Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Este protocolo apoya la caracterización del papel de los genes de mosquitos involucrados en una variedad de vías fisiológicas, incluyendo, por ejemplo, la resistencia a los insectos y el desarrollo de parásitos de la malaria. El método impulsa la inserción de transgenes en ubicaciones genómicas precaracterizadas individuales y, por lo tanto, permite comparar directamente los fenotipos resultantes de transgenes alternativos evitando efectivamente el problema del efecto posicional. Este método se puede aplicar a una variedad de especies de insectos de importancia agrícola y de salud pública y sus aplicaciones se extienden ampliamente desde bacterias hasta células de mamíferos.

Comience por diseñar plásmidos donantes de attB que lleven el marcador fluorescente dominante, los sitios de recombinación de attB y la carga transgénica deseada. Utilice un solo sitio attB para la integración de todo el plásmido que transporta el cassette transgénico o dos sitios attB invertidos para el intercambio de cassette. Purifique los plásmidos donantes y ayudantes utilizando un kit de purificación libre de endotoxinas.

Combinar el plásmido donante marcado attB portador del transgén de interés y el plásmido ayudante que lleva la integrasa para obtener una mezcla con una concentración final de 350 nanogramos por microlitro del plásmido donante y 150 nanogramos por microlitro del plásmido ayudante. Precipitar el ADN agregando 0.1 volumen de acetato de sodio de tres molares y 2.5 volúmenes de etanol 100% frío, luego vórtice. Un precipitado blanco debe ser inmediatamente visible.

Lave el pellet y vuelva a suspenderlo en tampón de inyección para alcanzar una concentración final total de 500 nanogramos por microlitro. Luego prepare alícuotas de 10-15 microlitros cada una y guárdelas a 20 grados centígrados negativos. La sangre alimenta a los mosquitos de cuatro a siete días de edad de la línea de acoplamiento deseada y sus contrapartes de tipo salvaje 72 horas antes de la microinyección.

Realice microinyecciones embrionarias de Anopheles gambiae en cloruro de sodio 25 milimolares dirigiéndose al polo posterior del embrión en un ángulo de 45 grados. Realice microinyecciones embrionarias de Anopheles stephensi en aceite de halocarbono apuntando al polo posterior en un ángulo de 30 grados. Inmediatamente después de la inyección, transfiera los huevos a una placa de Petri llena de agua destilada estéril y devuélvalos a condiciones insectarias.

Al eclosionar, transfiera la larva G0 a una bandeja con agua destilada salada diariamente y vuelva a las pupas. Clasifica las pupas G0 por sexo bajo un estereoscopio. Permita que los machos emerjan en jaulas separadas en grupos de tres a cinco y agregue un exceso de diez veces de hembras de tipo salvaje emparejadas por edad.

Permita que las hembras emerjan en jaulas separadas en grupos de 10 a 15 y agregue un número igual de machos de tipo salvaje de la misma edad. Permita que los adultos se apareen durante cuatro a cinco días y proporcione a las hembras una comida de sangre. Recoge los huevos y cría los G1 emergentes de próxima generación.

Recoja las larvas G1, L3 y L4 en una placa de Petri forrada con papel de filtro húmedo o en un portaobjetos de microscopio y aprátelas con un estereoscopio fluorescente para detectar la presencia del marcador introducido con la carga etiquetada con attB. Para diseños de attB individuales, pantalla para la presencia del marcador nuevo y preexistente. Para diseños de doble attB para intercambio de casetes, pantalla para la presencia del nuevo marcador y la pérdida del preexistente.

Clasifica las pupas G1 transformadas por sexo y cúbrelas en masa con individuos de tipo salvaje de sexo opuesto de la misma edad. Permita que los adultos se apareen durante cuatro o cinco días y proporcione una comida de sangre. Para experimentos de integración individual, recolecte huevos directamente de la cruz en masa.

Para los experimentos de intercambio de casetes, recoja los huevos de hembras individuales y mantenga la progenie separada hasta que se complete la evaluación molecular debido a la posible presencia de dos orientaciones alternativas de casete. Examinar la progenie G2 para detectar la presencia del marcador fluorescente y reservar un subconjunto de individuos G2 positivos para el análisis molecular. Criar al resto hasta la edad adulta.

Realizar la validación molecular de los sitios de inserción con PCR como se describe en el texto manuscrito. Para una sola integración, asegúrese de que el sitio de inserción predicho lleve la construcción de acoplamiento original, más toda la secuencia del plásmido donante entre los dos sitios híbridos attL y attR. Para el intercambio de casetes, asegúrese de que el sitio de inserción previsto sea idéntico al de la línea de acoplamiento, donde los sitios attL invertidos híbridos reemplazan a los sitios attP invertidos originales y la plantilla de intercambio reemplaza el cassette originalmente presente entre ellos.

El protocolo se utilizó para generar una línea transgénica estable de Anopheles en aproximadamente 10 semanas. La validación fenotípica de la transformación se realizó mediante el cribado de marcadores fluorescentes regulados por el promotor 3xP3 que se muestran aquí. Se obtuvo una nueva línea Anopheles stephensi mediante la inserción de un cassette marcado en rojo DS en una línea de acoplamiento marcada con CFP, lo que dio como resultado que la progenie G1 expresara ambos marcadores según lo indicado por la fluorescencia roja y azul en los ojos.

Los diseños de intercambio de casetes dan como resultado el reemplazo del marcador originalmente insertado en la línea de acoplamiento con el del plásmido donante. Este intercambio de marcadores se demostró en una línea de acoplamiento de Anopheles gambiae donde se perdió el marcador CFP y se adquirió el marcador YFP, lo que resultó en fluorescencia amarilla del ojo y del cordón nervioso. Ocasionalmente, RMCE puede resultar en un solo evento de integración en lugar del intercambio del casete transgénico deseado donde una larva está marcada tanto con el CFP original como con los nuevos marcadores YFP.

Al detectar la presencia de un marcador fluorescente, es crucial distinguir su señal de la posible autofluorescencia de fondo. Es necesario aumentar la ampliación y centrarse en los tejidos y órganos donde se espera que la fluorescencia sea impulsada por el promotor para identificar verdaderos individuos positivos para la PPC. Los transformadores individuales también se evaluaron molecularmente a través de PCR para confirmar el sitio de inserción esperado.

La validación de PCR en individuos de una línea de intercambio de Anopheles gambiae se muestra aquí. Incluso la técnica de microinyección adecuada, el diseño preciso y la preparación del donante y los plásmidos ayudantes, así como el seguimiento del esquema apropiado de cría de mosquitos son clave para la obtención de individuos transgénicos. Este procedimiento se puede utilizar para insertar elementos que causan sobreexpresión o silenciamiento de genes, por ejemplo, el sistema GAL4 / UAS, así como elementos impulsores de genes y moléculas antipatógenas para el control genético de mosquitos.