Name: Modelado del cáncer de mama en el tejido mamario humano utilizando un sistema microfisiológico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprende a mantener tejido mamario humano vivo ex vivo mediante un sistema microfisiológico para estudiar interacciones con cáncer de mama. Esta técnica preserva adipocitos, células inmunes y estructuras vasculares.

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Nos gustaría agradecer al Núcleo de Citometría de Flujo y Clasificación Celular de Tulane, así como al Núcleo de Histología de Tulane por su soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por la Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant y la National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Todos los tejidos humanos se recogieron de acuerdo con el protocolo #9189 aprobado por la Oficina de la Junta de Revisión Institucional de LSUHSC.
1. Siembra de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) para hojas celulares
<ol><li>Compre ASC de fuentes comerciales o aísle del tejido mamario humano primario siguiendo los protocolosestablecidos8,9. Semilla de ascs humanos del pecho en la densidad del 70% (área superficial ~80.000 cells/cm2) sobre las placas estándar de la cultura del tejido de 6 pozos en el medio modificado del águila de Dulbecco (DMEM) complementado con el suero bovino fetal del 10%, y la penicilina/la estreptomicina del 1% (medios de BC-MPS). Asegúrese de que los ASC que se utilizarán para formar las hojas de celdas deben ser menores que el pasaje 10.<ol>
<li>Para cada pocillo del sistema microfisiológico del cáncer de seno (BC-MPS) que será generado, las células de semilla en 1 pozo estándar de la cultura del tejido y 1 pocillo del tamaño similar en la placa plástica del tejido recubierta poli (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm). Una placa de 6 pozos de BC-MPS requerirá una placa estándar de cultivo de tejido de 6 pozos (inferior) y una placa recubierta de pNIPAAm (arriba). Las placas pNIPAAm se pueden comprar de fuentes comerciales o se pueden recubrir en el laboratorio10,11,12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultivo de ASCs en una incubadora de cultivo de tejidos a 37°C y al 5% deCO2. Cambie los medios cada 2-3 días en un gabinete de bioseguridad.</li>
	<li>Cultíe los ASC hasta que se vuelvan 100% confluentes y formen un patrón estriado. Dependiendo de la confluencia en la que fueron sembrados, esto tomará de 7 a 10 días. Las hojas confluentes de la célula se requieren para anclar el tejido adiposo boyante del pecho.</li>
</ol>2. Preparación de los suministros necesarios para BC-MPS
<ol><li>Para preparar la gelatina para placas de 6 pozos, haga una solución de gelatina al 12% en destiladoH2O. Mezcle 19 g de gelatina tipo B (concentración de gel de ~ 225 Bloom) y 125 mL de H2O en una botella de medio de vidrio de 250 ml. Añadir 1,6 mL de NaOH de 1 M a la solución para neutralizar el pH.</li>
	<li>Autoclave la solución bajo un ciclo líquido durante 25 min para esterilizar la solución.</li>
	<li>Deje que la solución se enfríe a 37 °C. En un armario de bioseguridad estéril añadir 16 mL de solución salina balanceada estéril de 10x Hanks (HBSS) a la solución para obtener un volumen final de 160 mL. NOTA: La solución de gelatina se puede utilizar de inmediato o almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior. La gelatina preparada es estable a temperatura ambiente durante 1 mes. Si sólo se necesitarán unos pocos émbolos, entonces se puede hacer una solución de 10 mL y filtrar estéril en el mismo día que se hace BC-MPS como se describió anteriormente7.<ol>
<li>Para preparar la solución de gelatina por esterilización por filtro, diluya 1 mL de 10x HBSS con 9 mL deH2O para hacer una solución de HBSS 1x en un tubo cónico de 15 mL. Añadir 100 μL de 1 M de NaOH a cada tubo de 10 mL y luego añadir 0,7 g de gelatina a la solución. Mezcle la solución vigorosamente para disolver la gelatina.</li>
		<li>Incubar el tubo en un baño de agua de 75 °C durante 20 min agitando cada 5 min. Use una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de 0,22 μm para filtrar la solución de gelatina. Filtre la solución de gelatina directamente sobre los émbolos en un gabinete de bioseguridad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impresión 3D o utilizar acrílico simple para hacer los émbolos utilizados para la transferencia de las hojas de la célula. Asegúrese de que los émbolos se ajusten holgadamente en el tamaño deseado del pozo. Un émbolo impreso en 3D estándar se muestra en la Figura 1. Los émbolos se pueden diseñar utilizando software de diseño asistido por ordenador estándar como TinkerCad e imprimirse utilizando impresoras 3D de filamentos que son compatibles con el ácido poliláctico (PLA)13,14.</li>
	<li>Para preparar un rack para sujetar los émbolos coloque un rack de tubo de 15 mL en un gabinete de bioseguridad. Coloque los émbolos boca abajo en el bastidor, de modo que la parte inferior de los émbolos esté boca arriba. Coloque una caja de plástico con una tapa para transportar BC-MPS en el gabinete de bioseguridad. Se recomienda que la caja tenga al menos 35,5 cm de largo x 28 cm de ancho x 8,25 cm de alto para adaptarse a 4 placas de BC-MPS. Retire la tapa de la caja y rocíe el estante, los émbolos y la caja con 70% de EtOH.</li>
	<li>Prepare cuchillas de afeitar estériles y pinzas de afeitar mediante autoclave o colocándolas en un gabinete de bioseguridad y lavándolas con 70% de EtOH.</li>
	<li>Rocíe los émbolos y la caja con 70% de EtOH y encienda la luz UV en el gabinete de bioseguridad durante al menos 30 minutos para esterilizar los suministros.</li>
</ol>3. Preparar émbolos de gelatina y aplicar a las hojas de células superiores
<ol><li>Si la solución de gelatina se preparó previamente, calentarla en un baño de agua de 37 ° C para derretirla.</li>
	<li>Pipetee la solución de gelatina sobre los émbolos en el gabinete de bioseguridad utilizando una pipeta serológica de 5 o 10 mL. Un émbolo para 1 pozo de una placa de 6 pozos requerirá ~ 2.5 mL de gelatina.</li>
	<li>Una vez que la gelatina se haya solidificado en los émbolos (~ 30-45 min) mueva las placas asc recubiertas de pNIPAAm al gabinete de bioseguridad. Coloque suavemente los émbolos en los pozos de las placas asc recubiertas de pNIPAAm para que la gelatina entre en contacto con los ASC. Coloque una arandela de metal (~ 7.5 g) en el émbolo para pesar el émbolo de modo que la gelatina esté en contacto directo con la hoja de células ASC. Deje los émbolos en las hojas de celdas ASC a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Mueva suavemente la placa con los émbolos en la caja estéril en el gabinete de bioseguridad y coloque la tapa sobre ella. Mueva la caja a una nevera de 4 °C durante 30 min. Si una nevera de 4 °C no está disponible, coloque la placa sobre hielo en un cubo de hielo en el gabinete de bioseguridad durante 30 min.</li>
</ol>4. Preparación de líneas celulares de cáncer
<ol><li>Sembra las líneas celulares de cáncer en un plato estándar de cultivo de tejido T75 y manténgalas en cultivo para que sean ~ 80% confluentes en el día en que se procesará BC-MPS. (Se necesitarán ~200,000 células cancerosas por BC-MPS). Cultivar las células cancerosas en medios normales. NOTA: Para identificar y aislar las células cancerosas se recomienda que las células se transfectan con una proteína fluorescente para distinguirlas de los ASC y del tejido mamario. El número de células cancerosas necesarias por BC-MPS se ha optimizado para las células MCF7 y MDA-MB-231. Otras líneas celulares pueden requerir una mayor optimización.</li>
	<li>El día en que se está preparando el BC-MPS, mueva el matraz que contiene las células cancerosas al gabinete de bioseguridad. Aspirar los medios del matraz. Lavar el matraz con 5 mL de PBS.</li>
	<li>Añadir 1 mL de solución de desprendimiento celular al matraz que contiene las células cancerosas y luego incubar el matraz en una incubadora de 37 °C hasta que las células se hayan desprendido (~2-5 min).</li>
	<li>En el gabinete de bioseguridad añadir 9 mL de PBS al matraz, transferir las células en PBS en un tubo cónico de 15 mL y contar el número de células utilizando un hemocitómetro.</li>
	<li>Centrifugar las células cancerosas a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Resuspend las células en medios BC-MPS de modo que haya 2 x 106 células/mL.</li>
	<li>Coloque las células cancerosas en un baño de agua de 37 °C hasta que estén listas para ser agregadas al tejido humano.</li>
</ol>5. Procesamiento del tejido mamario humano
<ol><li>En un gabinete de bioseguridad lavar el tejido mamario humano (HBT) 3x con 10 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Use fórceps estériles y una cuchilla de afeitar para picar toscamente el BC-MPS y trate de eliminar la mayor cantidad posible de fascia y tejido conectivo. Si no se extirpa el tejido conectivo, es posible que la capa superior del ASC no ancle correctamente el HBT. NOTA: La fascia y el tejido conectivo se pueden identificar por su aspecto blanco o claro en comparación con el color amarillo del tejido adiposo.</li>
	<li>Una vez que el tejido conectivo ha sido eliminado utilizar una cuchilla de afeitar estéril para picar finamente el tejido hasta que tenga una consistencia líquida homogénea. El tejido se inglesa finamente cuando se puede pipetear fácilmente utilizando una punta serológica de 25 mL.</li>
	<li>Use una cuchilla de afeitar estéril para cortar la punta de una punta de pipeta p1000 para ayudar a pipetear el HBT picado.</li>
	<li>En un tubo de 1,5 mL, mezcle el HBT picado, las líneas celulares cancerosas y los medios BC-MPS (para 1 pozo de una placa de 6 pozos, esto requiere 200 μL de HBT picado, 100 μL de medios BC-MPS y 100 μL de células cancerosas).</li>
	<li>Mueva la placa ASC que se utilizará para la hoja de celda inferior de la incubadora al gabinete de bioseguridad. Aspirar el medio desde la placa ASC inferior. Pipetear la mezcla en el centro del pozo de la placa asc inferior utilizando una punta de pipeta p1000 que tenía el extremo distal cortado del paso 5.4</li>
	<li>Mueva la caja que contiene la placa ASC superior con los émbolos en ella al gabinete de bioseguridad. Retire suavemente los émbolos de gelatina de la placa recubierta de pNIPAAm y colóquele encima de la mezcla hbt. Agregue medios BC-MPS al pozo (para 1 pozo de una placa de 6 pozos agregue 2 mL de medios). Mueva cuidadosamente las placas ASC inferiores con la mezcla BC-MPS y los émbolos a la caja de plástico estéril y coloque la tapa de la caja para su transporte. NOTA: La tapa de la placa de 6 pozos no cabe de nuevo en la placa ASC mientras los émbolos están encendidos. Se debe tener cuidado para evitar contaminar la cultura.</li>
	<li>Incubar la placa inferior en la caja en una incubadora a 37 ° C hasta que la gelatina se haya derretido, y la capa superior de ASC haya comenzado a adherirse a la capa inferior (~ 30 min).</li>
	<li>Mueva la caja con las placas al gabinete de bioseguridad. Retire suavemente los émbolos de las placas inferiores. El tejido con las células cancerosas se anclará al fondo del pozo.</li>
	<li>Coloque la tapa de la placa de 6 pozos de nuevo en la placa inferior e incube a 37 ° C para fundir completamente la gelatina y permitir que la capa superior se ancle completamente a la capa inferior (~ 30-60 min).</li>
	<li>Mueva suavemente las placas a un gabinete de bioseguridad y aspire el medio con una pipeta serológica de 10 mL. Agregue 2 mL de medios frescos a cada pozo. Aspirar desde el borde del pozo y pipetear en el borde del pozo para evitar desalojar el tejido.</li>
	<li>Mantenga el BC-MPS a 37 °C y 5% de CO2 durante el período de tiempo deseado y cambie el medio cada 2-3 días.</li>
</ol>6. Digestión de BC-MPS para análisis
<ol><li>Cuando el BC-MPS esté listo para ser analizado, mueva la placa al gabinete de bioseguridad. Retire los medios con una pipeta serológica para evitar el despreocupamiento accidental de cualquier tejido.</li>
	<li>Agregue 1 volumen de PBS a cada pozo.</li>
	<li>Retire el PBS con una pipeta serológica.</li>
	<li>Agregue 1 mL de solución de disociación celular a cada pozo. Mueva la placa de vuelta a la incubadora e incube a 37 °C durante 5 min para permitir que las células se desprencien. En un gabinete de bioseguridad, use un raspador de células para separar completamente las células y el tejido de la placa de cultivo.</li>
	<li>Transferir la solución con el tejido a un tubo cónico de 15 mL utilizando una pipeta serológica. Agregue 2 mL de PBS a cada pozo para recolectar las células restantes y transferir esta solución al tubo cónico. Si las células son fluorescentes, envuelva el tubo en papel de aluminio para protegerlo de la luz.</li>
	<li>Incubar el tubo a 37 °C bajo agitación constante en una coctelera orbital a 1 x g durante 10-20 min para disociar completamente las células del tejido.</li>
	<li>En un gabinete de bioseguridad, utilice una pipeta serológica para interrumpir cualquier grupo restante de células en el tubo y filtrar la muestra a través de un colador de tejido de 250 μm en un nuevo tubo de 15 mL. Pipetear la solución lentamente a través del colador para que no se desborde.</li>
	<li>Enjuague el colador con 1 mL de PBS para recoger las células que aún están en el colador.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 500 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Después de la centrifugación, los adipocitos estarán flotando en la capa superior de la solución, mientras que las células cancerosas y los ASC se mezclarán en un gránulo en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Para aislar los adipocitos, vierta suavemente la capa superior en un nuevo tubo o, alternativamente, corte la punta de una punta de pipeta p1000 y transfiera la capa superior a un nuevo tubo. Centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min de nuevo y utilizar una jeringa y una aguja para extraer la solución de debajo de los adipocitos para que sólo queden los adipocitos. Los adipocitos ya están listos para el análisis</li>
	<li>Después de quitar los adipocytes de la solución, separe los ASCs y las células cancerosas el uno del otro para el análisis si las células cancerosas fueron transfectadas previamente con una proteína fluorescente. Aspirar la solución restante del tubo que contiene los ASC y las células cancerosas sin interrumpir el pellet celular. Resuspend el pellet en medios PBS o BC-MPS y utilice citometría de flujo para clasificar las células en función de la fluorescencia.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Se necesitan nuevos sistemas para modelar el cáncer de mama humano a fin de desarrollar una mejor comprensión de la enfermedad. El desarrollo de sistemas microfisiológicos humanos para modelar los ajustes de la enfermedad que incluyen ecm nativo y las células stromal aumentará el poder profético de estudios preclínicos. El modelo BC-MPS presentado aquí es un sistema de nuevo desarrollo que supera las limitaciones de los modelos anteriores permite la evaluación de BC en su entorno HBT nativo. Este sistema se puede utiliza...

Cada año, más de 40.000 mujeres estadounidenses mueren de cáncer de mama (BC)1. A pesar de más de $700 millones invertidos en la investigación de BC anualmente, el 97% de los fármacos candidatos a BC fallan los ensayos clínicos2,3. Se necesitan nuevos modelos para mejorar la cartera de desarrollo de fármacos y nuestra comprensión de BC. El Programa Microfisiológico (MPS) de los NIH delineó las características requeridas para los modelos innovadores para mejorar la traducción de la ciencia básica en éxito clínico4. Éstos incluyeron el uso de células o de tejidos humanos primarios, estables en cultura por 4 semanas, y la inclusión de la arquitectura nativa del tejido y de la respuesta fisiológica.
Los modelos actuales in vitro de BC, como el cultivo bidimensional de líneas celulares de BC, el co-cultivo de inserto de membrana y los esferoides y organoides tridimensionales, no cumplen con los criterios de MPS de los NIH porque ninguno de estos recapitula la arquitectura del tejido mamario nativo. Cuando la matriz extracelular (ECM) se agrega a estos sistemas, el ECM del pecho no se utiliza; en su lugar, se utilizan geles de colágeno y matrices de membrana basal.
Los sistemas in vivo actuales, tales como xenoinjertos derivados pacientes (PDX), semejantemente no resuelven los criterios de la P.M. de nih porque los tejidos mamarios murine diferencian grandemente de pechos humanos. Por otra parte, las interacciones del sistema inmune-BC se reconocen cada vez más como dominantes en el desarrollo del tumor, pero los modelos murine immunocompromised usados para generar tumores de PDX carecen de las células de T maduras, de las células de B, y de las células de asesino naturales. Además, mientras que PDX permite que los tumores primarios del pecho sean mantenidos y ser ampliados, los tumores resultantes de PDX se infiltran con las células murine primarias del estroma y ECM5.
Para superar estos desafíos, hemos desarrollado un nuevo, ex vivo, tridimensional mamario humano MPS que cumple con los criterios de NIH MPS. La base de nuestro MPS mamario se realiza intercalando tejido mamario humano primario (HBT) entre dos láminas de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC), también aisladas de HBT(Figura 1). Los émbolos para transferir las hojas celulares para emparedar el HBT pueden imprimirse en 3D o estar hechos de plásticos acrílicos simples (Figura 1H,I). Esta técnica adapta nuestro enfoque previamente descrito para el cultivo de tejido de adipocitos blancos humanos primarios6,7. El MPS del pecho se puede entonces sembrar por un modelo de BC de la opción, extendiéndose de variedades de células estándar de BC a los tumores humanos primarios del pecho. Aquí, mostramos que estos BC-MPS son estables en cultivo durante varias semanas(Figura 2); incluyen elementos nativos de hbt tales como adipocytes mamarios, ECM, endotelio, células inmunes (Figura 3); y recapitular las interacciones fisiológicas entre BC y HBT como la diafonía metabólica(Figura 4). Por último, mostramos que BC-MPS permite el estudio del movimiento ameboide de las células BC a lo largo de hbt (Figura 5).

<table><tbody><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>1333</td><td>Solución de desconexión celular para la separación de BC-MPS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td>Solución de desprendimiento de células para el paso de células</td></tr><tr><td>BioStor Container 16oz</td><td>National Scientific Supply Co</td><td>MPCE-T016</td><td>Para el transporte de tejido estéril Cultivo celular Matraces de</td></tr><tr><td>75 cm</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Para el cultivo de ASCs</td></tr><tr><td>Tubos Cónicos 15mL&nbsp;</td>Pinzas curvas <td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoScientific</td><td>1631T5</td><td>Para maniobrar el tejido mientras se pica...</td></tr><tr><td>DMEM bajo en glucosa, con Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td>Para el cultivo de ASC y BC-MPS</td></tr><tr><td>FBS Qualified</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Nunc UpCell Placas de 6 pocillos</td><td>ThermoScientific</td><td>174901</td><td>Top Hoja de celda ASC</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pluma/Estreptococo 5.000U</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 150 cm</td><td>FisherBrand</td><td>FB0875714</td><td>Para sujetar el tejido mientras se pica...</td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>Un solo filo para picar tejido</td></tr><tr><td>Colador 250um&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>87791</td><td>Para la separación de BC-MPS Cultivo de</td></tr><tr><td>tejidos Placas de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Célula ASC inferior Pesos de hoja</td></tr><tr><td>/arandelas</td><td>BCP Sujetadores BCP672</td><td></td><td>Para pesar émbolos de hasta 1/2" de diámetro interior</td></tr></tbody></table>

modelado del cáncer de mama en el tejido mamario humano utilizando un sistema microfisiológico

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

El cáncer de mama (BC) sigue siendo una de las principales causas de muerte entre las mujeres. A pesar de más de $700 millones invertidos en la investigación de BC anualmente, el 97% de los fármacos candidatos a BC fracasan en los ensayos clínicos. Por lo tanto, se necesitan nuevos modelos para mejorar nuestra comprensión de la enfermedad. El programa de sistemas microfisiológicos (MPS) de los NIH se desarrolló para mejorar la traducción clínica de los descubrimientos de la ciencia básica y las nuevas estrategias terapéuticas prometedoras. Aquí presentamos un método para generar las P.M. para los cánceres de seno (BC-MPS). Este modelo adapta un enfoque previamente descrito de cultivo de tejido adiposo blanco humano primario (WAT) intercalando WAT entre las hojas de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) s. Los aspectos nuevos de nuestro BC-MPS incluyen la siembra de células bc en el tejido mamario humano no enfermo (HBT) que contiene matriz extracelular nativa, adipocitos maduros, fibroblastos residentes, y las células inmunes; y intercalar la mezcla BC-HBT entre las hojas asc derivadas de HBT. El BC-MPS resultante es estable en cultivo ex vivo durante al menos 14 días. Este sistema modelo contiene múltiples elementos del microambiente que influyen en bc incluyendo adipocitos, células del estroma, células inmunes, y la matriz extracelular. Por lo tanto, BC-MPS se puede utilizar para estudiar las interacciones entre BC y su microambiente. 
Demostramos las ventajas de nuestro BC-MPS mediante el estudio de dos comportamientos de BC conocidos por influir en la progresión del cáncer y la metástasis: 1) la motilidad bc y 2) bc-HBT diafonía metabólica. Mientras que la movilidad de BC se ha demostrado previamente usando proyección de imagen intravital, BC-MPS permite la proyección de imagen de alta resolución del lapso de tiempo usando microscopia de la fluorescencia durante varios días. Además, mientras que la diafonía metabólica fue demostrada previamente usando las células de BC y los pre-adipocytes murine distinguidos en adipocytes inmaduros, nuestro modelo de BC-MPS es el primer sistema para demostrar esta diafonía entre los adipocytes mamarios humanos primarios y las células de BC in vitro.

Estabilidad en la cultura BC-MPS es un sistema microfisiológico estable que se puede cultivar in vitro durante al menos 14 días. Se tomó una imagen de campo brillante de las hojas de celdas ASC a un aumento de 100x para mostrar el patrón estriado de la hoja confluente (Figura 2A). Las hojas celulares de ASC son estables en cultivo durante al menos 4 semanas. BC-MPS a los 14 días en cultivo en un pozo de una placa de 6 pozos fue foto fotoiz...

Este protocolo describe la construcción de un sistema microfisiológico in vitro para estudiar el cáncer de seno usando el tejido humano primario del pecho con los materiales del estante.

Modelado del cáncer de mama en el tejido mamario humano utilizando un sistema microfisiológico

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Este es el primer protocolo que permite que el tejido mamario humano se mantenga vivo ex vivo durante períodos prolongados de tiempo, lo que permite directamente el estudio de las interacciones entre el tejido mamario humano y el cáncer de mama humano. La principal ventaja de esta técnica es que permite que las piezas macroscópicas de tejido mamario humano, incluidos los adipocitos mamarios, las células inmunes, las estructuras vasculares, las estructuras ductales y la matriz extracelular, se mantengan vivas ex vivo. Esta técnica tiene implicaciones importantes para varias áreas de la investigación del cáncer de seno incluyendo la medicina personalizada, el desarrollo farmacéutico y la patofisiología de la iniciación del tumor y de los procesos más lentos del cáncer de seno tales como fibrosis y remodelación extracelular de la matriz.Demostrando este procedimiento son Katherine Hebert, un estudiante graduado de Tulane y Rakesh Gurrala un estudiante de medicina de Tulane de mi laboratorio. Para empezar, derrita la solución de gelatina preparada en un baño de agua de 37 grados Centígrados. Utilice una pipeta serológica de cinco o 10 mililitros para dispensar 2,5 mililitros de esta solución en cada émbolo para los pozos de una placa de seis pozos.Una vez que la gelatina se haya solidificado, mueva las placas ASC codificadas pNIPAAm al gabinete de bioseguridad. Coloque suavemente los émbolos en los pozos de estas placas para que la gelatina entre en contacto con los ASC. Coloque una arandela de metal en el émbolo para pesarlo de modo que la gelatina esté en contacto directo con la hoja de ASC durante 30 minutos a temperatura ambiente.Mueva suavemente la placa con los émbolos en la caja estéril en el gabinete de bioseguridad y coloque la tapa sobre ella. Mueva la caja a una nevera de cuatro grados o coloque la placa sobre hielo y un cubo de hielo en el gabinete de bioseguridad durante 30 minutos. En un gabinete de bioseguridad, lave el tejido mamario humano tres veces con 10 mililitros de PBS estéril.Use fórceps estériles y una cuchilla de afeitar para picar toscamente el BC-MPS y trate de eliminar la mayor cantidad posible de fascia y tejido conectivo. Una vez que el tejido conectivo ha sido eliminado utilizar una cuchilla de afeitar estéril para finalmente picar el tejido hasta que tenga una consistencia líquida homogénea. Corte la punta de una punta de pipeta P1000 para ayudar a pipetear el tejido picado.En un tubo de 1,5 mililitros, combine el tejido picado, las líneas celulares de cáncer y los medios BC-MPS como se describe en el manuscrito del texto. Mueva la placa ACS que se utilizará para la lámina de celda inferior de la incubadora al gabinete de bioseguridad y aspire el medio de la placa. Pipetee la mezcla de tejido mamario preparado en el centro del pozo de la placa acs inferior utilizando la punta de la pipeta cortada, mueva la caja que contiene la placa ACS superior con émbolos al gabinete de bioseguridad.Retire suavemente los émbolos de gelatina de la placa recubierta de pNIPAAm y colóqueles sobre la mezcla de tejidos. Agregue medios BC-MPS al pozo y mueva cuidadosamente las placas ACS inferiores con la mezcla BC-MPS y los émbolos a la caja de plástico estéril. Coloque la tapa de la caja para el transporte, teniendo cuidado de evitar la contaminación de la cultura.Incubar la placa inferior en la caja y la incubadora de 37 grados Celsius hasta que la gelatina se derrita y la capa superior de ACS haya comenzado a adherirse a la capa inferior. Luego mueva la caja con las placas al gabinete de bioseguridad, retire suavemente los émbolos de las placas inferiores para observar el tejido con las células cancerosas ancladas al fondo del pozo. Coloque la tapa de la placa de seis pozos de nuevo en la placa inferior e incube a 37 grados para fundir completamente la gelatina y permitir que la capa superior se ancle a la capa inferior.Mueva suavemente las placas a un gabinete de bioseguridad y aspire el medio desde el borde del pozo con una pipeta serológica de 10 mililitros. Agregue dos mililitros de medios frescos en el borde de cada pozo para evitar desalojar el tejido. Mantenga el BC-MPS a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante el período de tiempo deseado.Cambiar los medios de comunicación cada dos o tres días. Mueva la placa al gabinete de bioseguridad cuando el BC-MPS esté listo para ser analizado. Retire los medios con una pipeta serológica para evitar el despreocupamiento accidental de cualquier tejido.Agregue un volumen de PBS a cada pozo. A continuación, retire el PBS con una pipeta serológica. Agregue un mililitro de solución de disociación celular a cada pozo y mueva la placa de vuelta a la incubadora durante cinco minutos para permitir que estas células se desprencien.Después de la incubación, use un raspador de células para separar completamente las células y el tejido de la placa de cultivo en un gabinete de bioseguridad. Transfiera la solución con el tejido a un tubo cónico de 15 mililitros y recoja las células restantes agregando dos mililitros de PBS. Envuelva el tubo con papel de aluminio si las células son fluorescentes.Incubar el tubo a 37 grados bajo agitación constante en una coctelera orbital a la vez G durante 10 a 20 minutos para disociar completamente las células del tejido. En un gabinete de bioseguridad, use una pipeta serológica para interrumpir cualquier grupo restante de células en el tubo. Y filtre la muestra a través de un colador de tejido de 250 micro metros en un nuevo tubo de 15 mililitros.Enjuague el colador con un mililitro de PBS para recoger las células restantes. Centrifugar las muestras a 500 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos para separar los adipocitos que estarán flotando en la capa superior de las células cancerosas y ascs mezclados en un pellet. Transfiera la capa de adipocitos a un nuevo tubo usando una punta de pipeta de corte romo.Centrifugar la muestra de nuevo y utilizar una jeringa y una aguja para extraer la solución restante de debajo de los adipocitos. Aspirar la solución restante del tubo que contiene los ASC y las células cancerosas sin interrumpir el pellet celular. Vuelva a suspender el pellet en medios PBS o BC-MPS y utilice citometría de flujo para clasificar las células en función de la fluorescencia.El patrón stri-aided de la hoja confluente de ASC se muestra aquí. El tejido humano boyante del pecho seguía siendo estable anclado por las hojas de la célula del ASC al fondo del pozo después de 14 días de cultura. Las imágenes fluorescentes de la microscopia demuestran la estabilidad del BC-MPS con MDA-MB-231 que expresa variedades de células de RFP después de 14 días y con el explant triple negativo PDX del tumor por lo menos seis días.BC-MPS que contenía tejido mamario se cultió in vitro durante 14 días, se manchó y se tiñeron la imagen para demostrar los elementos nativos del tejido a una ampliación de 100X y 20X. La coloración de los marcadores del macrófago fue utilizada para demostrar la preservación de macrófagos primarios después de tres y siete días en cultura. El análisis cytometry de flujo de las células manchadas Bodipy MDA-MB-231 después de 14 días indica la acumulación mínima del lípido en cultura 2D y la acumulación extensa del lípido y BC-MPS.La proporción de células positivas MDA-MB-231 del lípido era el doblez 26,2 mayor en BC-MPS que la cultura 2D. Las células cultivadas en BC-MPS exhibieron las gotitas del lípido del aumento comparadas a las células cultivadas en cultura 2D estándar. Las imágenes del lapso de tiempo de RFP etiquetaron BC-MPS con las células MDA-MB-231 demostraron el movimiento ameboide de 231 células con las pseudo vainas y la alta movilidad.El tejido mamario debe ser picado lo suficientemente pequeño y separado lo suficiente como para ser distribuido a través de la parte inferior del pozo. El tejido mamario es muy boyante y si las piezas son demasiado grandes o se agrupan demasiado juntas, las láminas celulares de ASC no podrán anclar el tejido mamario al fondo del pozo. Las construcciones resultantes del cáncer del tejido del pecho pueden experimentar la digestión enzimática para aislar tipos particulares de la célula de interés.Esto permitirá responder a preguntas clave como la forma en que las células cancerosas en el tejido mamario responden de manera diferente a la quimioterapia en comparación con el cultivo 2D tradicional o los organoides.

modeling-breast-cancer-human-breast-tissue-using-microphysiological

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Hemos desarrollado una base de colágeno en el ensayo in vitro, que promueve la proliferación y la invasión de las muestras de todos los subtipos de cáncer de mama. Tomografía óptica de proyección, una técnica de tres dimensiones se utilizó la microscopía para visualizar y cuantificar la expansión del tumor. Este ensayo puede ser utilizado para cuantificar la respuesta al fármaco de las muestras tumorales individuales.

A largo plazo la cultura de muestras humanas del cáncer de pecho y su análisis mediante tomografía óptica de proyección

En los métodos de cultivo estándar se toman células de su entorno fisiológico y se hicieron crecer en la superficie de plástico de un plato. Para estudiar el comportamiento de las células de médula ósea humana primaria hemos creado un sistema de cultivo de 3-D, donde las células se cultivan en condiciones que recapitulan el microambiente nativo del tejido.

Un tejido tridimensional Cultura modelo para estudiar primaria médula ósea humana y sus malignidades

El cáncer es una enfermedad compleja que se ve influenciada por el tejido que rodea al tumor, así como pro- local y anti-inflamatorias mediadores. Por lo tanto, los modelos de inyección de ortotrópicos, en lugar de los modelos subcutáneos pueden ser útiles para estudiar la progresión del cáncer de una manera que imita mejor la patología humana.

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Hemos desarrollado un nuevo modelo ex vivo para estudiar la acción de la hormona en el pecho humano. Se basa en microestructuras de tejido aisladas a partir de muestras de tejido de mama quirúrgicos que conservan la arquitectura del tejido, las interacciones intercelulares, y la señalización paracrina.

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudiar la acción hormonal en el pecho humano

Protocolos se describen para el estudio de la migración de células de cáncer de mama, la proliferación y la colonización en un sistema modelo de explante de tejido óseo humano.

Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico

Para estudiar la progresión del tumor de ovario en un modelo fisiológicamente relevante, esferoides multicelulares se cultivaron en un microdispositivo bajo un flujo de fluido simulado. Este modelo 3D dinámico emula el medio ambiente intraperitoneal con los componentes celulares y mecánicas donde se produce la metástasis del cáncer de ovario.

Modelización del comportamiento del cáncer de ovario en un esferoide multicelular Microdevice 3D dinámico peritoneal

Aquí, presentamos un protocolo para implantar las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de manera sencilla, menos forma invasiva y fácil de manejar, y este modelo Murino ortotópico mama cáncer con un entorno de almohadilla de grasa mamaria adecuada puede utilizarse para investigar diversos aspectos de la cáncer.

Ortotópico inyección de las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de ratones

El objetivo de este protocolo es describir un nuevo enfoque de modelado de cáncer de mama basado en la inyección intraductal de adenovirus Cre-expressing en las glándulas mamarias del ratón. Este enfoque permite la manipulación específica del tipo de célula y del órgano de los eventos oncogénicos de una manera controlada temporalmente.

Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón

La diafonía entre las células epiteliales mamarias y las células endoteliales contribuye de manera importante a la progresión del cáncer de mama, el crecimiento tumoral y la metástasis. En este estudio, los esferoides se han hecho de células de cáncer de mama junto con células endoteliales vasculares y / o linfáticas y demuestran su aplicabilidad como un sistema in vitro para la investigación del cáncer de mama.

Esferoides epiteliales y endoteliales mamarios como un modelo funcional potencial in vitro para la investigación del cáncer de mama

Este protocolo presenta un modelo de tumor en un chip fisiológicamente relevante para realizar investigaciones básicas y traslacionales de alto rendimiento sobre el cáncer humano, avanzando en la detección de fármacos, el modelado de enfermedades y los enfoques de medicina personalizada con una descripción de los procedimientos de carga, mantenimiento y evaluación.

Establecimiento de un modelo fisiológico de microtumor vascularizado humano para la investigación del cáncer

Este protocolo describe un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos que recapitulan características clave de la morfogénesis mamaria en un sistema de cultivo tridimensional controlado.

Un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos tridimensionales que recapitulan la morfogénesis mamaria

Aprende a mantener tejido mamario humano vivo ex vivo mediante un sistema microfisiológico para estudiar interacciones con cáncer de mama. Esta técnica preserva adipocitos, células inmunes y estructuras vasculares.

Modelado del cáncer de mama en el tejido mamario humano utilizando un sistema microfisiológico

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