Name: Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprende a realizar modificaciones genómicas dirigidas en mosquitos Anopheles usando el sistema φC31. Este método permite integrar y cambiar casetes transgénicos para estudiar genes relacionados con la resistencia a la malaria.

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Agradecemos a Kiona Parker (UCI) por proporcionar imágenes de larvas transgénicas de An. stephensi , y a Fraser Colman (LSTM) y Beth Poulton (LSTM) por proporcionar larvas transgénicas de An. gambiae . Beth Poulton (LSTM) también proporcionó una valiosa asistencia durante las imágenes de las larvas de An. gambiae . Este trabajo fue financiado por el Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) y el Director Catalyst Fund de LSTM otorgado a A.A. (DCF2014AA). A.A.J. es profesor Donald Bren en la Universidad de California, Irvine.

Los autores no tienen nada que revelar.

El diseño preciso de plásmidos marcados con attB que sean compatibles con la línea de acoplamiento de elección es primordial para el éxito del experimento. Se debe considerar cuidadosamente la elección del marcador utilizado para el cribado de transformadores, incluido el color de fluorescencia y su patrón de expresión, que estará sujeto al patrón ya presente en la línea de acoplamiento. Es necesario utilizar marcadores fluorescentes que sean fácilmente distinguibles: las buenas combinaciones de marcadores incluyen RFP (rojo) / CFP (cian), RFP (rojo) / GFP (verde), RFP (rojo) / YFP (amarillo) y YFP (amarillo) / CFP (cian), mientras que las combinaciones a evitar son YFP (amarillo) / GFP (verde) y CFP (cian) / GFP (verde). El promotor 3xP39, específico para los ojos y el cordón nervioso, es el más utilizado para impulsar la expresión de marcadores fluorescentes para la transgénesis de mosquitos. De hecho, todas las líneas de acoplamiento de Anopheles actualmente disponibles utilizan este promotor. Las regiones reguladoras alternativas son la del gen de la poliubiquitina An. gambiae (PUBc)5 o el promotor viral IE120, que impulsan la expresión en múltiples tejidos. Cuando se usan junto con 3xP3, estos promotores ampliarían las posibles combinaciones de colores e incluso el uso del mismo fluoróforo. Los promotores indicados están activos durante todo el ciclo de vida del mosquito, lo que permite el cribado y la monitorización de la fluorescencia en todas las etapas de la vida. Una consideración adicional durante el diseño de plásmidos es el tamaño de la carga a integrar o intercambiar. Si bien el sistema φC31 tiene notables capacidades de carga18, debe considerarse que el tamaño del plásmido donante generalmente se correlaciona negativamente con la eficiencia de transformación22.
En el protocolo descrito, la fuente de integrasa es un plásmido ayudante que expresa la enzima de forma ubicua40. La presencia ubicua de la integrasa puede conducir a la transformación de las células somáticas si las microinyecciones no se dirigen con precisión al área donde se forma la línea germinal. Si bien tales eventos de transformación se perderán ya que no son hereditarios, los efectos somáticos pueden disminuir la aptitud de los individuos inyectados. Para evitar esto y aumentar la eficiencia de transformación, la expresión de la integrasa puede restringirse a la línea germinal, por ejemplo, mediante el uso del promotor vasa22,26. Otros protocolos describen el uso de ARN mensajero transcrito in vitro (ARNm) como fuente de integrasa φC3111111111,24,43. Sin embargo, esto implica la preparación laboriosa de ARNm y requiere un manejo cuidadoso de la mezcla de inyección y el uso de reactivos libres de RNasa para evitar la degradación. Se ha demostrado que las fuentes plasmáticas de integrasa tanto en An. gambiae9,21,22,26,33,37 como en An. stephensi (A.A. comunicación personal) son confiables y conducen a una transformación eficiente, y por lo tanto son nuestra opción preferida. Otra opción para la entrega de integrase es su producción in vivo en líneas auxiliares de autoacoplamiento. Tales líneas fueron creadas en An. gambiae que expresan la integrasa φC31 bajo la regulación de los nanos promotores específicos de la línea germinal y se encontró que conducen a una mejor supervivencia y eficiencia de transformación20. Sin embargo, se deben considerar las cargas potenciales de aptitud impuestas por la producción in vivo de la enzima integrasa en la línea auxiliar.
Al igual que con otras técnicas transgénicas, se debe tener especial cuidado en la cría y el cruce de individuos derivados de embriones inyectados para maximizar las posibilidades de recuperar transformadores. Los individuos que han heredado de manera estable el transgén pueden recuperarse primero en la progenie G1. Sin embargo, los primeros signos de transformación potencial pueden evaluarse mediante la presencia de expresión episomal transitoria del marcador fluorescente en las papilas anales y/o el cordón nervioso de las larvas G0 de primer y segundo instar cuando se utiliza el promotor 3xP343. Si bien la presencia de fluorescencia transitoria sugiere una administración exitosa de plásmidos, no garantiza la transformación hereditaria de la línea germinal. Del mismo modo, la falta de expresión transitoria no excluye la transformación exitosa. Sin embargo, se ha observado que los individuos transitoriamente positivos tienen más probabilidades de producir progenie transgénica en comparación con los transitorios negativos43,48. En manos expertas, la cría y el cruce de solo individuos positivos puede ser una opción para reducir el número de mosquitos. Sin embargo, dada la importancia y fragilidad de las larvas pequeñas de G0, la menor cantidad de manipulación sigue siendo aconsejable y siempre se recomienda la cría de todos los individuos G0.
El esquema de apareamiento reportado en este protocolo está diseñado para maximizar la posibilidad de apareamiento y aislar eventos de transformación independientes. Sin embargo, si el espacio insectario o la disponibilidad de personal es un problema, los adultos G0 se pueden agrupar por sexo en jaulas individuales si se proporcionan suficientes individuos del sexo opuesto. Tal configuración no permitirá la discriminación entre múltiples eventos de transformación que ocurren en individuos de la misma jaula. Dependiendo de la configuración experimental, se espera la presencia de un marcador doble (integración simple) o simple (RMCE) durante el proceso de selección. En experimentos de integración única es importante verificar la presencia del marcador original de la línea de acoplamiento, mientras que en RMCE es importante verificar la pérdida del marcador previamente integrado. De hecho, no es raro en los diseños RMCE recuperar transformadores en los que se produjo una sola integración en lugar de intercambio debido a la recombinación de un solo sitio attP9,33. En tales individuos, tanto los marcadores fluorescentes están presentes como toda la columna vertebral del plásmido del donante, lo que destaca la importancia de realizar un cribado exhaustivo de ambos marcadores fluorescentes.
Si bien la presencia de patrones de fluorescencia esperados indica una transformación exitosa, se debe realizar la caracterización molecular del sitio de inserción. Para ello, la preparación de mapas precisos del locus de inserción previsto, incluidas las regiones genómicas flanqueantes de la línea de acoplamiento, es crucial para el diseño de cebadores de oligonucleótidos de diagnóstico adecuados para los análisis de amplificación de genes. Los eventos de integración individual dan como resultado la formación de sitios híbridos attR y attL en la unión entre el ADN recién integrado y el cassette previamente insertado. Estos sitios pueden ser objeto de validación de sitios de inserción. En los diseños RMCE, la inserción del cassette donante puede ocurrir en dos orientaciones alternativas con respecto al locus genómico, por lo que se pueden usar cuatro cebadores en combinaciones alternativas de PCR para detectar qué orientación lleva la línea. Como la orientación de la inserción del cassette puede afectar la expresión transgénica, en el análisis comparativo de la expresión génica es importante utilizar líneas que lleven la misma orientación de inserción.
Cuando se trabaja con un bajo número de transformadores, puede que no sea deseable sacrificar individuos enteros para el análisis molecular. Una opción para esto es la realización de análisis moleculares en el ADN extraído de las piernas de un solo adulto46, ya que la pérdida de piernas no afecta la capacidad de una hembra adulta para aparearse y oviposit49. Sin embargo, existe el riesgo de dañar al individuo en el proceso de extracción de piernas. El éxito se ha obtenido utilizando casos de pupa descartados (comunicación personal de L. Grigoraki), sin embargo, el enfoque más seguro es realizar análisis moleculares en padres G2 después de obtener progenie G3 viable.
En los últimos años, CRISPR/Cas9 ha revolucionado la forma de realizar la edición del genoma site-specific26,41,50,51. A diferencia de la RMCE dirigida al sitio, las integraciones de genes mediadas por CRISPR / Cas9 (knock-ins) son independientes de la presencia de sitios de recombinación preinsertados con solo un evento de transformación de un paso necesario. Sin embargo, el sistema CRISPR/Cas9 se basa en la presencia de grandes secuencias genómicas conocidas que flanquean el sitio de inserción deseado para una reparación dirigida a homología exitosa, así como en el reconocimiento eficiente del sitio mediado por ARN guía. Estas condiciones no siempre se pueden cumplir o pueden ser laboriosas de solucionar y, dada la disponibilidad de múltiples líneas de acoplamiento en An. gambiae y An. stephensi y líneas derivadas de ellas, el sistema φC31 sigue siendo una herramienta muy valiosa para realizar comparaciones fenotípicas directas entre transgenes en las mismas ubicaciones genómicas.

La capacidad de modificar el genoma de los mosquitos vectores de enfermedades de manera confiable y reproducible ha reforzado la validación funcional in vivo de los genes y ha abierto las puertas a estrategias de control genético de vectores realizables, como las dirigidas a los mosquitos Anopheles que transmiten la malaria1.
La edición temprana del genoma del mosquito se basó únicamente en la transformación mediada por elementos transponibles (TE), siendo piggyBac el transposón más utilizado en Anopheles2,3,4. Sin embargo, la naturaleza aleatoria de la integración de TE puede conducir a modificaciones indeseables como knockouts de genes (mutagénesis insercional) y efectos de posición significativos en la expresión transgénica5,6,7,8. Las inserciones múltiples también son una ocurrencia común cuando se usa piggyBac5,9, lo que hace que la validación y el aislamiento de líneas transgénicas con inserciones individuales sea laborioso. Otros inconvenientes incluyen su potencial removilización, como se observa en la línea germinal de Anopheles stephensi al proporcionar una fuente de transposasa piggyBac10,11,12, y su tamaño limitado de carga de ADN (10-15 kb de longitud) con una eficiencia de transformación que disminuye con el aumento del tamaño del plásmido donante13,14.
Se introdujeron enfoques de integración dirigidos al sitio para eludir estos problemas. La modificación del genoma dirigida al sitio más común en los mosquitos es la mediada por el sistema φC31 (Figura 1a). Esto es impulsado por una integrasa viral que cataliza la recombinación entre dos sitios de unión heteroespecíficos (att) que ocurren naturalmente en el genoma del bacteriófago φC31 (attP) y en el huésped de la bacteria Streptomyces (attB)15. La recombinación de los dos sitios es unidireccional y da como resultado la formación de sitios híbridos (attL y attR). La recombinación de tales sitios híbridos (que conduzca a la escisión del ADN) requeriría no solo la presencia de una integrasa viral activa, sino también de otro factor de recombinación codificado por fagos16,17. De este modo, se genera un sitio de integración estable que alivia el problema de la posible removilización no deseada15. Además, el sistema permite la integración de grandes cargas (por ejemplo, la integración de construcciones de &gt;100 kb se informó en D. melanogaster18), aumentando significativamente las capacidades de carga. La integración se produce en un único locus genómico predefinido lo que simplifica enormemente la validación de la inserción y el esquema de apareamiento para obtener una línea transgénica estable. Finalmente, la naturaleza dirigida al sitio de la integración permite la normalización de la expresión, ya que los transgenes alternativos se encuentran en el mismo locus y, por lo tanto, se regulan dentro del mismo contexto genómico vecino. De hecho, una de las principales aplicaciones de la técnica es la comparación directa de fenotipos conferidos por diferentes transgenes después de la inserción en un locus idéntico.
Lograr la integración mediada por φC31 implica dos fases: la fase I es la creación de líneas de acoplamiento transgénicas que transportan sitio(s) attP, y la fase II es la integración dirigida al sitio de una carga flanqueada por attB en el genoma de la línea de atraque19. La creación de líneas de acoplamiento de fase I se ha basado en la integración aleatoria mediada por TE de constructos etiquetados con attP y, por lo tanto, implicó un proceso laborioso inicial (incluidos los análisis de SOUTHERN blot y PCR inversa en progenie de una sola hembra) para aislar y validar líneas transgénicas que llevan un solo evento de integración en ubicaciones genómicas únicas, transcripcionalmente activas y neutrales. No obstante, se han desarrollado y validado varias líneas de acoplamiento para la integración única mediada por φC31 en An. gambiae19,20,21,22 y en An. stephensi23,24,25 (Tabla 1). Cada una de estas líneas varía en términos de la ubicación genómica del sitio de acoplamiento y el fondo genético específico de la cepa y a partir de ellas se puede crear una gran variedad de nuevas líneas transgénicas. La compleja validación de las integraciones mediadas por TE para la producción de líneas de acoplamiento ahora puede ser eludida por la tecnología CRISPR/Cas926; sin embargo, esto se basa en el conocimiento a priori de los loci neutros a los que se dirigirá y sus secuencias circundantes.
La integración mediada por φC31 se ha aplicado ampliamente a la edición del genoma de insectos desde el organismo modelo D. melanogaster27, hasta los mosquitos Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 y An. stephensi24, así como otros insectos como Ceratitis capitata30 y Bombyx mori31.
Una limitación de la integración mediada por φC31, especialmente en vista de las posibles liberaciones de campo para el control de vectores, es la integración en el genoma del mosquito de todo el plásmido donante portador de attB, incluidas secuencias indeseables como marcadores genéticos de resistencia a antibióticos y componentes de la columna vertebral del plásmido de origen bacteriano. Para abordar esto, se implementó una modificación del sistema estándar, el intercambio de casetes mediado por recombinasas (RMCE), que permite el reemplazo preciso de un cassette transgénico previamente integrado con un nuevo ADN donante (Figura 1b). Esto se logra mediante el uso de dos sitios att invertidos que flanquean los casetes donante y receptor en cada extremo, lo que impulsa dos eventos de recombinación independientes que tienen lugar simultáneamente, lo que resulta en el intercambio de casetes sin integración de la columna vertebral del plásmido. Este diseño mejorado elude la integración de secuencias no deseadas y amplía la aplicación de los sistemas φC31 para incluir, por ejemplo, la integración de cargas de ADN no marcadas mediante la detección de la pérdida de un marcador fluorescente previamente integrado32.
RMCE se logró primero con D. melanogaster32 y luego se aplicó con éxito a insectos no modelo, incluidos An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 y B. mori35. Se han desarrollado y validado varias líneas de acoplamiento para RMCE en An. gambiae5,9,26 (Tabla 1). Hasta donde sabemos, RMCE aún no se ha explorado en otras especies de vectores de Anopheles.
Hasta la fecha, el sistema φC31 se ha utilizado ampliamente en mosquitos Anopheles para introducir y estudiar una variedad de moléculas, incluidos los efectores antimalarias19,24,36, componentes del sistema GAL4/UAS para sobreexpresar y derribar genes para estudios de resistencia a insecticidas9,33, elementos reguladores, genes reporteros5,21,37 y elementos impulsores genéticos26 ,38.
Este protocolo describe cómo realizar 1) la integración dirigida al sitio de una carga flanqueada por attB y 2) RMCE de una construcción flanqueada por sitios attB invertidos en el genoma de las líneas de acoplamiento de Anopheles . Esto se logra mediante el uso de dos plásmidos: un plásmido de donante marcado con attB que lleva el transgén de interés, y un plásmido ayudante que expresa la integrasa φC31 . Los principales vectores de malaria An. gambiae y An. stephensi se utilizan como ejemplos específicos, sin embargo, estos protocolos son aplicables a otras especies de Anopheles .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig01.jpg"> Figura 1. Modificaciones del genoma dirigidas al sitio, integración única e intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE), utilizando el sistema φC31. La integrasa φC31 (INT, flecha doble gris) cataliza la recombinación entre el(los) sitio(s) attB (raya púrpura) presente(s) en un plásmido donante y el(los) sitio(s) attP (raya azul) presente(s) en una línea de acoplamiento receptora, lo que resulta en la formación de sitios híbridos attL y attR. A) La integración se logra cuando los sitios attB y attP individuales se recombinan y da como resultado la presencia de dos marcadores integrados (azul y rojo). B) RMCE ocurre cuando dos sitios attB/P se recombinan simultáneamente y resulta en el reemplazo del cassette entre los sitios att de la línea de acoplamiento (marcador azul) con el transportado por el plásmido donante (marcador rojo). C) Secuencias parciales de nucleótidos de attP (azul) y attB (púrpura) y los sitios híbridos attL/R. La recombinación se produce entre las secuencias de núcleo 'TT' resaltadas en negrita negra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tubos eppendorf de 1,5 ml Microportaobjetos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 8 pocillos</td><td>VWR</td><td>MARI1216690</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de pañuelos</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree&nbsp; Plásmido&nbsp; Maxi&nbsp; Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Absoluto, Grado de Biología Molecular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Juego de filtros CFP para Leica MZ FLIII Excitación 436/20 nm, extinción 480/40 nm</td><td>Leica</td><td>10446363</td><td></td></tr><tr><td>Juego de filtros dsRED para Leica MZ FLIII Excitación 545/30 nm, extinción 620/60 nm</td><td>Leica</td><td>10447079</td><td></td></tr><tr><td>Juego de filtros YFP personalizado para Leica MZ FLIII</td><td>Omega Optical</td><td>500QM25, 500QM35</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono 27</td><td>Sigma</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Placas</td><td></td><td></td><td></td>de Petri</tr><tr><td>Potasio&nbsp; cloruro</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>sodio cloruro de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodio fosfato dibásico</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>sodio&nbsp; Acetato &nbsp; Solución (3 M),&nbsp; pH&nbsp; 5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td><td>R1181</td><td></td></tr><tr><td>Cepillo estable Tamaño 0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

integración mediada por φc31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

El análisis genómico funcional y las estrategias relacionadas para el control genético de la malaria se basan en métodos validados y reproducibles para modificar con precisión el genoma de los mosquitos Anopheles. Entre estos métodos, el sistema φC31 permite la integración precisa y estable de transgenes dirigidos al sitio, o la sustitución de casetes transgénicos integrados a través del intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE). Este método se basa en la acción de la integrasa del bacteriófago Streptomyces φC31 para catalizar la recombinación entre dos sitios de unión específicos designados attP (derivado del fago) y attB (derivado de la bacteria huésped). El sistema utiliza uno o dos sitios attP que se han integrado previamente en el genoma del mosquito y sitio(s) attB en la plantilla de ADN del donante. Aquí ilustramos cómo modificar de manera estable el genoma de las líneas de acoplamiento de Anopheles portadoras de attP utilizando dos plásmidos: un donante marcado con attB que lleva la plantilla de integración o intercambio y un plásmido auxiliar que codifica la integrasa φC31. Presentamos dos resultados representativos de la modificación dirigida al sitio mediada por φC31: la integración única de un casete transgénico en mosquitos An. stephensi y RMCE en mosquitos An. gambiae. La manipulación del genoma mediada por φC31 ofrece la ventaja de la expresión reproducible de transgenes a partir de sitios genómicos validados y neutros, lo que permite análisis cualitativos y cuantitativos comparativos de fenotipos. La naturaleza dirigida al sitio de la integración también simplifica sustancialmente la validación del sitio de inserción único y el esquema de apareamiento para obtener una línea transgénica estable. Estas y otras características hacen del sistema φC31 un componente esencial del conjunto de herramientas genéticas para la manipulación transgénica de mosquitos de la malaria y otros insectos vectores.

El protocolo ilustrado aquí permite generar una línea transgénica estable de Anopheles en ~ 10 semanas (suponiendo un ciclo de vida de mosquitos de 21 días).
Se espera que las tasas de eclosión larvaria posterior a la inyección en An. gambiae sean generalmente más bajas que en An. stephensi, sin embargo, se han reportado tasas de eclosión entre 10-50%9,20,24,26,33,43,47. Dada la técnica de inyección adecuada, las tasas de eclosión de ≥20% son generalmente suficientes para producir transformadores. La absorción de ADN por los embriones se puede evaluar mediante el cribado de larvas jóvenes para la expresión transitoria del marcador fluorescente. En experimentos exitosos de RMCE en An. gambiae utilizando el promotor 3xP3, hasta el 50% de las larvas G0 supervivientes mostraron expresión episomal del marcador en las papilas anales48.
Las estimaciones generalizadas de la eficiencia de la transformación son difíciles de evaluar entre los laboratorios e incluso entre los experimentos, ya que la transformación depende de una compleja interacción de variables que incluyen la pureza, la concentración, el tamaño y la toxicidad potencial del ADN inyectado, la calidad de los huevos, el manejo de los huevos antes y después de la inyección, la cría de mosquitos y, lo que es más importante, la experiencia del operador. Se han obtenido tasas de transformación de hasta el 7% para RMCE en An. gambiae (calculadas como el número de eventos de transformación independientes en el total de individuos G0)9,26,33, y hasta un 2,2% de tasa de transformación para la integración en An. stephensi. Sugerimos inyectar al menos 500 embriones, lo que debería conducir a la eclosión de al menos 100 larvas G0 y a fundadores adultos de 2-7 G0 de los cuales se puede obtener una progenie transformada de manera estable. Si se detecta la expresión transitoria en larvas G0, se pueden esperar hasta 40 larvas positivas.
Ejemplos de validación fenotípica de la transformación a través del cribado de marcadores fluorescentes regulados por el promotor 3xP3 se reportan en la Figura 4 y  la Figura 5. La Figura 4 muestra una nueva línea de An. stephensi obtenida mediante la inserción de un cassette marcado con DsRed en una línea de acoplamiento marcada con CFP (80.9, Tabla 1), lo que resulta en que la progenie G1 exprese ambos marcadores según lo indicado por la fluorescencia roja y azul detectada en los ojos.
En cambio, se espera que los diseños de RMCE resulten en el reemplazo del marcador originalmente insertado en la línea de acoplamiento con el del plásmido donante. La Figura 5A y  la Figura B ilustran este intercambio de marcadores en una línea de acoplamiento de An. gambiae marcada con CFP (A11, Tabla 1) donde después de RMCE exitosa se pierde el marcador CFP y se adquiere el marcador YFP dando como resultado fluorescencia amarilla (pero no azul) del ojo y del cordón nervioso33. Ocasionalmente, RMCE puede resultar en un solo evento de integración en lugar del intercambio del casete transgénico deseado como se ilustra en la Figura 5C, donde se muestra una larva marcada con el CFP original y los nuevos marcadores YFP. Se informa que hasta el 50% del número total de eventos de transformación son integraciones individuales9,33.
Al detectar la presencia de un marcador fluorescente, es crucial distinguir su señal de la posible autofluorescencia de fondo. Esto es particularmente importante cuando se usa CFP, ya que las larvas de Anopheles muestran autofluorescencia azul natural (Figura 6A). Es necesario aumentar la ampliación y centrarse en los tejidos y órganos donde se espera que la fluorescencia sea impulsada por el promotor para identificar verdaderos individuos positivos para CFP, como se ilustra en la Figura 6B utilizando el marcador 3xP3-CFP.
Los transformadores individuales finalmente se evalúan molecularmente a través de PCR para confirmar el sitio de inserción esperado. La Figura 7 reporta la validación de pcr en individuos a partir de una línea de intercambio An. gambiae mostrando las dos orientaciones potenciales de inserción en el genoma del mosquito33.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig04.jpg"> Figura 4. Validación de la integración única de φC31 en larvas de An. stephensi (vista dorsal). A) La línea de acoplamiento (80.9, Tabla 1) expresa CFP a los ojos bajo la regulación del promotor 3xP3 . B) La integración exitosa da como resultado la expresión del DsRed recién adquirido, así como el marcador CFP original en los ojos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig05.jpg"> Figura 5. Validación de φC31 RMCE en larvas de An. gambiae (vista ventral). A) La línea de acoplamiento (A10, Tabla 1) expresa CFP bajo la regulación del promotor 3xP3 en los ojos (e) y el cordón nervioso (nc)5. B) RmCE exitoso resulta en el intercambio de marcador fluorescente de CFP a YFP33. C) Evento de integración única ocurrió durante el experimento RMCE donde la larva transformadora expresa los marcadores CFP y YFP. Esta larva lleva componentes GAL4 / UAS que causan un amplio patrón de expresión de YFP, particularmente fuerte en los músculos abdominales (am). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig06.jpg"> Figura 6. Autofluorescencia CFP en larvas de An. gambiae (vista dorsal). A) Imagen lado a lado de una larva L4 positiva (CFP+) y negativa (CFP-) utilizando el filtro CFP. B) Imagen en primer plano de los ojos larvales que revela un individuo CFP+ vs CFP-. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62146/62146fig07.jpg"> Figura 7. Validación molecular de la orientación de inserción de cassette en transgénicos representativos An. gambiae creados por φC31 RMCE. El cassette transgénico se puede insertar en una de las dos orientaciones alternativas (A o B) con respecto al sitio de inserción. Cada reacción de PCR (I - IV) utiliza una combinación de cebadores (5-8)33 diseñados para dar un fragmento de amplificación diagnóstica para cada orientación como se indica en los mapas plásmidos esquemáticos. T1: individuo transgénico representativo que lleva orientación de la inserción A; T2: individuo transgénico representativo que lleva orientación de inserción B; WT: tipo salvaje; DL: línea de acoplamiento; -: reacción de control negativo donde se utilizó agua como plantilla. Esta cifra ha sido modificada a partir de Adolfi et al. (2019)33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62146/62146fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Especie</td>
			<td>Colar</td>
			<td>Nombre</td>
			<td>attP(s)</td>
			<td>Cromo-algunos</td>
			<td>Promotor-marcador</td>
			<td>Institución de origen</td>
			<td>Referencia</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>26,10b
</td>
			<td>Soltero</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Universidad de California Irvine</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>44Cb
</td>
			<td>Soltero</td>
			<td>X</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Universidad de California Irvine</td>
			<td>23, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. stephensi</td>
			<td>Indiana
</td>
			<td>80,9b
</td>
			<td>Soltero</td>
			<td>2L</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Universidad de California Irvine</td>
			<td>Este estudio</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>113</td>
			<td>Soltero</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Universidad de California Irvine</td>
			<td>Este estudio</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>KIL</td>
			<td>Ec
</td>
			<td>Soltero</td>
			<td>3R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Keele Univ.</td>
			<td>19, 43</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>X1</td>
			<td>Soltero</td>
			<td>2L</td>
			<td>Sin marcador</td>
			<td>Universidad de Estrasburgo</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>YAttP</td>
			<td>Soltero</td>
			<td>Y</td>
			<td>3xP3-RFP</td>
			<td>Imperial College de Londres</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A10b
</td>
			<td>Doble</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool School Trop. Med.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>An. gambiae</td>
			<td>G3</td>
			<td>A11b
</td>
			<td>Doble</td>
			<td>2R</td>
			<td>3xP3-eCFP</td>
			<td>Liverpool School Trop. Med.</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">un. Cepa de la Universidad Johns Hopkins (regalo de M. Jacobs-Lorena) y en cultura en la Universidad de California Irvine durante &gt;20 años.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">b. Estas líneas están disponibles de los autores a petición razonable.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">c. Esta línea está disponible en el repositorio BEI www.beiresources.org como MRA-1163.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Líneas de acoplamiento anopheles attP .

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Este protocolo apoya la caracterización del papel de los genes de mosquitos involucrados en una variedad de vías fisiológicas, incluyendo, por ejemplo, la resistencia a los insectos y el desarrollo de parásitos de la malaria. El método impulsa la inserción de transgenes en ubicaciones genómicas precaracterizadas individuales y, por lo tanto, permite comparar directamente los fenotipos resultantes de transgenes alternativos evitando efectivamente el problema del efecto posicional. Este método se puede aplicar a una variedad de especies de insectos de importancia agrícola y de salud pública y sus aplicaciones se extienden ampliamente desde bacterias hasta células de mamíferos.Comience por diseñar plásmidos donantes de attB que lleven el marcador fluorescente dominante, los sitios de recombinación de attB y la carga transgénica deseada. Utilice un solo sitio attB para la integración de todo el plásmido que transporta el cassette transgénico o dos sitios attB invertidos para el intercambio de cassette. Purifique los plásmidos donantes y ayudantes utilizando un kit de purificación libre de endotoxinas.Combinar el plásmido donante marcado attB portador del transgén de interés y el plásmido ayudante que lleva la integrasa para obtener una mezcla con una concentración final de 350 nanogramos por microlitro del plásmido donante y 150 nanogramos por microlitro del plásmido ayudante. Precipitar el ADN agregando 0.1 volumen de acetato de sodio de tres molares y 2.5 volúmenes de etanol 100% frío, luego vórtice. Un precipitado blanco debe ser inmediatamente visible.Lave el pellet y vuelva a suspenderlo en tampón de inyección para alcanzar una concentración final total de 500 nanogramos por microlitro. Luego prepare alícuotas de 10-15 microlitros cada una y guárdelas a 20 grados centígrados negativos. La sangre alimenta a los mosquitos de cuatro a siete días de edad de la línea de acoplamiento deseada y sus contrapartes de tipo salvaje 72 horas antes de la microinyección.Realice microinyecciones embrionarias de Anopheles gambiae en cloruro de sodio 25 milimolares dirigiéndose al polo posterior del embrión en un ángulo de 45 grados. Realice microinyecciones embrionarias de Anopheles stephensi en aceite de halocarbono apuntando al polo posterior en un ángulo de 30 grados. Inmediatamente después de la inyección, transfiera los huevos a una placa de Petri llena de agua destilada estéril y devuélvalos a condiciones insectarias.Al eclosionar, transfiera la larva G0 a una bandeja con agua destilada salada diariamente y vuelva a las pupas. Clasifica las pupas G0 por sexo bajo un estereoscopio. Permita que los machos emerjan en jaulas separadas en grupos de tres a cinco y agregue un exceso de diez veces de hembras de tipo salvaje emparejadas por edad.Permita que las hembras emerjan en jaulas separadas en grupos de 10 a 15 y agregue un número igual de machos de tipo salvaje de la misma edad. Permita que los adultos se apareen durante cuatro a cinco días y proporcione a las hembras una comida de sangre. Recoge los huevos y cría los G1 emergentes de próxima generación.Recoja las larvas G1, L3 y L4 en una placa de Petri forrada con papel de filtro húmedo o en un portaobjetos de microscopio y aprátelas con un estereoscopio fluorescente para detectar la presencia del marcador introducido con la carga etiquetada con attB. Para diseños de attB individuales, pantalla para la presencia del marcador nuevo y preexistente. Para diseños de doble attB para intercambio de casetes, pantalla para la presencia del nuevo marcador y la pérdida del preexistente.Clasifica las pupas G1 transformadas por sexo y cúbrelas en masa con individuos de tipo salvaje de sexo opuesto de la misma edad. Permita que los adultos se apareen durante cuatro o cinco días y proporcione una comida de sangre. Para experimentos de integración individual, recolecte huevos directamente de la cruz en masa.Para los experimentos de intercambio de casetes, recoja los huevos de hembras individuales y mantenga la progenie separada hasta que se complete la evaluación molecular debido a la posible presencia de dos orientaciones alternativas de casete. Examinar la progenie G2 para detectar la presencia del marcador fluorescente y reservar un subconjunto de individuos G2 positivos para el análisis molecular. Criar al resto hasta la edad adulta.Realizar la validación molecular de los sitios de inserción con PCR como se describe en el texto manuscrito. Para una sola integración, asegúrese de que el sitio de inserción predicho lleve la construcción de acoplamiento original, más toda la secuencia del plásmido donante entre los dos sitios híbridos attL y attR. Para el intercambio de casetes, asegúrese de que el sitio de inserción previsto sea idéntico al de la línea de acoplamiento, donde los sitios attL invertidos híbridos reemplazan a los sitios attP invertidos originales y la plantilla de intercambio reemplaza el cassette originalmente presente entre ellos.El protocolo se utilizó para generar una línea transgénica estable de Anopheles en aproximadamente 10 semanas. La validación fenotípica de la transformación se realizó mediante el cribado de marcadores fluorescentes regulados por el promotor 3xP3 que se muestran aquí. Se obtuvo una nueva línea Anopheles stephensi mediante la inserción de un cassette marcado en rojo DS en una línea de acoplamiento marcada con CFP, lo que dio como resultado que la progenie G1 expresara ambos marcadores según lo indicado por la fluorescencia roja y azul en los ojos.Los diseños de intercambio de casetes dan como resultado el reemplazo del marcador originalmente insertado en la línea de acoplamiento con el del plásmido donante. Este intercambio de marcadores se demostró en una línea de acoplamiento de Anopheles gambiae donde se perdió el marcador CFP y se adquirió el marcador YFP, lo que resultó en fluorescencia amarilla del ojo y del cordón nervioso. Ocasionalmente, RMCE puede resultar en un solo evento de integración en lugar del intercambio del casete transgénico deseado donde una larva está marcada tanto con el CFP original como con los nuevos marcadores YFP.Al detectar la presencia de un marcador fluorescente, es crucial distinguir su señal de la posible autofluorescencia de fondo. Es necesario aumentar la ampliación y centrarse en los tejidos y órganos donde se espera que la fluorescencia sea impulsada por el promotor para identificar verdaderos individuos positivos para la PPC. Los transformadores individuales también se evaluaron molecularmente a través de PCR para confirmar el sitio de inserción esperado.La validación de PCR en individuos de una línea de intercambio de Anopheles gambiae se muestra aquí. Incluso la técnica de microinyección adecuada, el diseño preciso y la preparación del donante y los plásmidos ayudantes, así como el seguimiento del esquema apropiado de cría de mosquitos son clave para la obtención de individuos transgénicos. Este procedimiento se puede utilizar para insertar elementos que causan sobreexpresión o silenciamiento de genes, por ejemplo, el sistema GAL4 / UAS, así como elementos impulsores de genes y moléculas antipatógenas para el control genético de mosquitos.

site-directed-c31-mediated-integration-cassette-exchange-anopheles

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Los mosquitos Anopheles stephensi son vectores de la malaria que habitan en la India y en toda Asia. Este video muestra la técnica para la realización de micro-inyecciones de esta especie con transgenes que confieren resistencia a la malaria a los mosquitos. Gran parte de la metodología se demuestra en este vídeo es aplicable a las técnicas de microinyección de otras especies de mosquitos.

La inyección de una. Los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos

Un método rápido y eficiente para integrar ADN ajeno de interés en cepas aceptor pre-hechas, llamadas cepas pista de aterrizaje, se describe. El método permite específica del sitio de integración de un cassette de ADN en el locus de aterrizaje almohadilla de ingeniería de una cepa dada, a través de la conjugación y expresión de la integrasa ΦC31.

Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

Entre los tres géneros de mosquitos, es...

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación en los cromosomas mitóticos de mosquitos

En este vídeo, demostramos la integración de transgenes específicos del sitio mediada por phiC31 en el embrión de Anopheles mediante microinyección. Este método ayuda a introducir los genes deseados en un sistema huésped para aplicaciones industriales y de investigación.

phiC31-Integración de transgenes dirigidos en el sitio mediada por integrasa: una técnica de microinyección para la integración de transgenes específicos del sitio en un vector Anopheles

Los mosquitos transmisores de la malaria tienen una serie de características epidemiológicamente importantes que solo pueden detectarse mediante técnicas moleculares. Utilizando una plataforma de genotipado de SNP basada en MALDI-TOF, desarrollamos un ensayo para detectar simultáneamente múltiples rasgos clave (especie, resistencia a insecticidas, infección por parásitos y elección de huésped) de los vectores de la malaria.

Un ensayo multi-detección para los mosquitos transmisores de la malaria

A través de la inoculación con perlas, la técnica descrita permite la estimulación de la respuesta de melanización del mosquito en el sistema circulante de la hemolinfa. La cantidad de melanina que cubre las perlas se puede medir después de la disección como una medida de la respuesta inmunitaria.

Inoculador<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Los mosquitos con los granos para inducir y medir la respuesta inmune melanización

Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Los protocolos reportados aquí ilustran tres formas alternativas de evaluar el rendimiento de los mosquitos genéticamente modificados destinados al control de vectores en ensayos de jaulas pequeñas contenidos en laboratorio. Cada protocolo se adapta a la modificación específica que tiene la cepa del mosquito (impulsor genético o no impulsor genético) y los tipos de parámetros medidos.

Ensayos de laboratorio en jaulas pequeñas de mosquitos anofelinos genéticamente modificados

Las técnicas de microinyección son esenciales para introducir genes exógenos en los genomas de los mosquitos. Este protocolo explica un método utilizado por el laboratorio James para microinyectar construcciones de ADN en embriones de Anopheles gambiae para generar mosquitos transformados.

Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae

La administración oral de dsRNA producido por bacterias, un método de administración para la interferencia de ARN (RNAi) que se usa rutinariamente en Caenorhabditis elegans, se aplicó con éxito aquí a mosquitos adultos. Nuestro método permite estudios robustos de genética inversa y estudios de vectores que bloquean la transmisión sin el uso de inyección.

Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae

El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .

Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles

Aprende a realizar modificaciones genómicas dirigidas en mosquitos Anopheles usando el sistema φC31. Este método permite integrar y cambiar casetes transgénicos para estudiar genes relacionados con la resistencia a la malaria.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

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