Name: Creación y mantenimiento de un biobanco vivo - Cómo lo hacemos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Aprenda a crear y mantener un biobanco vivo para cáncer colorrectal y pancreático. Este protocolo detalla la obtención, procesamiento y criopreservación de muestras, incluyendo xenoinjertos derivados de pacientes y líneas celulares primarias.

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Reconocemos amablemente a Jenny Burmeister, nuestra asistente gráfica, por la grabación y edición del video. Además, agradecemos a nuestros colegas del departamento quirúrgico y patológico la colaboración de larga data. También queremos dar las gracias a Marcus Müller, director de producción del Centro de TI y Medios de la Universidad de Rostock, por suministrar el equipo de grabación de audio y refinar la calidad del sonido.
FINANCIACIÓN: La Fundación Alemana de Ayuda contra el Cáncer (DKH e.V.), número de subvención 108446, y el número de subvención TBI-V-1-241-VBW-084 del estado Mecklemburgo-Vorpommern financiaron parcialmente esta investigación.

<ol><li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Mouradov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+cell+lines+are+representative+models+of+the+main+molecular+subtypes+of+primary+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer.</a> Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).</li>
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<li>DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approval+success+rates+for+investigational+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+pharmacology+and+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Clinical approval success rates for investigational cancer drugs.</a> Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Mullins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Biobanking+and+Tumor+Model+Establishment+of+Human+Colorectal+Carcinoma+Provides+Excellent+Tools+for+Preclinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research.</a> Cancers. 11 (10), (2019).</li>
<li>Kuehn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+HROC69+-+a+Crohn%27s+related+colonic+carcinoma+cell+line+and+its+matched+patient-derived+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft.</a> Scientific reports. 6, 24671(2016).</li>
<li>Dangles-Marie, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+colon+cancer+cell+lines+from+fresh+tumors+versus+xenografts%3A+comparison+of+success+rate+and+cell+line+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features.</a> Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).</li>
<li>Gock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Take+Rate+Optimization+for+Colorectal+Carcinoma+Patient-Derived+Xenograft+Models%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+research+international%22%5BJournal%5D)">Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models.</a> BioMed research international. 2016, 11715053(2016).</li>
<li>Collins, A. T., Lang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+the+validity+of+patient+derived+xenograft+%28PDX%29+models%3A+the+implications+for+translational+research+and+personalised+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine.</a> PeerJ. 6, 5981(2018).</li>
<li>Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+colorectal+cancer+in+pre-clinical+research%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review.</a> Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extent+of+inflammatory+infiltration+in+primary+cancer+tissues+is+associated+with+lymphomagenesis+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li>
<li>Moyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+murine+tumors+in+the+development+of+patient-derived+xenografts%3A+a+potential+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall.</a> Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).</li>
<li>Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+carcinoma+tumour+budding+and+podia+formation+in+the+xenograft+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment.</a> PloS one. 12 (10), 0186271(2017).</li>
<li>Guenot, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+tumour+genetic+alterations+and+intra-tumoral+heterogeneity+are+maintained+in+xenografts+of+human+colon+cancers+showing+chromosome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability.</a> The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).</li>
<li>Mattie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+patient-derived+human+pancreatic+tumor+xenograft+models+for+preclinical+and+translational+development+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics.</a> Neoplasia. 15 (10), New York, N.Y. 1138-1150 (2013).</li>
<li>Cho, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+patient-derived+xenografted+tumors+maintain+characteristic+features+of+the+original+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+surgical+research%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors.</a> The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).</li>
<li>Maletzki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+and+Drug+Response+of+Freshly+Established+Patient-Derived+Tumor+Models+with+CpG+Island+Methylator+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype.</a> PloS one. 10 (11), 0143194(2015).</li>
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<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).</li>
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</ol>

La generación de un biobanco vivo presupone, además de cumplir con las regulaciones legales de privacidad, derecho médico y bienestar animal, una buena infraestructura y un equipo bien coordinado. Ha demostrado ser ventajoso involucrar directamente a una parte del personal quirúrgico en los procedimientos de investigación, ya que pueden evaluar muy bien la idoneidad del paciente individual para la donación de tejidos. Además, los pacientes tienden a dar su consentimiento con más frecuencia con el biobanco, cuando su aprobación por escrito se obtiene en el transcurso de la discusión de consentimiento informado quirúrgico. Para ahorrar tiempo y recursos, no se deben seleccionar casos que presumiblemente produzcan cantidades insuficientes de tejido tumoral para el biobanco. Cuando se trata de la adquisición de especímenes, la máxima "la comunicación es clave" es una verdad simple, pero a menudo pasada por alto. Sólo se necesita una sola enfermera de teatro no informada o colega quirúrgico para arruinar el espécimen justo al principio procediendo como de costumbre y añadiendo formaldehído al espécimen de resección. Por lo tanto, es absolutamente crucial que todos y cada uno de los miembros del personal involucrado se familiaricen con el PSOE para el biobanco. Los cirujanos deben ser notados el día antes y justo al comienzo del procedimiento sobre la recolección programada de tejidos. Además, los casos seleccionados para la biobanco deben destacarse en el plan electrónico de quirófano. La recolección de tejidos a partir de la muestra quirúrgica debe ser realizada por un patólogo. En primer lugar, esto garantizará que la recolección de tejidos no interfiera con el informe patológico final. En segundo lugar, esto aumenta la probabilidad de recibir tejido con cantidades adecuadas de tejido canceroso viable. Especialmente en los cánceres de páncreas con una reacción desmoplástica pronunciada y áreas necróticas frecuentes, las partes viables son difíciles de identificar macroscópicamente para el ojo no entrenado. Como excepción a esta regla, los bloques de tejido de grandes metástasis hepáticas o pulmonales, a veces pueden ser exculpados "back-table" por el cirujano, si los márgenes quirúrgicos se pueden definir macroscópicamente. Es posible que el cáncer rectal resecado por la escisión mesorectal total (TME), no sea adecuado para el biobanco, ya que la recolección de tejidos del espécimen resecado antes de la incrustación de parafina podría interferir con la evaluación de la calidad de las TME. Alternativamente, el tejido para biobanco puede ser adquirido por biopsia transanal de cáncer rectal.
Las tasas de establecimiento de cultivos celulares primarios derivados del tumor original son generalmente bajas. Es más probable que se puedan establecer con éxito cultivos celulares secundarios derivados de PDX. Recomendamos pruebas de diferentes medios para cada caso y el uso de suplementos antibióticos para los primeros pasajes para reducir la contaminación al mínimo ya que el tejido cosechado rara vez es estéril. Después de una propagación exitosa, cada línea celular individual debe ser confirmada como una línea de células cancerosas mediante análisis FACS y pruebas periódicas para detectar la contaminación por micoplasma. Para excluir la contaminación cruzada, se recomienda un análisis regular de STR. Cabe señalar, que el protocolo de establecimiento para las líneas celulares primarias y secundarias se somete constantemente a la optimización. Los detalles relativos a la composición y las tasas de éxito de los medios únicos están claramente fuera del alcance de esta obra y se publicarán por separado.
Para el injerto PDX, el tejido tumoral se puede implantar directamente después de la resección o criopreservado en suero calve fetal con UN 10% de DMSO o medios de congelación similares para una implantación retardada. La implantación inmediatamente después de la recolección del tejido tumoral pone una tensión en el personal de logística y laboratorio, y los resultados de xenoinjertos después de la criopreservación no son inferiores en absoluto a 10. Además, la incubación del tejido en Matrigel antes de la implantación tumoral, aumenta significativamente las tasas de enjerftment12. Recomendamos retrasar el enjerftment tras el hallazgo patológico definitivo y la eliminación inmediata de especímenes de tejido recogidos erróneamente. Dado que la tasa de éxito del enjerftment primario aumenta con la inmunodeficiencia del ratón receptor, tendemos a utilizar ratones NSG para el primer paso PDX. Después del primer enjerftment PDX exitoso, los ratonesNMRI nu/nu pueden y deben utilizarse para pasajes posteriores y expansión de tejidos. Esta variedad es más robusta, más barata y más fácil de reproducir en comparación con NSG o cepas inmunodeficientes similares, pero todavía muestra tasas de enjertado razonables. Además, su desnudo facilita la implantación y el seguimiento del crecimiento tumoral. Para aumentar las tasas de enjertado en pasajes posteriores, recomendamos la transferencia directa de tejidos PDX recién cosechados a ratones anfitriones siempre que sea posible, especialmente para pdx de crecimiento lento y casos con una baja tasa de éxito de enjerftment primario. Collins y Lang revisaron recientemente 14 estudios de establecimiento colorrectal de PDX y reportaron tasas de arraigamiento que oscilan entre el 14 y el 100% con una tasa media de establecimiento pdx del 68%, siendo estos últimos consistentes con nuestros hallazgos13. En línea con la literatura, observamos menores tasas de establecimiento de páncreas en comparación con el cáncer colorrectal PDX14. Independientemente de la cepa del ratón huésped y la entidad tumoral, el crecimiento de linfomas de células B asociados al Virus Epstein-Barr (EBV) y linfomas murinos en el lado de la implantación plantea un escollo importante15,16. Si no se reconocen, estos tumores pueden "contaminar" pasajes posteriores y, por lo tanto, confundir resultados consecutivos. El crecimiento rápido inusual de PDX y la hinchazón de los ganglios linfáticos cervicales, axilares e inguinales son indicadores sólidos del crecimiento del linfoma murino, pero el examen histológico regular de PDX es, sin embargo, aconsejable. Además, la concordancia genética entre PDX y el paciente donante correspondiente debe hacerse la prueba periódica mediante análisis STR. Idealmente, el biobanco debe estar vinculado a una base de datos clínica que comprende las características de los pacientes (información general, supervivencia, supervivencia libre de recaídas, terapia, neoplasia secundaria, etc.). Debido a las regulaciones legales de protección de la privacidad y la falta de una base de datos anonymizada, nuestro conjunto de datos clínicos es administrado y actualizado regularmente manualmente por los médicos cooperantes.
Mientras que los biobancos convencionales se limitan a la investigación del observatorio, un biobanco vivo ofrece la oportunidad de intervenciones in vitro e in vivo. Las líneas celulares derivadas del paciente son una herramienta importante para la investigación fundamental, los exámenes farmacológicos de alto rendimiento y la evaluación de los nuevos agentes farmacéuticos4. Los modelos PDX correspondientes, sin embargo, son de creciente importancia, ya que recapitularán de cerca la histología del tumor original17,18 y muestran una alta estabilidad genética sobre varios pasajes19,20. Nuestro biobanco PDX ha demostrado ser una excelente plataforma para la investigación preclínica y fundamental6,21. Además, dado que las grandes colecciones de PDX reflejan adecuadamente la heterogeneidad inter-individual de la población del paciente, el enfoque del ensayo clínico PDX (PCT) (un animal por modelo por tratamiento) ha cobrado importancia para el desarrollo de fármacos, ya que permite la fiel predicción de la respuesta clínica a nuevos fármacos y al régimen combinatorio8. También estamos evaluando nuevos fármacos experimentales en pequeños ensayos de PCT.
A pesar de estos prometedores resultados, la mediana de duración del establecimiento de 12,2 meses, impide la aplicabilidad clínica de los modelos PDX como "ratones avatar" para probar las opciones de tratamiento anticancerígeno, al menos para aquellos pacientes que necesitan un adyuvante inmediato o incluso tratamiento neoadjuvante22. Una desventaja adicional de los modelos PDX estándar es la falta de usabilidad para las pruebas de inmunoterapia debido a la inmunodeficiencia de los ratones anfitriones. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado varias cepas de ratón "humanizadas". Estos ratones están muy inmunodeprimidos, pero pueden ser reconstituidos con varios tipos de células derivadas de la médula ósea humana o células madre hematopoyéticas CD34+ posteriores al crecimiento de PDX23,permitiendo la evaluación de la citotoxicidad mediada por linfocitos y de la respuesta terapéutica al tratamiento inhibidor del punto de control inmune24,25.
En los últimos años, los organoides derivados del paciente (DOP) surgieron como importantes modelos oncológicos que compiten con PDX. Derivadas de piezas tumorales intactas y cultivadas en un andamio de matriz extracelular, estas estructuras tridimensionales reflejan de cerca las propiedades histológicas y genéticas del tumor original. La posibilidad de expansión y criopreservación a largo plazo hace de la DOP un suplemento ideal de un biobanco vivo26,27. Además de una tasa de establecimiento relativamente alta, se ha notificado una predicción fiable de la respuesta a fármacos para la DOP de varias entidades tumorales28. Además, incluso se han generado PDA a partir de células tumorales circulantes y también es posible el establecimiento simultáneo de organoides a partir del tejido sano correspondiente, permitiendo la evaluación de la toxicidad relacionada con el tratamiento de forma individual del paciente29,30. Sin embargo, en comparación con los cultivos celulares 2D convencionales, el cultivo organoide es lento y consume recursos y compuestos de matriz extracelular artificial pueden interferir con ciertos procedimientos analíticos31. Además, los organoides oncológicos son susceptibles al crecimiento excesivo por organoides no malignos de crecimiento más rápido derivados del epitelio saludable30. Debido a la falta de estroma, vasos sanguíneos y células inmunes, las PDA son en su mayoría inaplicables para la prueba de agentes inmunoterapéuticos antiangiogénicos. Sin embargo, los nuevos métodos de cultivo permiten el modelado del microambiente tumoral in vitro,convirtiendo a los PDA en un verdadero contendiente para los modelos32de PDX. En un futuro próximo, los modelos de tumores individuales para pacientes, combinados con potentes herramientas genéticas como la secuenciación de próxima generación, con suerte allanarán el camino hacia la verdadera medicina de precisión y enfoques de tratamiento personalizado.

En los últimos años, el conocimiento acumulado de las propiedades morfológicas, clínicas y genéticas de los cánceres condujo a la concepción del cáncer como una enfermedad heterogénea, individual. En consecuencia, la caracterización mutacional de los neoplasias, además de las características clínicas y patológicas, ha cobrado importancia para la toma de decisiones clínicas y se desarrollaron muchas terapias dirigidas para diversas alteraciones moleculares. Por ejemplo, la eficacia del cetuximab en el tratamiento del cáncer colorrectal puede predecirse mediante el análisis del KRAS y pik3CA estado mutacional1. La medicina de precisión tiene como objetivo un enfoque personalizado para proporcionar la respuesta de tratamiento más alta en cada paciente y evitar la toxicidad de las terapias ineficaces2. Los biobancos contienen tejidos, sangre y otros materiales biológicos de pacientes con cáncer, que están vinculados a los datos clínicos, y por lo tanto son una excelente herramienta para la investigación traslacional del cáncer. Debido al gran número de muestras clínicas, los biobancos permiten la detección de mutaciones raras, pero potencialmente farmacológicas, lo que proporciona nuevas oportunidades de tratamiento para el paciente individual3.
Para cubrir lo más amplio posible un espectro de investigación oncológica, no limitamos nuestra actividad solo en la recolección de muestras, sino que nos centramos en el establecimiento de líneas celulares de cáncer derivadas del paciente y xenoinjertos (PDX). Las líneas celulares 2D tradicionales siguen siendo la piedra angular de la investigación in vitro y son la opción principal para los exámenes de drogas a gran escala4,5. Además, el análisis de líneas celulares es a menudo más fácil, más barato y más fácilmente disponible. Además, puesto que existen linfocitos sanguíneos periféricos derivados del paciente (PBL), también se puede estudiar inmunología tumoral in vitro6. Sin embargo, la mayoría de los fármacos recientemente desarrollados con una efectoividad preclínica prometedora en experimentos in vitro o in vivo basados en células, han mostrado resultados decepcionantes en los ensayos clínicos7. Por el contrario, los estudios preclínicos basados en estudios in vivo de PDX han reflejado la actividad clínica de los agentes antineoplásicos mucho más fielmente8. Dado que el tejido PDX refleja de cerca las propiedades histológicas y moleculares del tumor del donante, los modelos PDX son una buena manera de propagar las cantidades a menudo muy limitadas de tejido tumoral viable para mantener la integridad de un biobanco y permitir el intercambio de muestras entre grupos de investigación e instituciones. Además, las líneas celulares cancerosas derivadas del tejido PDX se pueden establecer significativamente más fáciles que las líneas celulares primarias de cáncer9. En los últimos años, nuestro grupo de trabajo ha establecido un biobanco integrado integral de cáncer colorrectal y pancreático mediante la estandarización escalonada y la optimización del flujo de trabajo para todas las muestras biológicas en cuestión (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo y organización del <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">biobanco Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Bacillol&reg; AF; 1L</td><td>Bode, Hartmann</td><td>REF 973380</td><td></td></tr><tr><td>tubo centrífugo PP de desinfección, 15 ml; estéril</td><td>Greiner Bio One</td><td>GBO Cat. N.º:188271</td><td>tubo de centrífuga</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga PP, 50 ml, estéril</td><td>Sarstedt</td><td>N.º artículo: 62.547.254</td><td>tubo de centrífuga</td></tr><tr><td>BD DiscarditTM II Jeringa 20ml</td><td>BD</td><td>REF 300296</td><td>Extracción de sangre</td></tr><tr><td>Suero 7,5ml Sarstedt Monovette</td><td>Sarstedt</td><td>Nº Ref.: 01.1601</td><td>Extracción de sangre</td></tr><tr><td>Pipeta serológica 10ml</td><td>Sarstedt</td><td>REF 86.1254.001</td><td>transferencia de líquidos</td></tr><tr><td>Pipetboy ratiolab&reg; accupetta</td><td>Ratiolab</td><td>Nº Ref.: RL3200300</td><td>transferencia de líquidos</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>VWR Cat.No: 613-4438</td> transferencia <td>de líquidos</td></tr><tr><td>DPBS; c/o Ca & Mg</td><td>Pan Biotech</td><td>Cat. Nº de código: P04-36500</td><td>lavado</td></tr><tr><td>Pancoll humano</td><td>Pan Biotech</td><td>Cat. Nº: P04-60500</td><td>centrifugación en gradiente de densidad</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (Dulbecco' s Águila Modificada Media)</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. No.: P04-41500</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>FBS Good Forte (Suero Bovino Filtrado)</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. No.: P40-47500</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. Nº de código: P04-80100</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Tripsina / EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. No.: P10-023100</td> cultivo <td>celular</td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido para cultivo celular)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>VWR Cat.No: A3672.0250</td><td>congelación celular</td></tr><tr><td>Congelador Medio (FCS con 10% DMSO)</td>Criotubo <td>---</td> <td>congelación</td>celular hecho <td>a sí mismo</td></tr><tr><td>- CryoPure 2ml</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>congelación celular</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 6 pocillos; estéril; con tapa</td><td>Greiner bio-one</td><td>Nº de cat.: 657 160</td><td>Cultivo de células</td></tr><tr><td>Placa de Petri 92 x 16 mm, PS, sin levas</td><td>Sarstedt</td><td>Cat. Nº de código: 82.1472.001</td><td>cuchillas</td></tr><tr><td>quirúrgicas estériles</td> para la preparación de tejidos <td>B.Braun (Aesculap)</td><td>REF BB510</td><td>preparación para tejidos</td></tr><tr><td>BD DiscarditTM II Jeringa 10ml</td><td>BD</td><td>REF 309110</td> filtro de células para <td>la preparación de tejidos</td></tr><tr><td>; amarillo; 100&micro; m</td><td>Falcon</td><td>REF 352360</td><td>preparación de tejidos</td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>biocision</td><td>Nº Ref.: 210004</td><td>contenedor de refrigeración con -1&deg; C/min</td></tr><tr><td>Dewar&nbsp; buque de transporte tipo 27 B, 2 l, 138 mm</td><td>KGW</td><td>Cat. No.: HT39.1</td><td>sistema de transporte</td></tr><tr><td>Punta de pipeta 200&micro; l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.760.002</td> Punta de filtro de <td>transferencia de líquido</td></tr><tr><td>1000&micro; l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.762.411</td> pipeta <td>de transferencia de líquidos</td></tr><tr><td>200&micro; l, amarillo</td><td>Eppendorf</td><td>Cat. Nº: 3121 000.082</td> pipeta <td>de transferencia de líquidos</td></tr><tr><td>1000&micro; l, azul</td><td>Eppendorf</td><td>Cat. Nº: 3121 000.120</td> incubadora <td>de transferencia de líquidos</td></tr><tr><td>&nbsp; BB 6220 CU</td><td>Heraeus</td><td>Nº de cat.: placa</td><td></td></tr><tr><td>calefactora de cultivo de células 51012839 PR&Auml; ZITHERM</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>---</td><td></td></tr> <tr><td>microscopio de calefacción Zeiss Primo Vert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>Número de serie. 3842000839</td><td>Obtención de imágenes de cultivos celulares</td></tr><tr><td>Banco estéril Safe flow 1.8 nunc</td><td>nunc GmbH & Co. KG</td><td></td>---congelador <td>de banco de trabajo estéril</td></tr><tr><td>-80&deg; C</td><td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td><td>---almacenamiento de</td> <td>muestras</td></tr><tr><td>Balanza electrónica MP-300</td><td>Chyo</td><td>---</td><td>Scale</td></tr><tr><td>BD Micro-fine, jeringa de insulina U100</td><td>BD</td><td>REF</td><td>324826 anestésico inyectable</td></tr><tr><td>Rompun 2%; 25ml</td> Número de homologación <td>Bayer</td><td>: 6293841.00.00</td><td>anestesia</td></tr><tr><td>Ketamin 100 mg/ml, 25ml</td><td>CP-Pharma GmbH número de</td><td>homologación: 401650.00.00</td><td>anestesia</td></tr><tr><td>GES3S Lector</td><td>Datamars</td><td>no disponible</td><td>Lector RFID</td></tr><tr><td>ISO-Transpondedor FDX-B (1,4x8mm)</td><td>Peddymark</td><td>---</td><td>Chip RFID</td></tr><tr><td>Cotrim-ratiopharm&reg; &nbsp; Ampullen SF 480&nbsp; mg/5&nbsp; ml</td><td>Ratiopharm</td><td>PZN-03928197</td><td>antibiótico agua potable</td></tr><tr><td>Placa calefactora #FM-20 42x28cm</td><td>Dragon</td><td>---</td><td>heating</td></tr><tr><td>Lámpara calefactora</td><td>Electric Petra, Burgau</td><td>---</td><td>heating</td></tr><tr><td>Pomada para los ojos y la nariz (5% Dexpantenol) Bepanthen</td><td>Bayer</td><td>PZN-01578675</td><td>Pinza anatómica de protección ocular</td></tr><tr><td></td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BD21 OR</td><td>instrumentos quirúrgicos</td></tr><tr><td>pinza quirúrgica</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BD50 1 R</td><td></td></tr><tr><td>tijeras para instrumentos quirúrgicos</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BC05 6R</td><td>para instrumentos quirúrgicos</td></tr><tr><td>aguja&nbsp; soporte</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BH1 1 OR</td><td>instrumentos quirúrgicos</td></tr><tr><td>Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>XN8870. Material</td><td>de sutura quirúrgico</td>P32</tr><tr><td>Apósito en aerosol permanente Opsite moisture vapour Smith</td><td>& Sobrino</td><td>REF 66004978, PZN- 02063507</td><td>material de sutura</td></tr><tr><td>quirúrgica Cortina adhesiva</td><td>de apertura Barrier</td><td>REF 904622</td><td>estéril OP</td></tr><tr><td>tejido de gasa intercambiable Gazin&reg;; estéril; 10x10 cm</td><td>Lohmann& Rauscher</td><td>REF 18506</td> pañuelo <td>OP estéril</td></tr><tr><td>Raucotupf aplicadores con punta de algodón</td><td>Lohmann& Aplicador Rauscher</td><td>REF 11969</td><td></td></tr><tr><td>Corning&reg; Matrigel Membrana Basal Matrix</td><td>Corning Nº</td><td>de cat.: 354234</td><td>membrana basal Matrix</td></tr><tr><td>solución de yodo Braunol (7,5g povidona yodado)</td><td>B.Braun Melsungen AG</td><td>Nº Ref.: 18839</td><td>desinfección</td></tr><tr><td>MACS&reg; solución de almacenamiento de tejidos</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>Nº de artículo:130-100-008</td><td>solución de almacenamiento</td></tr><tr><td>Formafix 4%</td><td>Grimm med. Logistik GmbH</td><td>Nº Ref.:</td><td>Solución de fijación</td>F10010G</tr><tr><td>Software FreezerworksBasic</td><td>Dataworks Development, Inc</td><td>---</td><td>organización de muestras</td></tr><tr><td>Impresora Zebra TLP 2844</td> <td>Impresora</td> <td>---</td> <td>etiquetas de cebra</td></tr></tbody></table>

creación y mantenimiento de un biobanco vivo - cómo lo hacemos

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

A la luz del creciente conocimiento sobre las propiedades inter-individuales y la heterogeneidad de los cánceres, el campo emergente de la medicina personalizada requiere una plataforma para la investigación preclínica. En los últimos años, hemos establecido un biobanco de cánceres colorrectal y pancreático compuesto por tejido tumoral primario, tejido normal, sera, linfocitos sanguíneos periféricos aislados (PBL), xenoinjertos derivados del paciente (PDX), así como líneas celulares de cáncer primaria y secundaria. Dado que el tejido tumoral original es limitado y la tasa de establecimiento de líneas celulares primarias contra el cáncer sigue siendo relativamente baja, PDX permite no sólo la preservación y extensión del biobanco, sino también la generación de líneas celulares secundarias contra el cáncer. Además, se ha demostrado que los modelos PDX son el modelo in vivo ideal para las pruebas preclínicas de drogas. Sin embargo, el biobanco requiere una preparación cuidadosa, directrices estrictas y una infraestructura bien sintonizada. Colectomía, duodenopancreatoctomía o metástasis resecadas se recogen inmediatamente después de la resección y se transfieren al departamento de patología. Respetando la prioridad de un informe histopatológico imparcial, a discreción del patólogo asistente que lleva a cabo las disecciones, se cosechan pequeñas piezas tumorales y tejido no tumoral. 
Las partes necróticas se desechan y el tejido tumoral restante se corta en cubos pequeños e idénticos y se criopreserva para su uso posterior. Además, una pequeña porción del tumor se extrae y se tensa para el cultivo primario de células cancerosas. Además, las muestras de sangre extraídas del paciente de forma pre y postoperatoria, se procesan para obtener suero y PBLs. Para el enjerftment PDX, los especímenes criopreservados se descongelan e implantan subcutáneamente en los flancos de ratones inmunodeficientes. El PDX resultante recapitular estrechamente la histología de los tumores "donantes" y se puede utilizar para el xenoinjerto posterior o criopreservado para su uso posterior. En el siguiente trabajo, describimos los pasos individuales de creación, mantenimiento y administración de un gran biobanco de cáncer colorrectal y pancreático. Además, destacamos los detalles y advertencias cruciales asociados con el biobanco.

En nuestras manos, la tasa de establecimiento de cultivos celulares primarios(Figura 2A &amp; B)fue del 12,9% en una serie grande9. La mayoría de los intentos de aislar las células tumorales ampliables de muestras resecadas quirúrgicas frescas fracasaron debido a la falta de crecimiento o contaminación temprana. El establecimiento de líneas celulares se consideró exitoso después de 3 pasajes con un crecimiento constante en condiciones de cultivo estándar (DMEM, 10% FCS, buque de cultivo estándar) y validación de la diferenciación epitelial a través del análisis FACS10. Las líneas celulares derivadas de tumores PDX(Figura 2C y D)mostraron una tasa de establecimiento más alta de 23.6% que también se debe a la posibilidad de intentos repetitivos en contraste con los tumores primarios resecados9. Sin embargo, algunos cultivos mixtos(Figura 2E)no pueden liberarse del crecimiento fibroblástico o incluso se pierden debido al crecimiento excesivo fibroblástico(Figura 2F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> Figura 2: Cultivo celular. Líneas celulares primarias contra el cáncer, derivadas de una metástasis del caso de cáncer de colon HROC313, pasaje 21 (A) y caso de cáncer de páncreas HROP88, pasaje 5 (B). Líneas celulares cancerosas derivadas de PDX de colon PDX HROC285 T0 M2 (D) y PDX PANCREÁTICO HROP10 T5 M2, paso 4 (E). Cultivo mixto de fibroblastos y células cancerosas del cáncer de páncreas HROP75, paso 8 (C) y crecimiento excesivo fibroblástico (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Teniendo en cuenta los cambios en el protocolo de generación PDX, las cepas de ratón utilizadas y también los experimentadores durante varios años, así como las grandes diferencias en la cantidad de tejido tumoral disponible para el enjerftment, no es trivial dar la tasa de éxito general de la generación PDX. En una serie muy reciente de experimentos de generación PDX realizados por dos investigadores (S.M. y F.B.), se observaron tasas de crecimiento primario del 63% para PDX colorrectal (una histología ejemplar puede representarse de la Figura 3A)y del 48% para PDX pancreático(Figura 3B). El crecimiento de linfomas murcianos o humanos en el sitio de implantación es relativamente raro, pero puede imitar el crecimiento exitoso de PDX(Figura 3C). Además del examen histopatológico, la concordancia entre los modelos PDX y sus pacientes donantes se confirmó regularmente mediante un breve análisis de repetición en tándem (STR)(Figura 3D). Hasta la actualidad, el biobanco comprende &gt;50 líneas celulares de cáncer de páncreas primario y &gt;50 secundarios, 3 líneas celulares de cáncer de páncreas primaria y 6 secundarias, así como modelos &gt;150 colorrectal y 19 modelos PANCREÁTICOS PDX.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> Figura 3: Comparación histológica representativa de colorrectal (A) y PDX pancreático (B). Linfoma humano en el sitio de implantación imitando el crecimiento de PDX (C). Pruebas genéticas de identidad de un modelo PDX (HROC430 T1 M2) al tejido tumoral del paciente original (HROC430Tu) mediante un breve análisis de repetición en tándem (STR). Comparación de los nueve STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (tinte FAM) y D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (tinte HEX) utilizando PCR multiplex con imprimaciones de etiqueta fluorescente después de la electroforesis capilar confirmada concordancia genética del PDX y el tumor donante (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

En el siguiente trabajo, describimos los pasos consecutivos necesarios para el establecimiento de un gran biobanco de cáncer colorrectal y pancreático.

Creación y mantenimiento de un biobanco vivo - Cómo lo hacemos

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

Creación y mantenimiento de un biobanco vivo cómo lo hacemos. Introducción. Los biobancos tradicionales comúnmente contienen muestras de tejido y sangre no viables. A pesar de reflejar adecuadamente la diversidad de poblaciones de pacientes con cáncer y permitir análisis genéticos e histológicos, no son adecuados para ensayos preclínicos que evalúan estrategias terapéuticas.Un biobanco que integra también modelos derivados del paciente supera estas limitaciones. Lo que permite realizar pruebas funcionales para la medicina de precisión. Adquisición de muestras.Para el biobanco de cáncer colorrectal y pancreático, elegir casos con diagnóstico probado, así como suficiente tamaño tumoral, el concentrante informado del paciente es obligatorio. Antes del inicio de la cirugía, extraiga 20 ml de sangre usando una jeringa heparinizada y 7,5 ml adicionales con una monovetta sérica. Procesamiento sérico y aislamiento PBL.Después de la centrifugación a 1,128 RCF durante 15 minutos a cuatro grados, el suero se acuestó en un criotubo preetiquetado y se sumerge directamente en nitrógeno líquido. La sangre heparinizada se transfiere a un tubo de polipropileno y se diluye con 15 ml de PBS. Utilice una pipeta serológica para matar lentamente la mezcla con 15 ml de Pancoll.Después de la centrifugación del gradiente de densidad, la capa opaca que contiene las células mononucleares se toma con una pipeta serológica y se transfiere a un nuevo tubo PP. Después de lavar con PBS y peletizar las células mononucleares por centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspend el pellet en medio congelador y prescinda en criotubos preetiquetados. Transfiera los tubos a un recipiente de refrigeración adecuado para una congelación lenta con un grado por minuto y almacene temporalmente a 80 grados.Procesamiento de tejidos. Tan pronto como la muestra de tejido sea resecada por el cirujano, colórala en un recipiente adecuado. Evite bajo todas las circunstancias que el tejido esté cubierto de formalina.Transporte lo más rápido posible a la patología para la escisión del material tumoral no relevante para la evaluación patológica de los márgenes de resección. La pieza tumoral debe manejarse lo más aséptica posible. Además, obtener una muestra de tejido sano y colocar ambos en tubos separados rellenados previamente con solución de almacenamiento de tejidos en el hielo.Regrese inmediatamente al laboratorio para iniciar el procesamiento de tejidos en condiciones estériles. La pieza de tejido se coloca en un plato de plástico estéril lleno de solución de almacenamiento de tejidos para evitar la desecación. En primer lugar, excisa una o más piezas del tamaño de un cabezal de alfiler para congelarse a presión dependiendo del tamaño de la muestra de tejido obtenida.Coloque el tejido nativo en criotubos preetiquetados y sumérjalo inmediatamente en nitrógeno líquido. Cortar el tejido restante en cubos de tres por tres por tres milímetros cúbicos. Tenga en cuenta que el tejido necrótico debe diseccionarse por completo, pero no debe desecharse.Organice los cubos en cuatrillizos para determinar el número de alícuotas para un almacenamiento vital. Etiquete un número adecuado de criotubos y precaréntelos con un medio congelador de 1,5 ml cada uno. Dado que el DMSO en el medio congelador es citotóxico, realizó los siguientes pasos rápidamente y sin interrupción.Utilice una hoja de bisturí para recoger cuatro piezas de tejido por tubo. Asegúrese de que todas las piezas estén sumergidas completamente en el medio congelador idealmente en la parte inferior del tubo y congele rápidamente los tubos utilizando un recipiente congelador. Proceda de la misma manera con la muestra sana.Para almacenamiento a largo plazo, almacene todos los aliquesas en un tanque de nitrógeno líquido. cultivo celular. Moler los restos del procesamiento del tejido tumoral, incluidas las porciones necróticas con las cuchillas del bisturí lo más pequeñas posible.Coloque un colador de células en la parte superior de un tubo PP estéril y aspire la suspensión con una pipeta serológica para pasar a través del colador celular. Utilice el émbolo de una jeringa de un solo uso para presionar los restos de tejido a través del colador celular para generar una sola suspensión celular. Enjuague con PBS y repita estos pasos hasta que no quede material.Retire el colador de células y centrífuga la suspensión a 180 RCF durante siete minutos. Mientras tanto, prepara una placa de seis pozos precubierta de colágeno con diferentes composiciones mediáticas para aumentar la probabilidad de crecimiento tumoral. Deseche el sobrenadante y vuelva a gastar el pellet en PBS y dispense 500 microlitros por pozo.Después, coloque la placa en una incubadora estándar. Generación de xenoinjerto derivado del paciente. Para la generación de xenoinjertos derivados del paciente en ratones inmunocomprometidos, los animales deben mantenerse en un entorno específico libre de patógenos.Use equipo de protección personal compuesto por exfoliantes, delantal, máscara facial, cubierta para el cabello y guantes. Después de organizar el espacio de trabajo, tome la muestra tumoral del deseo del recipiente de nitrógeno líquido. Llene un tubo PP fresco con 35ml PBS y luego lave el proceso de descongelación cuidadosamente e incline el tubo crio hacia arriba y hacia abajo.Tan pronto como el contenido se vuelve desaliñado, vertido en el PBS y enjuagar las piezas del tumor. Deseche la mayoría del PBS y vacíe los cubos en la tapa. Coloque un plato de plástico estéril en una bolsa de hielo y agregue una gota de 100 microlitros Matrigel.Utilice fórceps para colocar las piezas tumorales en el Matrigel e incubar el tumor durante 10 minutos. Mientras tanto, anestesia a dos ratones. Compruebe la profundidad de la anestesia pellizcando el pie del animal.Cualquier movimiento indica anestesia insuficiente y requiere alguna espera o dosificación adicional. Aplique ungüento ocular, pellizque el ratón por el cuello e inyecte un microchip por vía subcutánea. Realice los siguientes pasos en paralelo.Desinfectar los flancos de los ratones y hacer una pequeña incisión de la piel con tijeras Metzenbaum de rayas y formar un bolsillo subcutáneo por preparación contundente. Utilice fórceps anatómicos para insertar las piezas tumorales. Asegúrese de que la pieza se coloca en el extremo trasero del bolsillo de la piel.Aspirar el Matrigel restante y distribuir por igual a los cuatro bolsillos. Espere el curado del gel y cierre la piel con suturas de un solo botón sin dañar las piezas tumorales con la aguja. Corte la rosca lo más corta posible por encima del nudo y aplique apósito en aerosol para evitar que no se presenten las suturas.Escanee el microchip y agregue la información del tumor a la base de datos para su posterior identificación del animal. Preparar una jaula con ropa de cama fresca y material de anidación, colocar los ratones delante de una lámpara infrarroja y monitorear al animal hasta que la anestesia haya disminuido. Explantación de PDX.Después de que el tumor PDX ha alcanzado el tamaño requerido, el ratón es eutanasiado por asfixia de CO2 y posterior dislocación cervical. Disecciona cuidadosamente la piel del tumor y elimina la PDX por completo. Resultados representativos.Coloque un tumor en una platillo de plástico estéril y use cuchillas estériles del bisturí para su posterior procesamiento. Cortar agujero con las rodajas, colocarlos en un casete de histología y sumergirse en formalina para generar espécimen incrustado de parafina para su evaluación histológica en un momento posterior. Transfiera el resto del tumor a la solución de almacenamiento de tejidos y cree una nueva muestra congelada vitalmente conservada y a presión para el biobanco.Además, utilice los restos del tumor PDX análogos al cultivo celular capitular para establecer líneas celulares tumorales secundarias. Para generar más PDX, transfiera dos o más piezas tumorales con Matrigel a un nuevo ratón receptor como se muestra anteriormente. conclusión. A través del protocolo presentado, hasta ahora logramos establecer nueve líneas celulares cancerosas pancreáticas y más de 100 colorrectal derivadas del paciente, así como 19 modelos DEP pancreáticos y más de 150 colorrectal.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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