análisis optimizada de<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; La esteatosis hepática

Este protocolo describe el uso de un analizador de composición corporal y el sistema metabólico de control animal para caracterizar la composición corporal y parámetros metabólicos en ratones. Un modelo de obesidad inducido por la alimentación alta en grasas se utiliza como un ejemplo para la aplicación de estas técnicas.

Composición corporal y análisis jaulas metabólico en ratones de reserva grasa alta

La lipidómica basada en espectrometría de masas de escopeta ofrece una instantánea cuantitativa sensible de un amplio espectro de clases de lípidos simultáneamente en una sola medición de varios tejidos de roedores.

Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

El presente protocolo describe un protocolo quirúrgico detallado para aislar la linfa intestinal que fluye en respuesta a infusiones de nutrientes intraduodenales en ratones. Esto permite la determinación fisiológica de la absorción total de lípidos intestinales y la síntesis y secreción de quilomicrones en respuesta a diversos nutrientes experimentales.

El aislamiento de la linfa mesentérica fluida en ratones para cuantificar la cinética in vivo de la absorción de lípidos en la dieta y la secreción de quilomicrones

La lipólisis de triglicéridos en los adipocitos es un proceso metabólico importante que resulta en la liberación de ácidos grasos libres y glicerol. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para medir la lipólisis basal y estimulada en adipocitos y tejido adiposo ex vivo de ratones.

Medición de la tasa de lipólisis en tejido adiposo murino ex vivo y preadipocitos primarios diferenciados in vitro

Este protocolo presenta un enfoque detallado para replicar un modelo murino de insuficiencia cardíaca inducida por hiperlipidemia con fracción de eyección preservada (HFpEF). El diseño combina la administración de virus adenoasociado al virus 9-troponina T de baja densidad con receptor de lipoproteínas de baja densidad (AAV9-cTnT-LDLR) y poloxámero-407 (P-407).

Un modelo murino de insuficiencia cardíaca inducida por hiperlipidemia con fracción de eyección preservada

El aclaramiento hepático de insulina es fundamental para regular la homeostasis de la glucosa. Este artículo describe un procedimiento de perfusión hepática fácil de usar para evaluar directamente la tasa de aclaramiento de insulina hepática in situ en ratones.

Evaluación del aclaramiento de insulina en ratones mediante perfusión hepática in situ

Estimulación eléctrica programada ofrece la posibilidad de determinar las propiedades de conducción del corazón, y la posibilidad de inducir arritmias cardíacas y terminar utilizando varios protocolos de estimulación. El uso de un catéter intravenoso, grabaciones electrograma intracardíaco se puede obtener en ratones después de programar protocolos de estimulación eléctrica para identificar los sustratos arritmogénicos.

La estimulación eléctrica programada en ratones

Aprende ensayos accesibles para evaluar el metabolismo lipídico en ratones mediante ayuno y muestreo de sangre. Estos métodos simples facilitan estudios metabólicos in vivo sin equipos especializados.

Evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones

Explorar más videos