In vitro Time-lapse live-cell imaging para explorar la migración celular hacia el órgano de Corti

El método in vitro existente para investigar la migración de MSC incluye Transwell o protocolos de cicatrización de heridas. El método descrito aquí se puede utilizar para rastrear la migración de MSC para explantar en tiempo real. En cuanto al cultivo de explantes, la ventaja de este método frente a otros es que consigue una reducción de tiempo y coste, así como una simplificación de los pasos experimentales.

Esta técnica se puede utilizar para observar la localización de las células madre en el objetivo en tiempo real, lo que lleva al desarrollo de modelos con una eficiencia de localización optimizada. La remoción de la membrana tectorial es difícil para los investigadores sin experiencia. Dependiendo de la etapa de desarrollo, comprender el momento adecuado para eliminar la membrana tectorial es importante para el éxito de este protocolo.

Jeong-Eun Park y Dr.Su Hoon Lee, profesores investigadores de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. Comience esterilizando la campana de cultivo de tejido de flujo laminar encendiendo la luz ultravioleta durante aproximadamente 30 minutos. Rocíe todas las superficies con etanol al 70% antes de usar y deje que se sequen.

Coloque los instrumentos de disección en etanol al 70% durante 10 minutos, luego séquelos antes de usarlos. Después de decapitar a un ratón de tres a cuatro días de edad, remoje el prospecto en etanol al 70% y colóquelo bajo un microscopio en serie en la campana de flujo laminar. Remoje rápidamente el tejido en una solución de disección de tejido para eliminar el etanol.

Corte la línea central del cráneo con la cuchilla quirúrgica, luego exponga el cráneo tirando de la piel hacia abajo anteriormente y cortando el canal auditivo externo de la oreja. Corta desde la parte anterior a la parte posterior del cráneo a través de la línea del ojo, luego abre el cráneo y extirpa el prosencéfalo, el cerebelo y el tronco encefálico con pinzas romas. Con micropinzas, separe la cóclea del hueso temporal y transfiérala a una placa de Petri que contenga una solución de disección de tejido.

Diseccione cuidadosamente toda la cápsula ótica coclear, dejando solo el tejido blando interno de la cóclea. Sostenga el modiolo de la cóclea con pinzas y el conducto coclear con otro par de pinzas, luego separe lentamente los dos tejidos. Retire la estría vascular y la membrana tectorial despegándolas suavemente.

Coloque un cubreobjetos de plástico esterilizado en una nueva solución de disección de tejidos, luego coloque el órgano de Corti en el cubreobjetos asegurándose de que la membrana basilar mire hacia abajo. Inmovilice el tejido presionando la membrana de Reissner y el tejido restante de modiolo sobre el cubreobjetos con pinzas. Transfiera el cubreobjetos con el tejido incrustado al centro de un plato confocal de 35 milímetros.

Coloque el cilindro de clonación de vidrio en el plato con el explante coclear colocado en el centro del plato y agregue 100 microlitros de medio de cultivo de explantes en el cilindro. Coloque 5.000 células madre mesenquimales o MSC marcadas con GFP derivadas de la médula ósea en dos mililitros de medio de cultivo fuera del cilindro de vidrio y coloque la placa en la incubadora. Después de cultivar las células como se describe en el manuscrito del texto, aspire todo el medio dentro y fuera del cilindro y retire el cilindro de vidrio del plato confocal.

Agregue dos mililitros de medio de cultivo fresco al plato. Colóquelo en una incubadora humidificada hasta que esté listo para el análisis. Utilice un sistema de microscopía confocal con una incubadora de etapa superior.

Encienda el microscopio confocal, la luz fluorescente y la computadora. Establezca las condiciones de la incubadora superior de la etapa a 37 grados centígrados y 5% de atmósfera de dióxido de carbono. Coloque el plato de muestra en el recipiente de fijación de platos, cúbralo con la tapa de fijación de platos y cierre la cámara con la tapa del calentador superior.

Ajuste el zoom y el enfoque para localizar el órgano de Corti y MSC en el campo de visión. Abra el software de procesamiento de imágenes. En la opción de localización, seleccione un objetivo plano-apocromático de 20X o una apertura numérica de 0,8 y un área de recorte de 0,5X.

En adquisición, haga clic en configuración inteligente y seleccione EGFP. Abra la pestaña de canal en adquisición y configure la potencia del láser a 0.2%, el agujero de alfiler a 44 micrómetros, la ganancia maestra a 750 voltios y la ganancia digital a 1.0. Haga clic en ESID en la configuración de imágenes y establezca la ganancia ESID en cuatro y la ganancia digital en 7.5.

Haz clic en las fichas y en la estaca para producir 210 fichas. Abra la estrategia de enfoque y seleccione el modo de enfoque. En Series temporales, establezca la duración en 24 horas y el intervalo en 10 minutos.

En la adquisición, establezca el tamaño de fotograma en 512 por 512 píxeles, la velocidad de escaneo en ocho, la dirección en bidireccional, el promedio en 4X y los bits por píxel en 16. Haga clic en iniciar experimento para comenzar el experimento. El camino bidimensional de las células madre mesenquimales o MSC se rastreó en un método de cicatrización de heridas mediante el uso de un cilindro de vidrio como barrera entre las MSC y el órgano de Corti.

Cuando se cultivó el órgano de Corti, los fibroblastos crecieron muy rápidamente hacia afuera de las células ciliadas externas en la capa más externa. La mayoría de las MSC marcadas con GFP fueron expulsadas por fibroblastos de rápido crecimiento. Sin embargo, algunos penetraron en la capa de fibroblastos y migraron con éxito al órgano de Corti.

Los resultados de 72 horas de incubación mostraron que las MSC migraron al órgano de Corti y se localizaron principalmente en el modiolo y en el área con las fibras del nervio coclear separadas del modiolo. La morfología de las MSCs fue alterada a una forma radial similar a la de las fibras nerviosas. Las células se transformaron en una forma lineal a lo largo de la línea del limbo, en lugar del área de las células ciliadas.

Las MSC fueron capaces de migrar y crecer en el área de recolección de fibras nerviosas al penetrar las diversas capas celulares y barreras físicas. Cuando el daño a las células ciliadas fue inducido por un tratamiento de 16 horas con kanamicina y las células se cultivaron durante otras 72 horas después de la eliminación de la kanamicina, las MSC se localizaron no solo en el modiolus, sino también en las células ciliadas externas. La inmovilización del tejido es un paso importante en este protocolo donde se une el órgano de Corti.

No se cae fácilmente. Este es un consejo trivial, pero útil, para el éxito del cultivo de explantes. Este método puede adaptarse para estudiar la eficacia de los exosomas secretados por las MSC.