Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón
22 de diciembre de 2020
Proporcionamos un protocolo paso a paso para la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo del nódulo sinoauricular (SAN) y el nódulo auriculoventricular (AVN) en corazones murinos.
Este protocolo explica los pasos necesarios para realizar microdisección, inmunofluorescencia de montaje completo, tinción y microscopía específicamente para el nódulo sinusal y el nódulo AV en el ratón. La metodología de montaje completo es ventajosa para abordar la localización y morfología 3D exactas del seno y el nódulo AV y para examinar la relación con el tejido circundante. La morfología del tejido se conserva considerablemente, con una mínima deshidratación tisular y rotura física.
Para comenzar, perfore el corazón con una aguja de calibre 27 en el área del ápice empujando cuidadosamente la aguja hacia el ventrículo izquierdo e inyectando suavemente de cinco a 10 mililitros de PBS helado para profusar el corazón. Levante con cuidado el corazón con una pinza y corte los vasos grandes para extraer el corazón. Coloque el corazón en una placa de disección llena de PBS helado bajo el microscopio de disección.
Después de determinar la orientación del corazón, gire el corazón para que la parte delantera del corazón quede en el fondo del plato. Inmovilice el corazón colocando pequeños alfileres a través del ápice y el apéndice auricular en la agarosa en el fondo de la placa de disección. Con pinzas finas y tijeras, retire cuidadosamente el tejido no cardíaco alrededor de la vena cava superior e inferior.
Para exponer la región intercava, extirpe la mayoría de los ventrículos cortando paralelos al surco entre los ventrículos y las aurículas con unas microtijeras. Para la fijación y deshidratación, coloque la muestra en paraformaldehído al 4% durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera el corazón a una solución de sacarosa al 15% y cobrólelo durante 24 horas a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, transfiera el corazón a una solución de sacarosa al 30% durante otras 24 horas a cuatro grados centígrados. Lavar el corazón en 1%Triton X-100 diluido en PBS. Luego bloquee y permeabilice en solución de bloqueo durante la noche a cuatro grados centígrados.
Coloque el corazón en un tubo de 1,5 mililitros e incube con anticuerpos Connexin 43 anti-ratón de conejo y anti-ratón HTN4 de rata diluidos con solución bloqueante durante siete días a cuatro grados centígrados. Después de siete días, retire la solución que contiene anticuerpos primarios con una pipeta. Lave el corazón con la solución 1%Triton X-100 tres veces durante una hora por lavado en el agitador orbital.
Repita los pasos de lavado después de la incubación con anticuerpos secundarios y DAPI. Después de preparar los anillos de plástico y llenarlos con plastilina, coloque el corazón en la ranura de plastilina con la parte posterior del corazón hacia arriba. Identifique la SAN, que se encuentra en el lado dorsal del corazón con la región intercaval.
Agregue PBS al corazón para desplazar todo el aire dentro de la cavidad hasta que el corazón esté completamente cubierto con PBS. Aplica silicona en los bordes del anillo de plástico. Presione suavemente la parte circundante de la muestra en la plastilina para fijar el corazón y cubrir el corazón con un cubreobjetos.
A continuación, presione suavemente la parte posterior de la plastilina para exprimir un poco de PBS y sujetar el corazón a la cubierta con cuidado de evitar burbujas de aire dentro del área de la imagen. Coloque las muestras de tinción de montaje completo boca abajo en la plataforma del microscopio confocal y proceda con la obtención de imágenes como se describe en el manuscrito de texto. Los parámetros para cada canal del microscopio confocal se ajustan mediante el software correspondiente.
Este protocolo se utilizó para realizar imágenes de microscopía confocal tanto del ganglio sinoauricular como del ganglio auriculoventricular en corazones murinos. La tinción específica del sistema de conducción y del miocardio de trabajo con anticuerpos fluorescentes, dirigidos a HCN4 y Connexin 43 respectivamente, permite identificar el nódulo sinoauricular y el ganglio auriculoventricular dentro de la anatomía intacta. Este protocolo de tinción de montaje completo permite estudiar la interacción de diferentes tipos de células mediante el uso de varios anticuerpos.
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Resumen
Este protocolo explica los pasos para la tinción de inmunofluorescencia en preparación completa del nódulo sinusal (SAN) y del nódulo atrioventricular (AVN) en corazones de ratones. La metodología permite la localización tridimensional precisa y el examen de la morfología de estas estructuras cardíacas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología cardiovascular
- Técnicas de inmunofluorescencia
Antecedentes
- El nódulo sinusal (NS) y el nódulo auriculoventricular (NAV) son fundamentales para la función cardíaca.
- La inmunofluorescencia en preparaciones completas proporciona información sobre la morfología de estos nódulos.
- Esta técnica conserva la morfología del tejido con mínima deshidratación.
- Comprender la relación entre estos nódulos y los tejidos circundantes es esencial para la investigación cardíaca.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la tinción del nódulo sinusal (SAN) y del nódulo aurículoventricular (AVN) en corazones de ratón.
- Facilitar el estudio de la localización tridimensional de los nódulos cardíacos.
- Mejorar la comprensión de las interacciones del tejido cardíaco.
Métodos Utilizados
- Microdisección de corazones de ratón.
- Tinción de inmunofluorescencia en preparación completa.
- Microscopía para la visualización de tejidos teñidos.
- Uso de PBS frío con hielo para la preservación de tejidos.
Resultados principales
- Tinción exitosa del nódulo sinusal y del nódulo aurículoventricular en corazones de ratón.
- Se observó preservación de la morfología del tejido.
- Se logró una visualización clara de la localización tridimensional.
- Mejor comprensión de las relaciones de los nódulos cardíacos con los tejidos circundantes.
Conclusiones
- El protocolo es efectivo para estudiar el nódulo sinusal y el nódulo aurículoventricular en ratones.
- La inmunofluorescencia en montaje completo es una técnica valiosa en la investigación cardíaca.
- Estudios posteriores pueden basarse en esta metodología para obtener conocimientos más profundos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La visualización tridimensional de alta resolución de los nódulos sinoauricular y auriculoventricular en modelos de ratón aborda una brecha crítica en la investigación de la electrofisiología cardíaca, permitiendo una cartografía anatómica y celular precisa. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en la validación temprana de dianas para los mecanismos de arritmia y apoya la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta los estudios cardíacos preclínicos. La preservación de la integridad del tejido y la posibilidad de análisis multiplexado de tipos celulares posicionan este flujo de trabajo como un recurso reutilizable para carteras de I+D cardiovascular.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite una interrogación detallada de las poblaciones celulares del sistema marcapasos y de conducción in situ.
- Apoya la reducción mecanicista de riesgos al aclarar las relaciones estructura-función de los nódulos.
- Facilita la identificación confiable de dianas relevantes para la enfermedad en la arritmogénesis.
- Proporciona un contexto anatómico para estudios funcionales y la comprobación de hipótesis.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara sistemas de tejido cardíaco intactos y validados para flujos de trabajo de análisis e imagen posteriores.
- Proporciona resultados cuantitativos reproducibles de inmunofluorescencia para marcadores nodales y miocárdicos.
- Permite la etiquetación con múltiples anticuerpos para evaluar varios tipos celulares dentro de la misma muestra.
- Facilita la estandarización y escalabilidad del ensayo para estudios comparativos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alínea datos anatómicos tridimensionales con modelos preclínicos relevantes para enfermedades de los trastornos de la conducción cardíaca.
- Mantiene la continuidad desde el descubrimiento molecular hasta la validación a nivel tisular.
- Permite el avance ajustado al riesgo de objetivos candidatos basado en evidencia estructural y celular.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores mediante la cartografía de interacciones celulares nodales y no miocíticas.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
Este protocolo de inmunofluorescencia en preparaciones completas y análisis por microscopía confocal conecta el descubrimiento inicial, la validación de objetivos y la investigación cardíaca preclínica al proporcionar datos anatómicos cuantitativos de alto contenido.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en la investigación de la conducción cardíaca.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas reproducibles mediante inmunofluorescencia para la identificación de nódulos.
- Análisis: Permite la reconstrucción tridimensional y el análisis comparativo de regiones nodales y miocárdicas.
- Investigación Traducional: Ofrece continuidad anatómica y celular para modelos preclínicos de arritmias.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada de imagen y análisis para equipos de I+D cardiovascular.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos cardíacos.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de tejidos y la obtención de imágenes para generar resultados reproducibles y escalables.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital en los programas de descubrimiento cardíaco.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos y modelos del sistema de conducción.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección cardíaca, inmunofluorescencia y microscopía confocal.
- Exige acceso a plataformas de imagen avanzadas y software de análisis de imágenes.
- Necesita la estandarización entre equipos en el manejo de tejidos y protocolos de anticuerpos.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes modelos cardíacos o especies.
- El tamaño de la muestra y la penetración del anticuerpo pueden limitar la capacidad de procesamiento en estudios a gran escala.
