Determinación Semicuantita cuantitativa de la densidad de la neurona dopaminérgica en la sustancia negra de modelos de roedores utilizando el análisis automatizado de imágenes
2 de febrero de 2021
Aquí presentamos un método automatizado para la determinación semicuantita cuantitativa del número de neuronas dopaminérgicas en el compacta de las igualdades del nigra del substantia de la rata.
La estimación del número dopaminérgico de la neurona en el nigra del substantia es una medida dominante del resultado en la investigación de la enfermedad de Parkinson. Este protocolo acorta significativamente la carga de trabajo necesaria para estimar el número de neuronas. Este método proporciona un proceso eficiente y preciso para detectar cambios en el número de neuronas dopaminérgicas y es adecuado para determinar el efecto de las intervenciones sobre la supervivencia celular.
Este método podría adaptarse fácilmente para proporcionar recuentos precisos de neuronas en diferentes regiones del cerebro, manteniendo al mismo tiempo las ventajas de costo y tiempo sobre los métodos estereológicos tradicionales. Para capturar imágenes IHC utilice el software acoplado a un microscopio confocal a un aumento de 10X. Abra el orificio del pasador a 1.5 unidades de área para capturar un plano ancho que totalizará 1.5 micro metros y establezca el enfoque en el lado inyectado del cerebro.
En la pestaña de adquisición, marque la opción de imágenes de escaneo de teselas y establezca las dimensiones en 10 por cuatro. En el panel del modo de adquisición, establezca el zoom en 1.1 para evitar cualquier marca de costura entre las imágenes de escaneo de mosaicos. Establezca el tamaño del fotograma en 1024 por 1024 píxeles y el promedio en dos para garantizar la adquisición de imágenes de alta calidad.
En el panel de canales, establezca la pista uno a Alexa 488 y la pista dos a Alexa 555. Cargue la diapositiva en el escenario y elija una sección con una fuerte tinción de TH. Haga clic en en vivo en el panel de adquisición.
En el panel de canales, establezca la fuerza y la ganancia del láser en niveles que maximicen la señal y limiten el ruido de fondo. Utilice el indicador de rango para asegurarse de que las señales no están sobreexpuestas. Repita esto con varias diapositivas.
En la pestaña adquisición, marque la casilla posiciones. Para comenzar a tomar imágenes, use el ocular y elija la primera sección que muestre una tinción de TH positiva. A continuación, establezca el foco en el punto de interés y mueva el escenario a la línea media de la sección.
Esto guarda la posición en los ejes X, Y y Z y creará una imagen de un escaneo de mosaico que captura toda la sección. Repita esto para todas las demás diapositivas, incluido un sitio sin inyectar. Separe los archivos de imagen utilizando el software adecuado e impórtelos al software de análisis de imágenes automatizado.
Defina una región de interés seleccionando la herramienta de anotación de lápiz para dibujar una anotación alrededor de la sustancia nigra pars compacta. Vaya a la pestaña de análisis y seleccione ajuste en tiempo real en el menú desplegable de análisis. Esto abre una ventana separada en la imagen de la sección que permite la modificación en tiempo real de los parámetros de análisis.
En la sección de ampliación de análisis, seleccione el zoom de imagen adecuado. En la sección de detección celular seleccione el tinte nuclear como el tinte utilizado para la tinción de TH. Ajuste el umbral de contraste nuclear, la intensidad nuclear mínima, la agresividad de segmentación nuclear y los ajustes de tamaño nuclear mientras observa cuidadosamente la ventana de ajuste de tiempo.
Repita este proceso con varias muestras. Una vez que se haya muestreado un número adecuado de imágenes y se haya ajustado el ajuste en tiempo real en consecuencia, guarde la configuración del análisis en el menú desplegable de acciones de configuración. Seleccione todas las imágenes que se analizarán y haga clic en analizar.
Elija la configuración de análisis que se acaba de guardar y en la ventana de la región de análisis marque el cuadro capas de anotación, luego marque la capa uno y haga clic en analizar. Una vez completado, exporte los datos de análisis de resumen para todas las secciones seleccionando la opción exportar datos de análisis de objetos. Este conjunto de datos podría utilizarse para examinar los cambios en el tamaño de la célula en respuesta a una toxina o terapéutica.
Seis semanas después de las inyecciones adeno asociadas del virus o de AAV, la inyección stereotactic del AAV que expresaba el synuclein alfa del mutante A53T en el nigra del substantia en el cerebro de la rata dio lugar a una reducción significativa en la densidad de neuronas dopaminérgicas. El número malo de neuronas positivas del TH por milímetro cuadrado en el nigra del substantia de ratas inyectadas con AAV-A35T fue disminuido perceptiblemente con respecto a el de ratas inyectadas con el vector vacío de AAV. Observaciones similares fueron hechas usando estereología imparcial.
Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que el software es tan útil como está entrenado para ser. Por lo tanto, se debe tener tiempo y cuidado para garantizar que una sola célula se identifique como una sola célula. El software se puede adaptar para medir una intensidad de fluorescencia de otras proteínas de interés como la alfa-sinucleína para determinar si los tratamientos pueden modular los niveles de proteínas.
Esta técnica ha permitido una mayor eficiencia al probar el efecto de múltiples terapias potenciales sobre la densidad de neuronas dopaminérgicas.
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Descripción general
Este estudio presenta un método automatizado para la determinación semicuantitativa de números de neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra pars compacta de ratas. El protocolo reduce significativamente la carga de trabajo y mejora la precisión al estimar el recuento de neuronas, lo cual es crucial en la investigación de la enfermedad de Parkinson.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Psiquiatría
- Biología celular
Antecedentes
- La estimación de números de neuronas dopaminérgicas es vital para la investigación de la enfermedad de Parkinson.
- Los métodos tradicionales pueden ser laboriosos y menos precisos.
- Los métodos automatizados pueden proporcionar eficiencia en tiempo y ventajas de costos.
- Los cambios cuantitativos en los números de neuronas pueden evaluar los efectos terapéuticos.
Propósito del estudio
- Presentar un método para la detección eficiente y precisa de números de neuronas dopaminérgicas.
- Permitir a los investigadores analizar cambios en los recuentos de neuronas debido a varias intervenciones.
- Simplificar el proceso de imagen y análisis de datos para neuronas dopaminérgicas.
Métodos utilizados
- Método de imagen automatizado utilizando microscopía confocal.
- Enfoque en la substantia nigra pars compacta en un modelo de rata.
- El protocolo implica la captura de imágenes IHC a 10X de magnificación con configuraciones específicas de imagen.
- Ajuste y análisis en tiempo real de imágenes neuronales mediante software automatizado.
- Análisis de datos incluido para cambios en la densidad de neuronas después de la intervención.
Resultados principales
- Este método mostró reducciones significativas en la densidad de neuronas TH positivas después de las inyecciones de AAV que expresan alfa-sinucleína mutante A53T.
- Los resultados indicaron una disminución en los recuentos de neuronas dopaminérgicas en comparación con los grupos de control.
- Se utilizó estereometría imparcial para validar los hallazgos.
- Permite la detección de cambios morfológicos en respuesta a intervenciones terapéuticas.
Conclusiones
- El estudio valida un método eficiente para cuantificar neuronas dopaminérgicas.
- Esta técnica mejora la comprensión de la pérdida neuronal en modelos de la enfermedad de Parkinson.
- Los métodos presentados pueden facilitar la exploración de los impactos terapéuticos en la densidad neuronal.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of dopaminergic neuron density in the substantia nigra is critical for preclinical Parkinson's disease research and therapeutic evaluation. Automated image analysis offers a scalable, time-efficient alternative to traditional stereology, enabling rapid assessment of neuroprotective interventions. This approach supports robust target validation and accelerates decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of neuronal loss or protection in disease-relevant models.
- Supports functional validation of therapeutic targets by measuring intervention effects on cell survival.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing objective, reproducible neuron counts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain region assays for compound screening workflows.
- Standardizes neuron quantification, improving reproducibility and assay comparability.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput evaluation of multiple interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical readouts with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust neuronal survival data.
- Supports biomarker development by quantifying protein expression changes alongside neuron counts.
Pipeline & Workflow Integration
This automated quantification method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research phases.
- Discovery Biology: Provides objective neuron density measurements for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Offers reproducible, scalable quantification for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Generates exportable datasets for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity of disease-relevant endpoints across the pipeline.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other brain regions and protein markers, supporting broad R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and more efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on robust quantitative data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and image analysis parameter optimization.
- Needs access to compatible microscopy and automated analysis software infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable across different brain regions and protein targets with appropriate validation.
- Accuracy depends on rigorous training and tuning of analysis software for single-cell identification.
