Name: Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprende a utilizar el sistema GAL4-UAS para análisis genético funcional en Anopheles gambiae, el principal vector de malaria. Este método permite el control espaciotemporal de la expresión génica para caracterizar fenotipos y estudiar genes involucrados en resistencia a insecticidas.

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Agradecemos la financiación de LSTM e IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (PhD studentship to BCP:MR/P016197/1), Wellcome (Sir Henry Wellcome Postdoctoral fellowship to LG: 215894/Z/19/Z) que han incorporado el análisis Gal4UAS en las propuestas.

<ol><li>Brand, A. H., Perimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+drosophila%3A+A+fly+geneticist%27s+swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> Journal of Genetics and Development. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDow%2C+JA+%22ELS%22">ELS</a>. , John WIley & Sons, Ltd. (2012).</li>
<li>Edi, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP6+P450+Enzymes+and+ACE-1+Duplication+Produce+Extreme+and+Multiple+Insecticide+Resistance+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS Genetics. 10 (3), 1004236(2014).</li>
<li>Daborn, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+melanogaster+to+validate+metabolism-based+insecticide+resistance+from+insect+pests%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila melanogaster to validate metabolism-based insecticide resistance from insect pests.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (12), 918-924 (2012).</li>
<li>Riveron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transcription+and+functional+analyses+reveal+heterogeneous+molecular+mechanisms+driving+pyrethroids+resistance+in+the+major+malaria+vector+Anopheles+funestus+across+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transcription and functional analyses reveal heterogeneous molecular mechanisms driving pyrethroids resistance in the major malaria vector Anopheles funestus across Africa.</a> Genes Genomes Genetics. 7 (6), 1819-1832 (2017).</li>
<li>Riveron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+mutation+in+the+GSTe2+gene+allows+tracking+of+metabolically+based+insecticide+resistance+in+a+major+malaria+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector.</a> Genome Biology. 15 (2), (2014).</li>
<li>Lynd, A., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Bi-Partite+Gal4-UAS+System+in+the+African+Malaria+Mosquito%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of the Bi-Partite Gal4-UAS System in the African Malaria Mosquito, Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 7 (2), 31552(2012).</li>
<li>Lynd, A., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Gal4-UAS+system+in+an+Anopheles+gambiae+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Gal4-UAS system in an Anopheles gambiae cell line.</a> Insect Molecular Biology. 20 (5), 599-608 (2011).</li>
<li>Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-tissue+GAL4-mediated+gene+expression+in+all+Anopheles+gambiae+life+stages+using+an+endogenous+polyubiquitin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).</li>
<li>Kokoza, V. A., Raikhel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+in+the+transgenic+Aedes+aegypti+using+the+binary+Gal4-UAS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression in the transgenic Aedes aegypti using the binary Gal4-UAS system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41, 637-644 (2011).</li>
<li>O'Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gal4-based+Enhancer-Trapping+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gal4-based Enhancer-Trapping in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi.</a> Genes Genomes Genetics. 2, 21305-21315 (2012).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Gut-Specific+Carboxypeptidase%3A+A+Study+Using+the+Binary+Gal4%2FUAS+System+in+the+Mosquito+Aedes+Aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Gut-Specific Carboxypeptidase: A Study Using the Binary Gal4/UAS System in the Mosquito Aedes Aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 54, 1-10 (2014).</li>
<li>Imamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Expression+Using+the+GAL4%2FUAS+System+in+the+Silkworm+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Expression Using the GAL4/UAS System in the Silkworm Bombyx mori.</a> Genetics. 165 (3), 1329-1340 (2003).</li>
<li>Lynd, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+functional+genetic+tool+for+Anopheles+gambiae+oenocyte+characterisation%3A+application+to+cuticular+hydrocarbon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: application to cuticular hydrocarbon synthesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Pondeville, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocyte-targeted+gene+expression+in+the+female+malaria+mosquito+using+the+hemolectin+promoter+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hemocyte-targeted gene expression in the female malaria mosquito using the hemolectin promoter from Drosophila.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103339(2020).</li>
<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+validation+of+key+genes+conferring+insecticide+resistance+in+the+major+African+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).</li>
<li>Pondeville, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+integrase-mediated+site-specific+germline+transformation+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).</li>
<li>Horn, C., Schmid, B. G. M., Pogoda, F. S., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+transformation+markers+for+insect+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent transformation markers for insect transgenesis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 32, 1221-1235 (2002).</li>
<li>Clements, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClements%2C+A+%22A.+Biology+of+Mosquitoes%2C+Volume+1%3A+Development%2C+Nutrition+and+Reproduction%22">A. Biology of Mosquitoes, Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction</a>. 1, CABI Publishing. (1992).</li>
<li>Trpiš, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+bleaching+and+decalcifying+method+for+general+use+in+zoology%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology.</a> Canadian Journal of Zoology. 48, 892-893 (1970).</li>
<li>Kaiser, M. L., Duncan, F. D., Brooke, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Development+and+Rates+of+Metabolic+Activity+in+Early+and+Late+Hatching+Eggs+of+the+Major+Malaria+Vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Embryonic Development and Rates of Metabolic Activity in Early and Late Hatching Eggs of the Major Malaria Vector Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 9 (12), 114381(2014).</li>
<li>Grigoraki, L., Grau-Bové, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transcriptomic+analysis+of+Anopheles+gambiae+oenocytes+enables+the+delineation+of+hydrocarbon+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Isolation and transcriptomic analysis of Anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis.</a> eLife. 9, 58019(2020).</li>
<li>Xiao, Y. -H., Yin, M. -H., Hou, L., Pei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+amplification+of+intron-containing+hairpin+RNA+construct+from+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA.</a> BioTechniques. 41 (5), 548-552 (2006).</li>
<li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+Mapping+of+a+Sequence+on+the+Drosophila+melanogaster+X+and+Y+Chromosomes+That+Is+Transcribed+during+Spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Organization and Mapping of a Sequence on the Drosophila melanogaster X and Y Chromosomes That Is Transcribed during Spermatogenesis.</a> Genetics. 107 (4), 611-634 (1984).</li>
<li>MR4, CDC, NEI & beiResources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+MR4+Methods+in+Anopheles+Research+Laboratory+Manual.+5th+Edition%22">The MR4 Methods in Anopheles Research Laboratory Manual. 5th Edition</a>. , (2015).</li>
<li>Sik Lee, Y., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+better+RNAi+vector+for+Drosophila%3A+use+of+intron+spacers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers.</a> Methods. 30 (4), 322-329 (2003).</li>
<li>Cha-aim, K., Hoshida, H., Fukunaga, T., Akada, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCha-aim%2C+K+%22Gene+Synthesis%3A+Methods+and+Protocols%22">Gene Synthesis: Methods and Protocols</a>. Peccoud, J. , Humana Press. 97-110 (2012).</li>
<li>Cavener, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+consensus+sequence+flanking+translational+start+sites+in+Drosophila+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of the consensus sequence flanking translational start sites in Drosophila and vertebrates.</a> Nucleic Acids Research. 15 (4), 1353-1361 (1987).</li>
<li>Wang, Y., Wang, F., Wang, R., Zhao, P., Xia, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2A+self-cleaving+peptide-based+multi-gene+expression+system+in+the+silkworm+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+sex+ratio+distortion+system+for+the+control+of+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito.</a> Nature Communications. 5, 3977(2014).</li>
<li>Kondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemical+organisation+of+the+Drosophila+Brain+Visualised+by+Endogenously+Tagged+Neurotransmitter+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neurochemical organisation of the Drosophila Brain Visualised by Endogenously Tagged Neurotransmitter Receptors.</a> Cell Reports. 30 (1), 284-297 (2020).</li>
<li>Lee, P. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-specific+T2A-GAL4+library+for+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila.</a> eLife. 7, 35574(2018).</li>
<li>Marois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sorting+of+mosquito+larvae+for+laboratory+studies+and+for+future+vector+control+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput sorting of mosquito larvae for laboratory studies and for future vector control interventions.</a> Malaria Journal. 11, 302(2012).</li>
<li>Crawford, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+male+Wolbachia-infected+Aedes+aegypti+mosquitoes+enables+large-scale+suppression+of+wild+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient production of male Wolbachia-infected Aedes aegypti mosquitoes enables large-scale suppression of wild populations.</a> Nature Biotechnology. 38 (4), 482-492 (2020).</li>
<li>Goltsev, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Developmental Biology. 330 (2), 462-470 (2009).</li>
<li>Rezende, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+desiccation+resistance+in+Aedes+aegypti%3A+presumptive+role+of+the+chitinized+Serosal+Cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized Serosal Cuticle.</a> BMC Developmental Biology. 8 (1), 82(2008).</li>
<li>Vargas, H. C. M., Farnesi, L. C., Martins, A. J., Valle, D., Rezende, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serosal+cuticle+formation+and+distinct+degrees+of+desiccation+resistance+in+embryos+of+the+mosquito+vectors+Aedes+aegypti%2C+Anopheles+aquasalis+and+Culex+quinquefasciatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Serosal cuticle formation and distinct degrees of desiccation resistance in embryos of the mosquito vectors Aedes aegypti, Anopheles aquasalis and Culex quinquefasciatus.</a> Journal of Insect Physiology. 62, 54-60 (2014).</li>
<li>Chang, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+non-canonical+Notch+signaling+is+essential+for+the+control+of+fertility+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The non-canonical Notch signaling is essential for the control of fertility in Aedes aegypti.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 12 (3), 0006307(2018).</li>
<li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Analysis+of+Protein+Expression+during+Aedes+aegypti+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Analysis of Protein Expression during Aedes aegypti Development.</a> Spring Harbor Protocols. 10, 1-4 (2010).</li>
<li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+in+situ+of+Salivary+Glands%2C+Ovaries+and+Embryos+of+Vector+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries and Embryos of Vector Mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e3709(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Comprender la función genética de los mosquitos es vital para desarrollar nuevos enfoques para controlar Anopheles e impactar la transmisión de la malaria. El sistema GAL4-UAS descrito es un sistema versátil y potente para el análisis funcional de genes candidatos y hasta la fecha hemos utilizado el sistema para examinar las bases genéticas de la resistencia a insecticidas17 y la producción de hidrocarburos cuticulares15,23, así c...

El sistema bipartito GAL4-UAS es el caballo de batalla de la caracterización funcional de genes en el organismo modelo de insectos Drosophila melanogaster1,2,3. Para utilizar el sistema GAL4-UAS, las líneas conductoras transgénicas, que expresan el factor de transcripción de levadura GAL4 bajo control de una secuencia reguladora, se cruzan con líneas de respuesta que llevan un gen de interés o construcción de interferencia de ARN (RNAi) controlada por una secuencia de activación ascendente (UAS) reconocida por GAL4. La progenie de este cruce expresa el transgén de interés en un patrón espaciotemporal dictado por el promotor que controla la expresión de GAL4 (Figura 1). Los fenotipos mostrados por la progenie de los cruces conductor-respondedor se pueden evaluar para dilucidar la función de los genes candidatos. Aunque D. melanogaster se ha utilizado para examinar genes de otros organismos4,5,6,7, el sistema GAL4-UAS ha sido adaptado para su uso en insectos de importancia médica y agrícola para proporcionar un análisis directo en las especies de interés 8,9,10,11,12,13,14.
En el mosquito africano de la malaria, Anopheles gambiae, el sistema GAL4-UAS se probó por primera vez mediante la coinfección de líneas celulares9. Se ensayaron múltiples construcciones para determinar la eficiencia en diferentes combinaciones por pares y se encontró que 14 UAS repetidos en tándem complementados con un pequeño intrón artificial (UAS-14i) mostraron el rango más amplio de potencial de activación cuando se usaron con un panel de controladores GAL4. Para demostrar la funcionalidad in vivo, estos constructos se utilizaron para crear dos líneas transgénicas separadas de An. gambiae mediante transformación de PiggyBac8: una línea conductora que transporta GAL4 impulsada por un promotor específico del intestino medio, y una línea de respuesta que contiene tanto la luciferasa como los genes de proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP) bajo regulación de secuencias de UAS. La actividad de la luciferasa específica intestinal y la fluorescencia en la progenie indicaron que el sistema era eficiente en Anopheles. Desde entonces, se han creado líneas conductoras que expresan transgenes en otros tejidos importantes para la capacidad vectorial y la resistencia a los insecticidas, incluidos los enocitos15 y hemocitos16, y en un patrón casi ubicuo10. También se han generado numerosas líneas de UAS para evaluar genes que se cree que están involucrados en el metabolismo y la resistencia a insecticidas mediada por el secuestro, la síntesis de hidrocarburos cuticulares y para etiquetar fluorescentemente diferentes tipos de células y tejidos (Tabla 1). Para las líneas de respuesta, la integración dirigida al sitio del transgén ahora se realiza mediante el intercambio de casetes de recombinación catalizados por ΦC311111111 para fijar el contexto genómico de los genes regulados por UAS. De esta manera, la expresión transgénica se normaliza con respecto a la ubicación de la inserción genómica, lo que permite una comparación más precisa de los efectos fenotípicos de diferentes genes candidatos.
Las líneas de respuesta creadas hasta la fecha están diseñadas para expresar el transgén a niveles elevados o para reducir la expresión génica a través de la interferencia de ARN (ARNi). Por lo general, los clones de ADNc se fusionan con la secuencia UAS para generar plásmidos de expresión adecuados, sin embargo, las secuencias genómicas completas también son factibles suponiendo que no sean demasiado grandes para la clonación. Para generar construcciones silenciadoras, hemos utilizado tres métodos diferentes para obtener secuencias invertidas en tándem adecuadas que forman dsRNA de horquilla que estimula el ARNi. Estos han incluido PCR de fusión, PCR asimétrica y síntesis comercial de construcciones de horquilla. Común a cada método es la inclusión de una secuencia de intrón entre las secuencias invertidas para proporcionar estabilidad de clonación. Se han desarrollado plásmidos respondedores en los que se puede insertar un gen de interés/construcción de ARNi15. Estos plásmidos también llevan los sitios attB ΦC31 requeridos para RMCE (descritos en el artículo de Adolfi que acompaña a JoVE que describe la técnica RCME en detalle). En este manuscrito se incluyen protocolos que cubren los pasos importantes requeridos al seleccionar la secuencia para la inserción en uno de estos plásmidos para la sobreexpresión. Además, se describen e ilustran dos protocolos para la creación de construcciones de horquillas de RNAi.
Al crear nuevas líneas, la identificación de individuos transgénicos raros es crucial para reproducirse para establecer y mantener colonias transgénicas. Lo más importante para el sistema GAL4-UAS es la necesidad de distinguir las líneas de respuesta y conductor para establecer cruces e identificar la progenie individual que transporta ambos transgenes. Esto se logra mediante el uso de diferentes genes marcadores seleccionables dominantes vinculados a los casetes del conductor y del respondedor. Más comúnmente, estos son genes marcadores fluorescentes que son claramente distinguibles utilizando filtros ópticos (por ejemplo, eYFP, eCFP, dsRed). Es importante que los marcadores se expresen en un patrón espaciotemporal conocido y confiable, ya que esto facilita la identificación de anomalías y contaminación. La expresión génica del marcador fluorescente es regulada rutinariamente por el promotor sintético 3xP3, que causa la expresión específica de los ganglios oculares y ventrales en todas las etapas del desarrollo de An. gambiae19. Los marcadores fluorescentes controlados por 3xP3 se incluyen en todos los plásmidos de transformación descritos en este artículo. Aquí se incluye un protocolo que detalla los métodos comunes utilizados para detectar líneas fluorescentes an. gambiae pupae GAL4-UAS.
Uno de los elementos clave del sistema GAL4-UAS es la necesidad de cruzar las líneas de conductor y respuesta marcadas diferencialmente. Para hacer esto, los machos y las hembras de cada línea deben separarse antes del apareamiento. Los adultos son fácilmente distinguibles por la vista, sin embargo, para establecer cruces genéticos es sensato separar los sexos antes de la aparición adulta para garantizar que no se haya producido el apareamiento. La diferencia general de tamaño entre las pupas de An. gambiae macho y hembra es demasiado variable para ser un método eficiente y confiable de determinación del sexo20. En cambio, las claras diferencias morfológicas en los genitales externos proporcionan una base confiable para el sexado en An. gambiae. En este artículo, describimos un método confiable para sexar pupas de An. gambiae para establecer cruces apropiados.
<img alt="Proceso de edición de genes con ARNi en mosquitos, diagrama que cubre clonación, inyecciones y análisis fenotípico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62131/62131fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1 - Representación esquemática del proceso para el uso del sistema bipartito GAL4-UAS en Anopheles gambiae. (A) Se representan los componentes principales de un vector de ejemplo (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]), detallando los sitios de restricción disponibles (EcoRI, NheI, XhoI y NcoI) dentro de los múltiples sitios de clonación que son adecuados para su uso para insertar la construcción de horquilla o la secuencia de codificación para el gen de interés. También se representa la estructura de la línea de acoplamiento. (B) El paso de cruce se ilustra indicando el uso de machos de la línea del conductor (que transportan al conductor GAL4 por un promotor de interés y eCFP impulsado por el promotor 3xP3) y hembras de la línea de respuesta (portadores del gen de interés o construcción de horquilla controlada por un promotor de UAS y un marcador eYFP controlado por el promotor 3xP3). (C) Una representación esquemática de GAL4 que impulsa la expresión del gen de interés en la progenie de la cruz en B y una lista de algunos de los fenotipos típicos que se evalúan. Abreviaturas: Sitio de clonación múltiple (MCS), Intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE), Secuencia del activador ascendente (UAS), Proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP), Proteína fluorescente cian mejorada (eCFP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62131/62131fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Es el uso de cruces lo que proporciona la naturaleza bipartita del sistema GAL4-UAS, que tiene claras ventajas sobre los enfoques más lineales. Por ejemplo, se pueden evaluar muchas más combinaciones de líneas de conductor y respuesta de lo que sería factible si se tuviera que generar y mantener una nueva línea transgénica para cada combinación promotor/gen. Más importante aún, permite el análisis de genes que producen fenotipos letales o estériles cuando se perturba su expresión que son difíciles de crear/mantener en un sistema lineal. Tales fenotipos letales pueden manifestarse en todas las etapas del desarrollo, dependiendo de la función génica y la expresión espaciotemporal, pero se observan con mayor frecuencia durante el desarrollo embrionario. Visualizar el desarrollo embrionario del mosquito requiere la limpieza del corion opaco que recubre los huevos. Siguiendo los métodos descritos en Trpiš (1970)21 y Kaiser et al. (2014)22, describimos los protocolos que utilizamos para fijar embriones, manteniendo la integridad estructural, y el blanqueamiento para despejar el endodocoro que permite la visualización microscópica y la obtención de imágenes.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de plástico de 100 x 15 mm</td><td>SLS</td><td>2175546</td><td>Paquete de 10</td></tr><tr><td>1000 y micro; L Pipeta Gilson</td><td>Gilson</td><td>F144059P</td><td></td></tr><tr><td>20/25 mL Tubos Universales</td><td>Starlab</td><td>E1412-3020</td><td>Pack de 400</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de 3 mL</td><td>SLS</td><td>G612398</td><td>Greiner Pipeta Pasteur 3 mL estéril envuelta individualmente</td></tr><tr><td>50 mL Tubos Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>11512303</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>SLS</td><td>45726-1L-F</td><td>Jaulas de 1 L</td></tr><tr><td></td><td>SLS</td><td>E6099</td><td>30x30x30 con puerto de pantalla</td></tr><tr><td>Pinceles finos</td><td>Amazon</td><td>UKDPB66</td><td>KOLAMOON Juego de pinceles de pintura de detalle de 9 piezas Pinceles de minitura para acuarela, pintura acrílica, pintura al óleo (rojo vino)</td></tr><tr><td>Comida para peces</td><td>Amazon</td><td></td><td>Tetra Min Fish Food, alimento completo para todos los peces tropicales para la salud, el color y la vitalidad, 10 l&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Aspirador bucal</td><td>John Hock</td><td>612</td><td></td></tr><tr><td>Sal de estanque</td><td>Amazon</td><td></td><td>Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, para la salud de los peces, calidad del agua, tónico general, tampón de pH, 9,08 kg, trata 9.092 L&nbsp;</td></tr><tr><td>Macetas de pupas</td><td>Cater4you</td><td>SP8OZ</td><td>250 macetas con tapa Cubos</td></tr><tr><td>de plástico pequeños Amazon</td><td></td><td></td><td>2.5 L Cubo de plástico blanco completo con tapa blanca (paquete de 10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25552</td><td></td></tr></tbody></table>

uso del sistema gal4-uas para genética funcional en anopheles gambiae

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil y potente para el análisis genético funcional. La esencia del sistema es cruzar líneas transgénicas "conductoras" que expresan el factor de transcripción de levadura GAL4 de una manera específica del tejido, con líneas transgénicas "respondedoras" que llevan una construcción candidata de interferencia de gen / ARN cuya expresión está controlada por secuencias de activación ascendentes (UAS) que se unen a GAL4. En la progenie subsiguiente, el gen o la construcción silenciadora se expresa de una manera espaciotemporal prescrita, lo que permite ensayar los fenotipos resultantes e inferir la función génica. El sistema binario permite flexibilidad en los enfoques experimentales para detectar fenotipos generados por la expresión transgénica en múltiples patrones específicos de tejidos, incluso si se inducen costos severos de aptitud física. Hemos adaptado este sistema para Anopheles gambiae, el principal vector de malaria en África.
En este artículo, proporcionamos algunos de los procedimientos comunes utilizados durante el análisis GAL4-UAS. Describimos las líneas GAL4-UAS de An. gambiae ya generadas, así como la clonación de nuevas construcciones de respuesta para la regulación ascendente y el derribo de ARNi. Especificamos una guía paso a paso para el sexado de pupas de mosquitos para establecer cruces genéticos, que también incluye la detección de la progenie para seguir la herencia de marcadores genéticos fluorescentes que etiquetan las inserciones del conductor y del respondedor. También presentamos un protocolo para la limpieza de embriones de An. gambiae para estudiar el desarrollo embrionario. Finalmente, introducimos posibles adaptaciones del método para generar líneas conductoras a través de la inserción CRISPR/Cas9 de GAL4 aguas abajo de los genes diana.

La expresión 3xP3 de eYFP, dsRed y eCFP proporciona una identificación confiable y fácilmente distinguible de individuos que poseen los genes marcadores que producen expresión en los ojos y los ganglios ventrales de las pupas de An. gambiae (Figura 3). La morfología diferencial observada en los genitales externos masculinos y femeninos utilizados para el sexado y un ejemplo de pupas no identificables se destacan en la Figura 4. La eliminación d...

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada que permite el análisis genético funcional en Anopheles gambiae. Los procedimientos descritos para el uso de este sistema son una estrategia de clonación semi-estandarizada, sexado y cribado de pupas para marcadores de proteínas fluorescentes y fijación embrionaria.

Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para el análisis genético funcional en Anopheles gambiae a través de la modificación genética de la expresión génica de manera espaciotemporal controlada. El sistema binario permite flexibilidad en los enfoques experimentales para la caracterización fenotípica de la expresión transgénica, incluso si se inducen costos severos de aptitud. Este sistema se puede utilizar para la caracterización fenotípica de genes potencialmente involucrados en la resistencia a insecticidas, la transmisión de patógenos o aquellos que tienen usos en métodos de control genético.Fraser Coleman, un técnico de investigación, ayudará a demostrar este procedimiento Comience recolectando pupas usando una pipeta Pasteur de plástico de tres mililitros con el extremo cortado en un plato plano transparente adecuado para su uso con un microscopio estéreo. Retire con cuidado la mayor parte del agua alrededor de las pupas. Encienda la bombilla fluorescente y deje que se caliente.Considere los patrones espaciotemporales de color de una expresión y proporción de diferentes fenotipos que se esperan al detectar marcadores fluorescentes. Seleccione el filtro requerido en el estereoscopio de fluorescencia y verifique que haya un haz de luz de color visible que se dirija al centro de la placa del escenario. Bajo luz blanca, centra las pupas en el campo de visión y enfócalas.Apague la luz blanca y use el enfoque fino para enfocar el área de las pupas que llevan el fenotipo de interés con un patrón fluorescente visible. Use un pincel de detalle fino para girar suavemente las pupas y mueva las paletas anales para que se puedan identificar los genitales externos. Pupas separadas basadas en genitales externos distintivos.Los machos tienen un tubo largo que extruye desde el segmento dorsal final aproximadamente la mitad de la longitud de las paletas anales. Los genitales externos de las pupas femeninas son considerablemente más cortos y bifurcados. Separe las pupas sexadas en grupos de 10 o menos en tubos transparentes de 20 mililitros con agua, y selle los tubos con una bola de algodón.Aspire el número deseado de adultos machos y hembras de los tubos en una jaula o cubo pequeño, teniendo cuidado de no dañar a los adultos durante esta transferencia. Mantenga la cruz durante cinco a siete días antes de la alimentación con sangre. Al día siguiente, se pueden recolectar óvulos para estudiar el desarrollo embrionario.Ensamble la cámara de oviposición e introduzca cuidadosamente de 10 a 15 hembras alimentadas con sangre en ella. Cubra la cámara de oviposición y deje actuar durante 20 minutos. Separe cuidadosamente el tubo de polipropileno de 50 mililitros de la olla de oviposición, asegurándose de no liberar a los mosquitos.Cubra la maceta y permita que los huevos maduren hasta la etapa de desarrollo de interés. Recoge los huevos de la olla con un pincel de detalles finos y colócalos sobre el agua en un bloque de vidrio excavado de 40 milímetros cuadrados. Retire cuidadosamente el agua del bloque de vidrio con una micropipeta y cubra los huevos en 500 microlitros de FAA.Oscile suavemente sobre el agitador orbital a temperatura ambiente durante 30 minutos. Enjuague bien los huevos 15 veces con agua destilada para eliminar todos los rastros de solución FAA. Usando una micropipeta de 1000 microlitros agregue y luego retire un mililitro de agua destilada a la vez, teniendo cuidado de no dañar los huevos mientras lo hace.Cubra los huevos fijos con un mililitro de solución de Trpis e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los huevos comenzarán a desarrollar parches pálidos después de cinco minutos de incubación, alcanzando finalmente un color blanco lechoso una vez despejados. Enjuague bien los huevos 15 veces con agua destilada para eliminar todos los rastros de solución de Trpis.La expresión de marcadores fluorescentes impulsados por el promotor 3xP3 se observa en los ojos y ganglios ventrales de las pupas de Anopheles gambiae. El uso de marcadores fluorescentes de diferentes colores permite la selección y detección de individuos modificados que llevan diferentes componentes GAL4 y UAS. Cuando se trabaja con un sistema BIPARTITO GAL4-UAS, es necesario cruzar machos y hembras de diferentes cepas para adquirir progenie llevando tanto los componentes GAL4 como UAS.La morfología diferencial observada en el genital externo masculino y femenino de las pupas se utiliza para el sexado. Aquí se destaca un ejemplo de una pupa no identificable. La eliminación de toda el agua de las pupas, como se muestra a la derecha, aumenta la dificultad de sexado ya que las paletas anales oscurecen la visualización de los genitales.El sistema bipartito GAL4-UAS permite la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada. Esto se puede visualizar cruzando el enocito y el omnipresente GAL4 cuatro líneas de conductor que expresan con la línea de respuesta UAS-mCherry. Un beneficio clave del uso de un sistema bipartito GAL4-UAS es la facilidad de estudiar fenotipos letales incluso en la etapa embrionaria.Para ello, es necesario visualizar la morfología interna de los embriones. Las características morfológicas normales observadas en diferentes etapas del desarrollo embrionario a las 12, 24 y 36 horas después de la puesta se pueden ver después de la finalización del protocolo de limpieza embrionaria. Es vital a lo largo de este procedimiento que no se permita que las pupas y los huevos se desecan.Por lo tanto, es importante trabajar rápidamente al eliminar líquidos. El método GAL4-UAS nos ha permitido caracterizar funcionalmente genes implicados en la resistencia a los insecticidas y aquellos con usos potenciales en los métodos de control de impulsores genéticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Se describe un Flippase inducida intersectorial Gal80/Gal4 represión (FINGR) método, permitiendo al tejido-específica para determinar FLP GAL80 patrones de expresión. Siempre que sea Gal4 y la superposición de FLP, Gal4 expresión es activada (GAL80 un tirón hacia fuera) o desactivar (GAL80 volcó en). El método FINGR es versátil para el análisis clonal y la asignación de circuitos neuronales.

La cartografía y la aplicación de potenciador de la trampa de expresión Flippase en larvas y adultos Drosophila SNC

Los ensamblajes genómicos basados en tecnologías de secuenciación masivamente paralela del ADN suelen ser altamente fragmentados. El desarrollo de mapas cromosómicos físicos puede mejorar potencialmente los ensamblajes genómicos. Aquí, demostramos enfoques innovadores para la preparación de cromosomas, hibridación fluorescente in situ y análisis de imágenes que aumentan significativamente el rendimiento en el desarrollo de mapas físicos.

De alto rendimiento mapeo físico de cromosomas utilizando automatizado<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

En este video, demostramos la entrega de una construcción de impulsor genético en el embrión del mosquito Anopheles gambiae a través de la técnica de microinyección de embriones. Este procedimiento permite la integración de la construcción de ADN entregada, a través de la recombinación homóloga, en las células de la línea germinal para generar una población de mosquitos transformada.

Microinyección de embriones de mosquitos: una técnica para introducir ADN exógeno en la yema del embrión de Anopheles gambiae para generar mutaciones de la línea germinal

Este protocolo describe el método de trampa de genes inserción mutagénesis usando Gal4-VP16 como el reportero principal y GFP / RFP como reporteros secundarias en el pez cebra. Aproximadamente uno de cada diez-alta expresión de genes rendimiento pesquero F0 trampa progenie co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP. El procedimiento de detección se puede escalar fácilmente para adaptarse al tamaño de la pantalla de laboratorio que realice la mutagénesis de inserción.

Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra

En este artículo de vídeo, se describe un ensayo automatizado para medir el efecto del hambre o la saciedad en el comportamiento de búsqueda de comida dependiente olfativo en la mosca adulta fruta Drosophila melanogaster.

Un ensayo de una sola mosca por el comportamiento de forrajeo en Drosophila

La interferencia de ARN (ARNi) es una herramienta extremadamente valiosa para descubrir la función de los genes. Sin embargo, la capacidad de dirigirse a genes utilizando ARNi durante las etapas preadultas es limitada en el principal vector de la malaria humana, Anopheles gambiae. Describimos un protocolo de ARNi para reducir la función génica mediante inyección directa durante el desarrollo de la pupa.

RNAi gatillo en la entrega<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Las pupas

El objetivo de este protocolo es esbozar el diseño y la realización de experimentos in vivo en Drosophila melanogaster para evaluar las consecuencias funcionales de las variantes genéticas raras asociadas con las enfermedades humanas.

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Las técnicas de microinyección son esenciales para introducir genes exógenos en los genomas de los mosquitos. Este protocolo explica un método utilizado por el laboratorio James para microinyectar construcciones de ADN en embriones de Anopheles gambiae para generar mosquitos transformados.

Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae

La administración oral de dsRNA producido por bacterias, un método de administración para la interferencia de ARN (RNAi) que se usa rutinariamente en Caenorhabditis elegans, se aplicó con éxito aquí a mosquitos adultos. Nuestro método permite estudios robustos de genética inversa y estudios de vectores que bloquean la transmisión sin el uso de inyección.

Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae

Este artículo toma como ejemplo la transgénesis mediada por la integrasa phiC31 en Drosophila y presenta un protocolo optimizado para la microinyección de embriones, un paso crucial para la creación de moscas transgénicas.

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Aprende a utilizar el sistema GAL4-UAS para análisis genético funcional en Anopheles gambiae, el principal vector de malaria. Este método permite el control espaciotemporal de la expresión génica para caracterizar fenotipos y estudiar genes involucrados en resistencia a insecticidas.

Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

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