Un modelo de endotoxina reproducible orientado a la unidad de cuidados intensivos en ratas
20 de febrero de 2021
Aquí, presentamos un modelo de endotoxina reproducible orientado a la unidad de cuidados intensivos en ratas.
Este protocolo es un modelo robusto y reproducible de endotoxemia en el que los parámetros fisiológicos y moleculares pueden ser evaluados repetidamente. Este enfoque puede ayudar a responder preguntas en la investigación de la sepsis. Si bien nuestro modelo no reemplaza los experimentos con animales, refina los modelos de sepsis a través de la sedación continua y reduce el número de animales a través de muestreos repetidos.
Los principiantes pueden tener dificultades con la inserción de catéteres arteriales y venosos, pero solo se requiere una capacitación limitada para dominar estas técnicas. La visualización de toda la configuración experimental facilita a los investigadores configurar, o adaptar, sus modelos para imitar más de cerca una situación en la UCI. Comience transfiriendo el animal anestesiado a una estera calefactora.
Manteniendo la temperatura corporal entre 36,5 y 37 grados centígrados. Asegúrese de que el animal esté respirando espontáneamente proporcionando oxígeno con un cono nasal. Confirmar el nivel de anestesia por la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie antes de la instalación de la traqueostomía y los catéteres arteriales y venosos.
Use un ungüento para proteger los ojos. Prepare instrumentos quirúrgicos estériles y catéteres junto con el monitoreo de la presión y la saturación de oxígeno para una oxigenación suficiente. Aplique un torniquete en la cola proximal de la rata para facilitar el acceso venoso y desinfecte la cola tres veces con alcohol.
Introduzca un catéter intravenoso de calibre 26 en una de las dos venas laterales de la cola evitando la inyección de aire. Desatara el torniquete después de colocar el catéter intravenoso y fije el catéter intravenoso en su lugar con cinta adhesiva. Conecte las bombas de jeringa con llaves de paso de tres vías al acceso intravenoso para la aplicación continua de líquidos y medicamentos.
Comience la traqueostomía afeitando el área anterior del cuello del animal y luego desinfecte la piel afeitada tres veces con solución de povidona yodada. Realice una incisión longitudinal de dos centímetros utilizando una hoja de bisturí número 10. Retraiga la piel con 2-0 suturas de seda.
Luego preparó sin rodeos la laringe y la tráquea para abrirla con tijeras quirúrgicas. Inserte una cánula traqueal estéril en la tráquea, teniendo cuidado de no penetrar demasiado profundamente para evitar la ventilación unilateral. Fije la cánula en su lugar usando una sutura de seda 2-O y luego conecte la cánula a un ventilador para ventilación por presión o volumen controlado.
Defina los protocolos de reemplazo de líquidos, los protocolos de aplicación del vasoconstrictor y los criterios de aborto antes de configurar el experimento. Desinfecte la cola de la rata tres veces con solución de povidona yodada y luego corte el círculo de la piel un centímetro longitudinalmente en el lado ventral con un bisturí, teniendo cuidado de no cortar demasiado profundamente para evitar una lesión de la arteria de la cola. Use un microscopio quirúrgico para exponer la arteria con cuidado.
Corte la fascia que rodea la arteria con micro tijeras quirúrgicas. Luego ligar la parte distal de la arteria realizando sutura de seda proximal 6-0, pero no apriete la seda. Introduzca un catéter de calibre 26 en la arteria entre la sutura de seda distal y proximal, y luego apriete la sutura de seda proximal para fijar el catéter en su lugar.
Conecte el catéter a un transductor de presión para proporcionar una medición continua de la presión arterial. Además, coloque una llave de paso de tres vías entre el catéter conectado al transductor de presión y el catéter de calibre 26 para la toma de muestras de sangre arterial. Después de que el animal ha alcanzado un estado estacionario, indujo sepsis inyectando LPS y recolectando muestras de sangre.
Reemplace la pérdida de líquido de las muestras de sangre por la solución de Ringer en una proporción de uno a cuatro, evitando la inyección de aire en todo momento para evitar la embolia de aire. La presión arterial media se mantiene estable en animales con y sin estimulación lps. Los animales tratados con LPS desarrollan características de sepsis, como el exceso de base negativa.
Los animales tratados con LPS también desarrollaron una fuerte reacción inflamatoria, que fue medida por citoquinas plasmáticas, como la proteína quimioatrayente-1, la proteína quimioatrayente de monocitos-1 y la interleucina-6. Al intentar este protocolo, recuerde predefinir los regímenes de líquidos y vasopresores, así como definir los criterios de terminación para obtener datos de investigación sólidos y reproducibles. Este protocolo se puede adaptar a otros modelos de sepsis.
Por lo tanto, una pregunta de investigación se responde con el enfoque más adecuado y de acuerdo con los principios de reducir, refinar, reemplazar el bienestar animal.
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Descripción general
Este artículo presenta un modelo robusto y reproducible de endotoxemia en ratas, diseñado para investigaciones orientadas a la unidad de cuidados intensivos. El modelo permite la evaluación repetida de parámetros fisiológicos y moleculares, lo que contribuye a la investigación sobre sepsis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Investigación sobre sepsis
- Modelos animales
Antecedentes
- La endotoxemia es una afección crítica en la sepsis.
- Los modelos existentes a menudo requieren un uso extenso de animales.
- La sedación continua puede perfeccionar los enfoques experimentales.
- El muestreo repetido puede proporcionar más datos a partir de menos animales.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo que imite las condiciones de la UCI.
- Facilitar evaluaciones repetidas de las respuestas fisiológicas.
- Mejorar el uso ético de los animales en la investigación.
Métodos Utilizados
- Transferencia de ratas anestesiadas a una alfombra calefactora.
- Colocación de catéteres arteriales y venosos.
- Monitoreo continuo de parámetros fisiológicos.
- Visualización del montaje experimental para una mejor adaptación.
Resultados principales
- El modelo es reproducible y robusto para estudios de endotoxemia.
- Se pueden evaluar repetidamente parámetros fisiológicos y moleculares.
- Reduce el número de animales necesarios para experimentos.
- Facilita la capacitación de principiantes en técnicas de inserción de catéteres.
Conclusiones
- Este modelo mejora el estudio de la sepsis de manera controlada.
- Proporciona un marco para investigaciones futuras en cuidados intensivos.
- Ofrece un enfoque más ético para la investigación con animales en sepsis.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo de endotoxina orientado a la UCI permite la evaluación reproducible de parámetros fisiológicos y moleculares en la investigación de la sepsis, posibilitando pruebas iterativas de intervenciones terapéuticas mientras se reduce el uso de animales mediante muestreos repetidos. El modelo se alinea con los principios de las 3R y facilita la evaluación preclínica de compuestos moduladores de la sepsis en condiciones clínicamente relevantes de sedación, ventilación y monitorización hemodinámica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar vías inflamatorias como la señalización de TLR4 y las cascadas de citoquinas (por ejemplo, MCP-1, IL-6) en un entorno de endotoxemia controlada.
- Valor operativo: Proporciona lecturas reproductibles de parámetros hemodinámicos e inflamatorios para estudios de interacción con dianas y modulación de vías.
- Valor científico: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al vincular intervenciones moleculares con resultados fisiológicos como la presión arterial media y el exceso de base.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera parámetros fisiológicos y citocinas plasmáticas cuantificables adecuados para la vinculación de biomarcadores en el estudio de la fisiopatología de la sepsis.
- Valor operativo: Protocolos estandarizados de reanimación con fluidos y uso de vasopresores garantizan condiciones basales consistentes para el cribado de compuestos.
- Valor científico: Permite la toma repetida de muestras sanguíneas del mismo animal, aumentando la densidad de datos por sujeto y mejorando la reproducibilidad del ensayo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Refleja el manejo clínico en la unidad de cuidados intensivos, incluyendo ventilación mecánica, monitorización continua de la presión arterial y uso de norepinefrina, lo que aumenta la relevancia traslacional.
- Valor operativo: Los criterios definidos de terminación y los protocolos de reposición de líquidos favorecen la realización estandarizada de estudios preclínicos y la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor científico: Facilita la evaluación de marcadores de disfunción orgánica multisistémica, apoyando decisiones de avance ajustadas al riesgo en el desarrollo de terapias para la sepsis.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El modelo se integra en la continuidad del descubrimiento de la sepsis, desde la validación de dianas hasta las pruebas preclínicas de eficacia, especialmente para compuestos que tienen como diana la hiperinflamación o la disfunción vascular.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre dianas inmunomoduladoras mediante respuestas medibles de citocinas y hemodinámicas al desafío con LPS.
- Tamizaje: Permite sistemas biológicos listos para ensayos, con fenotipos de sepsis estandarizados, para la evaluación de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos que incluyen la presión arterial media (PAM), exceso de bases y citocinas plasmáticas (MCP-1, IL-6) para el análisis de respuesta a la dosis y la interacción con la diana.
- Investigación Traducional: Reproduce protocolos de atención en la UCI, mejorando la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de terapias para la sepsis.
- Reutilización Empresarial: Los procedimientos establecidos de cateterización, ventilación y monitoreo permiten la reutilización de la plataforma en múltiples estudios sobre mecanismos de la sepsis.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante fenotipos de sepsis reproducibles y cascadas inflamatorias medibles.
- Valor operativo: Procedimientos quirúrgicos y de monitoreo estandarizados mejoran la reproducibilidad y reducen la variabilidad entre experimentos.
- Valor estratégico: La reducción del número de animales mediante muestreos repetidos disminuye la carga de recursos y apoya vías preclínicas éticas.
- Impacto en el portafolio: Permite tomar decisiones tempranas de avance o interrupción al proporcionar lecturas mecanicistas y fisiológicas que reducen los riesgos en las hipótesis sobre objetivos de sepsis.
Consideraciones de Implementación
- Experiencia en cateterización vascular de roedores y técnicas quirúrgicas estériles.
- Instrumentación para la transducción de la presión arterial, control del ventilador y análisis de gases en sangre.
- Protocolos estandarizados para la reanimación con fluidos, dosificación de vasopresores y mantenimiento de la temperatura (36,5–37 °C).
- Consideraciones de adaptación para distintas cepas de ratas o condiciones comórbidas en la modelización de sepsis.
- Las limitaciones incluyen la complejidad técnica de la cateterización arterial y la necesidad de técnicas asépticas para prevenir infecciones que puedan interferir en los resultados.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:06
Anesthesia Induction, Animal Monitoring, Intravenous Access and Tracheostomy
3:06
Arterial Access, Baseline Measurement, Sepsis Induction and Follow-Up Measurements
4:37
Results: The Analysis of the Arterial Pressure, Sepsis and the Inflammatory Reaction in LPS-Treated and Non-Treated Animals
5:11
Conclusion
