Imágenes de perfusión doppler láser en el hindlimb del ratón

La ulceración cutánea con cicatrización inadecuada de heridas es una de las principales causas de amputación en pacientes humanos. La cicatrización adecuada de heridas requiere mayores niveles de profusión arterial que se necesitan para mantener la piel intacta, que se ve comprometida en pacientes con enfermedad arterial periférica. Varias otras afecciones reumatológicas y la diabetes también pueden conducir a microcirculación cutánea perturbada e inadecuada para curar heridas.

Muchos pacientes diabéticos tienen una enfermedad arterial periférica concomitante, lo que los coloca en un riesgo especialmente alto de amputación. Las imágenes de perfusión de Doppler láser o LDPI se utiliza en situaciones clínicas para evaluar la microcirculación de la piel, así como en situaciones de investigación para evaluar el flujo sanguíneo y la recuperación del flujo sanguíneo después de la isquemia hindlimb experimental, la reperfusión de isquemia y las aletas microquirúrgicas. El sistema LDPI proyecta un rayo láser de baja potencia que es desviado por un espejo de escaneo para moverse sobre una región de interés.

Esto difiere de la caudalmetría Doppler láser, que proporciona una medición de perfusión para el área pequeña de tejido en contacto directo con la sonda de diagrama de flujo. Cuando el rayo láser interactúa con la sangre en movimiento en la microvasculatura se somete a un cambio de frecuencia Doppler que es fotodetectado por el escáner y convertido en unidades de perfusión arbitrarias. Debido a que el LDPI es una técnica basada en la luz, se limita en términos de profundidad de penetración a 0,3 a 1 milímetro, lo que significa que en su mayor parte se evalúa la perfusión dérmica.

El flujo dérmico puede ser alterado por la temperatura de la piel y el sistema nervioso simpático, que puede verse afectado por varios agentes anestésicos. Las mediciones del láser óptico también se ven afectadas por las condiciones de iluminación ambiental, la pigmentación de la piel y pueden bloquearse mediante el exceso de piel o cabello. LDPI es la técnica de investigación más utilizada para monitorear la recuperación de profusión después de la isquemia porque no es invasiva, no requiere administración de contrastes y tiene tiempos de escaneo rápidos que permiten la recopilación de datos en varios animales.

Esto hace que sea ideal para ayudar a determinar si los tratamientos dirigidos a la arteriogénesis terapéutica o la angiogénesis son eficaces en modelos animales pequeños. La recuperación del flujo sanguíneo después de la isquemia del hindlimb medida por el LDPI se correlaciona bien con el desarrollo de arterias colaterales cuando se evalúa por otros medios, como la fundición por microllenda o la micro TC. El objetivo de este protocolo es demostrar la evaluación de la perfusión de hindlimb utilizando LDPI. Ajuste la altura del escáner para que la distancia al sujeto de escaneo sea de aproximadamente 30 centímetros.

Encienda el imager e inicie el software asociado. Abra el programa de medición. Si el software se comunica correctamente con el escáner, aparecerá la advertencia de encendido láser infrarrojo.

Ajuste la configuración del escáner para que sea adecuada para el material de fondo y la configuración de iluminación de la habitación. Establezca el umbral de fondo apuntando el rayo láser al material de fondo negro y pulse Auto BK Set. Instalar la cámara de inducción isoflurano con la limpieza adecuada de gas residual.

Colocar la cámara de inducción en una almohadilla de calentamiento ayudará a prevenir la pérdida de temperatura del ratón durante la inducción por anestesia. Encienda la manta homeotérmica, que se coloca en el área de escaneo debajo de una superficie no reflectante. En este caso, un tejido negro de neopreno.

La manta homeotérmica mantendrá una temperatura corporal de 37 grados centígrados. Coloque la sonda de temperatura y los lubricantes para que estén listos para su inserción. Coloque la máscara facial de anestesia y el sistema de barrido en el área de escaneo también.

Anestesia el ratón con un vaporizador isoflurano. La velocidad del oxígeno se establece en un litro por minuto de flujo. Y el isoflurano se ajusta al 4% para la inducción por anestesia.

El flujo se enciende en la cámara de inducción de anestesia y la frecuencia respiratoria del ratón se ralentizará. La anestesia adecuada se logra cuando el ratón pierde su reflejo corrector. Transfiera el ratón a un cono nasal de máscara anestésica con carroñero de gas residual unido y ajuste el isoflurano al 1,5% Este nivel de anestesia es generalmente adecuado para mantener al ratón tendido relativamente quieto durante la exploración, pero no está destinado a proporcionar niveles quirúrgicos de anestesia.

Así que la profundidad de la anestesia no se comprueba. Cambiar el nivel de isoflurano provoca cambios en la frecuencia cardíaca, la respiración y la profusión dérmica. Por lo tanto, se debe utilizar un porcentaje consistente a lo largo de cualquier experimento de curso de tiempo y para todos los sujetos experimentales.

También se pueden utilizar técnicas anestésicas alternativas, como la inyección de IP de ketamina xylazina, pero la misma técnica anestésica debe utilizarse a lo largo de cualquier momento del estudio, ya que diferentes anestésicos afectan la profusión dérmica de manera diferente. Si la región de interés del plan a escanear está cubierta por pieles, utilice una pequeña recortadora eléctrica y/o crema depilatoria para eliminar el cabello de la región de interés. Las cremas depilatorias deben eliminarse por completo y la piel del ratón seca antes de escanear como piel húmeda puede causar reflejos del láser Inserte la sonda de temperatura rectal lubricada asociada con la manta homeotérmica en el recto del ratón.

Equilibrar la temperatura del ratón para desear temperatura de escaneo, 37 grados Celsius. Esto puede tardar hasta cinco a 10 minutos. Seleccione Configuración del escáner a la que se puede acceder desde el menú superior o desde el icono Configuración del escáner.

El área de escaneado debe ajustarse cambiando las coordenadas X y Y para adaptarse a la región de interés. La velocidad de escaneo dependerá de la resolución del escaneo. Una resolución más alta dará lugar a tiempos de escaneo más largos.

Para la exploración repetida, centrándose en la profusión global, en lugar de una resolución más alta centrada en la perfusión anatómica, la velocidad de escaneo más alta de cuatro milisegundos por píxel es adecuada. Si realiza análisis repetidos, seleccione la pestaña Repetir y Analizar línea. El número de escaneos se puede cambiar.

En este caso, tres escaneos, así como el intervalo de repetición. El tiempo mínimo para el intervalo de repetición serían los tiempos estimados de escaneo que se muestran en el área atenuada a la derecha de la caja, determinada por el área de escaneo y la resolución de escaneo. Agregar unos segundos permite al usuario pausar y potencialmente cambiar la posición del ratón si es necesario entre escaneos.

El tiempo total de escaneo en este caso es de tres minutos y 21 segundos. Seleccione la pestaña Escaneo de imagen y seleccione el botón Marcar. Esto hará que el láser delinee el área de escaneo.

Ajuste la posición del ratón para que el destino a escanear esté dentro del área marcada. Inicie la medición repetida seleccionando el icono Repetir escaneado y pulsando el botón Reproducir para iniciar el análisis. Aparecerá una ventana emergente que confirme la distancia de escaneo.

Haga clic en Aceptar para iniciar la exploración. El escaneo inicial de un ratón antes de la inducción de isquemia hindlimb se muestra en tiempo real. El segundo y tercer escaneos repetidos se aceleran a una velocidad de 16x.

La ventana principal muestra los resultados de la exploración, ya que es generada por el software. El inserto en la parte inferior derecha muestra el láser escaneando las almohadillas del ratón. Para el footpad o footpad y el escaneo dorsal de la pantorrilla, el posicionamiento propenso con las extremidades posteriores extendidas hacia la cola proporciona una región más consistente de interés en el posicionamiento supina.

La arteria femoral, la arteria sapenosa y las garantías están muy cerca de la superficie ventral del muslo y la pantorrilla. Por lo tanto, se prefiere el posicionamiento supino si se utilizan estas regiones de interés. Supervise el ratón durante la exploración para detectar el movimiento del ratón.

Si el ratón se mueve lo suficiente como para que los blocs de pies ya no estén en la región de escaneado en medio de un análisis, reinicie el análisis. Pequeñas variaciones en la posición del bloc de pies del ratón se pueden acomodar en el software de análisis. Además, monitoree la temperatura del ratón durante el proceso de escaneo, ya que puede fluctuar incluso con el uso de la manta homeotérmica.

Si hay demasiada variación en la temperatura del ratón, esto puede resultar en variaciones significativas entre los escaneos. En general, un rango de temperatura de 36,8 a 37,2 dará lugar a datos aceptables. Guarde el análisis capturado en la ventana Guardar como con un nombre de archivo que incluya el identificador del mouse y el punto de tiempo para facilitar el análisis de datos.

Introduzca los detalles del ratón y del punto de tiempo si lo desea en la ventana Detalles del asunto. El escaneo posterior ventral con el ratón en posición supina se muestra aquí después de ajustar el área de escaneo. Tenga en cuenta que la propuesta con el ratón supina da como resultado una parte variable del lado del pie que se está escaneando.

Retire la sonda de temperatura rectal y desinfecte con 70% de etanol para que esté lista para el siguiente ratón. Disminuir isoflurano a 0%El ratón se recuperará más rápido si continúa recibiendo oxígeno, pero también se puede recuperar sin oxígeno suplementario. Permita que el ratón se recupere de la anestesia hasta el punto en que muestra un reflejo corrector volteando desde la posición supina a la posición propensa antes de devolverlo a la jaula.

La recuperación se puede llevar a cabo ya sea en una manta de calentamiento para isofluranos, ya que la recuperación es muy rápida o en una jaula de recuperación caliente para la ketamina xylazina. Abra el programa de software de revisión de imágenes. Se abrirá una nueva ventana para revisar los exámenes.

Vaya al menú Archivo, Abra y busque el archivo guardado. Seleccione el icono roi en la barra de herramientas. Seleccione el icono Agregar polígono.

Trace un área alrededor de la región de interés con el ratón. Cuando haya terminado, vuelva a la barra de herramientas y seleccione el icono Estadísticas. Esto abrirá una ventana que muestra las estadísticas de la región de interés.

En la revisión de datos, la unidad media de profusión, o PU, los valores no varían más de 100 a 150 PU sobre las exploraciones repetidas para cada almohadilla de pie. Este es un escaneo aceptable e indica que el ratón estaba bien equilibrado durante el escaneo. Los valores medios de PU con una variación superior a 100 a 150 UNIDADES, que corresponde a más del 10% de la perfusión media de una almohadilla de ratón no operada sobre los escaneos repetidos indicarían que el ratón no estaba bien equilibrado y se sugiere encarecidamente una exploración repetida.

Realizar un análisis rápido inmediatamente después de completar la exploración permite realizar una exploración repetida mientras el ratón todavía está anestesiado y evitar perder un punto de datos que podría ocurrir si los escaneos se analizan en una fecha posterior y un análisis se considera inaceptable debido a una variación significativa entre los escaneos repetidos. Los resultados se expresan como una proporción de profusión quirúrgica de hindlimb sobre la perfusión de hindlimb de control, ya que los ratones vasodilados inicialmente y luego desarrollan sus colaterales intrínsecos, la recuperación del flujo sanguíneo por LDPI debe verse en un curso de tiempo postoperatorio. El grado de recuperación depende de la tensión del ratón y la gravedad del modelo de isquemia del retroimen.

Esta cifra muestra un experimento de curso de tiempo completado durante 28 días donde LDPI se utilizó para medir la recuperación del flujo sanguíneo del footpad con el tiempo después de la ligadura de las arterias femorales y los ratones P27 knockout y wild tipo C57Bl/6. Ambos P27 knockout en ratones de tipo salvaje habían deteriorado la recuperación del flujo sanguíneo cuando se trata con doxiciclina oral, un inhibidor de la matriz generalizada metaloproteínsa, lo que sugiere que la actividad de MMP facilita la arteriogénesis. La configuración de ganancia y el umbral de fondo deben mantenerse constantes durante todo el experimento del curso de tiempo.

Si el umbral de fondo se establece demasiado bajo, escanear el material de fondo dará como resultado valores de profusión bajos. Esto dará lugar a que los valores de profusión en segundo plano se promediarán en la región de interés durante la selección de polígonos. Para eliminar este problema, el umbral de fondo se puede ajustar en la ventana Configuración del escáner en la pestaña General.

En este caso, el aumento del umbral de fondo a 118 unidades de profusión da como resultado un fondo gris que no se incluirá en ningún análisis. La paleta o escala de color de la imagen de flujo se puede ajustar tanto en el software de medición como en el software de revisión de imágenes. Todos los valores de profusión superiores al valor máximo de la escala se mostrarán como el color de profusión más alto.

En este caso, rojo. Aumentar el rango dinámico, por ejemplo, cambiar la escala a rango de cero a 1500, hará que la variación de escaneo repetido sea más obvia para el ojo, ya que las áreas que miden entre 1000 y 1500 unidades de profusión ahora se mostrarán usando el degradado de color en lugar de que todas se muestren como rojas. La exploración que se muestra aquí se obtuvo en un ratón cuya temperatura corporal central estaba inicialmente por debajo de 36.8 al comienzo de la exploración repetida y luego aumentó con respecto a las exploraciones repetidas.

Tenga en cuenta que la profusión media de la almohadilla del pie de control se vio más afectada por la temperatura corporal del núcleo más fría que la almohadilla isquémica. Una sola exploración de la temperatura corporal más fría habría dado lugar a una mayor relación de profusión que se registra para este punto de datos. La variación en la pigmentación de la piel del ratón, como se puede ver con ratones C57Bl/6, puede resultar en que el área de escaneo esté por debajo del valor umbral de fondo, lo que dificultará el análisis de las regiones de interés que contienen áreas pigmentadas.

Las almohadillas del ratón en general no tienen hiperpigmentación, por lo que esta es la zona más conveniente para buscar esta cepa del ratón. Si el investigador desea estudiar el hindlimb ventral, entonces se debe seleccionar una cepa de ratón blanco. El LDPI es un método eficaz, fácil de realizar y repetible para medir la profusión dérmica de hindlimb como reflejo de la perfusión arterial general.

Se requiere una técnica consistente cuando se utiliza LDPI para obtener datos confiables.