Name: Andamio compuesto de colágeno-quitosano cargado de doxiciclina para la curación acelerada de heridas diabéticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda a preparar andamios de colágeno-quitosano con doxiciclina para acelerar la curación de heridas diabéticas en modelos animales. Este método combina liberación sostenida del fármaco con propiedades antibacterianas y antiinflamatorias.

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Los autores agradecen al Dr. Ashish D Wadhwani. (Profesor Asistente y Jefe del Departamento de Biotecnología Farmacéutica, JSS College of Pharmacy, Ooty, India) por ayudar en los estudios de viabilidad de células in vitro.
Los autores desean agradecer al Departamento de Ciencia y Tecnología - Fondo para la Mejora de la Infraestructura de Ciencia y Tecnología en Universidades e Instituciones de Educación Superior (DST-FIST), Nueva Delhi, por apoyar a nuestro departamento.
Los autores también quieren dar las gracias al Sr. Sanju. S y el Sr. Sriram. Estudiantes de Narukulla M. Pharm por su apoyo en la sesión de video.
Esta investigación fue apoyada por la Jss Academy of Higher Education &Research (JSSAHER).

Todos los procedimientos animales realizados fueron aprobados por el comité ético animal institucional de JSS College of Pharmacy, Ooty, India.
1. Preparación de andamios porosos cargados DOX por método de liofilamiento
<ol><li>Agregue 1.2 g de COL a 100 mL de agua (por ejemplo, Millipore) y manténgalo a un lado para la hinchazón.</li>
	<li>Revuelva la dispersión de COL hinchada a 2000 rpm durante la noche para asegurar la disolución completa de COL.</li>
	<li>Preparar la solución de CS disolviendo aproximadamente 0,8 g de CS en 100 mL de ácido acético al 1%.</li>
	<li>Revuelva la solución CS durante la noche a 2000 rpm para asegurar una dispersión uniforme.</li>
	<li>Mezcle DOX (1% p/v), seguido de la solución CS, a la solución COL, y revuelva durante 30 min.</li>
	<li>Filtre la mezcla física obtenida utilizando un paño de muselina para eliminar el material particulado.</li>
	<li>Ultracongelar el filtrado obtenido a -85 °C ± 4 °C durante unas 24 h.</li>
	<li>Liofilizar la mezcla ultracongelada a -85 °C ± 4 °C durante 72 h.</li>
	<li>Almacenar los andamios obtenidos en un desecador para su posterior análisis 16,17.</li>
</ol>2. Reticulado de andamios
<ol><li>Disolver la ETM (0,488 g) en 50 mL de agua.</li>
	<li>Remoje 50 mg del andamio cargado dox en 20 mL del tampón MES durante 30 min.</li>
	<li>Mezcle 19,5 mL de tampón MES con 0,1264 g de EDC y 0,014 g de NHS en un casto separado.</li>
	<li>Sumergir el andamio en la mezcla tampón durante 4 h para lograr la reticulación 16.</li>
	<li>Almacene los andamios reticulados (CL) y no reticulados (NCL) cargados dox para su posterior evaluación.</li>
</ol>3. Caracterización de andamios
<ol><li>Examen morfológico mediante microscopía electrónica de barrido (SEM)<ol>
<li>Caracterizar los andamios para análisis morfológicos utilizando SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).</li>
		<li>Manche la sección transversal y la superficie exterior del andamio con la delicada capa de oro (~ 150 Å).</li>
		<li>Captura la imagen fotográfica a un voltaje de excitación de 5 kV y 10 kV.</li>
		<li>Coloque las muestras en trozos de aluminio y encierre con el oro a aproximadamente 9 V.</li>
		<li>Mida el andamio utilizando SEM con el aumento de la resolución a 10 kV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinación de la porosidad<ol>
<li>Medir la porosidad de los andamios utilizando el método de desplazamiento de líquido (etanol) 18.</li>
		<li>Calcule la porosidad de los andamios utilizando las fórmulas siguientes. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62184/62184eq01.jpg"> Ww = Peso húmedo del andamio Wd = Peso seco del andamio Wv = Volumen del andamio</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinación de la capacidad de absorción de agua<ol>
<li>Mida el peso seco del andamio.</li>
		<li>Incubar el andamio pesado a 37 °C durante 24 h en tampón de fosfato salino (PBS) pH 7,4.</li>
		<li>Retire el exceso de PBS sobre el andamio utilizando papel de filtro.</li>
		<li>Mida la capacidad de absorción de agua utilizando las fórmulas siguientes 17. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62184/62184eq02.jpg"> WS = Porcentaje de absorción de agua W1=Peso húmedo del andamio W0= Peso seco del andamio</li>
	</ol>
</li>
	<li>Degradación de andamios<ol>
<li>Incubar el andamio (1cm x 1cm) a 37 °C durante 7 días en un PBS de pH 7,4 que contenga lisizimas.</li>
		<li>Lave el andamio para eliminar los iones adheridos en la superficie.</li>
		<li>Liofil liofil el andamio lavado 17.</li>
		<li>Calcule la tasa de degradación utilizando fórmulas. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62184/62184eq03.jpg"> Ww = Peso inicial del andamio Wd = Peso del andamio después de la liofilamiento</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estudios de liberación in vitro<ol>
<li>Determine el comportamiento de liberación del DOX desde el andamio utilizando el método de saco de diálisis.</li>
		<li>Dispersar el andamio en unos mililitros de líquido de herida simulado (pH 7.4) y transferirlo a una bolsa de diálisis.</li>
		<li>Cierre firmemente los extremos de la bolsa de membrana y sumérjase en los 500 mL de solución de líquido de herida simulada.</li>
		<li>Revuelva la solución de líquido de la herida que contiene la bolsa de diálisis a 200-250 rpm.</li>
		<li>Recoja la solución sobrenadante y reemplácela con una cantidad igual de solución tampón fresca a intervalos de tiempo definidos.</li>
		<li>Determine el porcentaje de liberación de DOX de los andamios en la solución sobrenadante utilizando un espectrómetro uv-visible a 240 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Estudios antibacterianos in vitro
<ol><li>Determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC) de los andamios CL y DOX-CL contra S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa utilizando el método de dilución de micro-caldo.</li>
	<li>Prepare los cultivos bacterianos utilizando caldo Mueller-Hinton en una proporción de 1:1000 para obtener 0.5 de turbidez de McFarland.</li>
	<li>Añadir D-glucosa (800 mg/dL) a los cultivos bacterianos para hiperglucation 19,20.</li>
	<li>Picar y solubilizar el CL y DOX-CL en DMSO (control negativo).</li>
	<li>Diluir en serie la suspensión bacteriana hiperglicada (100 μL) y las muestras de ensayo (100 μL de solución de andamios) en una placa de 96 pozos.</li>
	<li>Incubar la placa a 37 °C durante 20-24 h.</li>
	<li>Registre la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm 21.</li>
</ol>5. Estudios de biocompatibilidad in vitro
<ol><li>Evaluar la biocompatibilidad de los andamios preparados utilizando MTT [(3-(4, 5 dimetil tiazol-2 il)-2, 5-difenil tetrazolio bromuro)] ensayo.</li>
	<li>Esterilizar los andamios de dimensión estándar y colocarlos en placas de 24 pozos.</li>
	<li>Añadir las células 3T3-L1 a la placa de 24 pozos e incubar durante 72 h.</li>
</ol>6. Estudios in vivo en animales
<ol><li>Inducción de dm y herida por escisión<ol>
<li>Alimente al animal con una dieta alta en grasas durante dos semanas y administre una dosis única de estreptozotocina (STZ) (50 mg/kg de peso corporal) en solución tampón de citrato por vía intraperitoneal a ratas albinas Wistar (180-200 g) para la inducción de la diabetes tipo 2.</li>
		<li>Elija los animales con una glucosa en sangre constante de 250 mg/dL para el estudio.</li>
		<li>Aleatorizar los animales seleccionados para la inducción de heridas por escisión.</li>
		<li>Anestesiar a las ratas diabéticas usando el éter dietílico (5 mL fueron agregados a la cámara de anestesia previamente saturada) y confirmar usando el método del pellizco del dedo del pie y el color de la membrana mucosa.</li>
		<li>Afeitarse la zona dorsal (dorsal torácica, región lumbar) utilizando un recortador aséptico y cuchillas (A40).</li>
		<li>Esterilice el área afeitada con un hisopo alcohólico.</li>
		<li>Extirpar la piel (2 x 2 cm2 y una profundidad de 1 mm) con una cuchilla quirúrgica aséptica A40 en el área afeitada para crear una herida abierta.</li>
		<li>Divida los animales en tres grupos (Grupo 1- Control de enfermedades (Control), Grupo 2- Andamio CL (Placebo), Grupo 3- ANDAMIO DOX CL), cada grupo formado por 6 ratas.</li>
		<li>Coloque los andamios CL y DOX CL con cinta quirúrgica y cubra el grupo control con gasa estéril durante 21 días.</li>
		<li>Trace el área de la herida en una hoja estéril de OHP y mida la reducción porcentual de la herida usando el método de la rejilla en los días 0, 7, 14 y 21 para todos los grupos.</li>
		<li>Calcule el porcentaje de reducción de la herida utilizando las siguientes fórmulas. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62184/62184eq04v2.png">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Estudios histopatológicos
<ol><li>Aísle el área curada de la herida en los días 7, 14, y 21, almacene en la solución del formalin (el 10%).</li>
	<li>Seccione los tejidos utilizando un microtomo para obtener un espesor de 6 μm.</li>
	<li>Monte las secciones en un portaobjetos de vidrio y manche con Hematoxilina y eosina 17.</li>
	<li>Capture las imágenes con un aumento de 40x utilizando un microscopio digital.</li>
</ol>8. Estimación de hidroxiprolina
<ol><li>Aísle el área curada de la herida en los días 0, 7, 14, y 21 para la evaluación.</li>
	<li>Estimar el contenido de hidroxiprolina utilizando el procedimiento descrito por Reddy G et al., 1996 22.</li>
</ol>9. Prueba de Elisa
<ol><li>Estime los niveles de MMP-9 utilizando el kit Elisa según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Aísle las muestras de tejido del área curada de la herida el día 21 y mince usando un homogeneizador del tejido.</li>
	<li>Centrífuga el homogeneizado obtenido y recoge el sobrenadante.</li>
	<li>Diluya el sobrenadante a 100 veces usando el tampón de ensayo.</li>
	<li>Escanee la placa con un lector de placas múltiples.</li>
</ol>10. Análisis estadístico
<ol><li>Representar los resultados obtenidos como Media ± DE.</li>
	<li>Realice el análisis estadístico utilizando Graph pad prism v5.01.</li>
	<li>Lograr la significación estadística utilizando el análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y la prueba post hoc de Dunnet.</li>
	<li>Considere los valores con p≤0.05 como significativos.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El objetivo principal de este estudio fue determinar el efecto del andamio COL-CS cargado dox en la curación de DW en ratas. El CL y el NCL fueron preparados y evaluados en términos de morfología, índice de la hinchazón, cinética in vitro del lanzamiento, y biocompatibilidad.
Caracterización del andamio NCL y CL cargado dox Se encontró que los andamios preparados eran porosos con poros interconectados. Estos poros interconectados aseguran la naturaleza porosa y esponjosa qu...

La diabetes mellitus (DM) es una condición en la que el fracaso del cuerpo para administrar insulina o reaccionar a sus resultados en la digestión anormal de azúcares directos provoca un aumento de la glucosa en sangre 1. El enredo más consecutivo y aplastante de la DM es la herida diabética (DW). Aproximadamente el 25% de los pacientes con DM tienen la oportunidad de acumular una DW en su vida 1. La cura obstaculizada de DW se acredita a un triopathy del DM: immunopathy, vasculopathy, y neuropatía. Siempre que la DW no se trate, puede dar lugar al desarrollo de gangrena, lo que provoca la extracción del órgano en cuestión 2.
Muchos tratamientos, como instruir a los pacientes (inspeccionar la herida diariamente, limpiar la herida, evitar actividades que crean presión sobre la herida, monitoreo periódico de glucosa, etc.), controlar su glucosa en sangre, desbridamiento de la herida, descarga de presión, procedimiento médico, oxigenoterapia hiperbárica y terapias avanzadas son en la práctica 3,4. La mayoría de estos medicamentos no abordan todos los requisitos previos vitales para la atención de la DW a la luz de las condiciones fisiopatológicas multifactoriales y los gastos inesperados relacionados con estos medicamentos 5. Aunque la patogenesia de DW es multifactorial, la inflamación persistente con la gerencia inadecuada del tejido se indica para ser la razón real de la cura retrasada en DWs 5,6.
Los niveles aumentados de mediadores inflamatorios y favorable-inflamatorios en DW dan lugar a factores de crecimiento disminuidos responsables de la herida retrasada que cura 2,6. La formación inadecuada de la matriz extracelular (ECM) en DWs se acredita a los niveles crecientes de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) responsables de la degradación rápida de ECM formado. En los MMPs, MMP-9 es reportado como un intermediario importante responsable de la inflamación prolongada y la rápida degradación de la ECM 7. Se afirma que el tratamiento local con un fármaco antiinflamatorio que disminuye los niveles elevados de MMP-9 restablece la homeostasis cutánea, la disposición marco y provoca una mejor curación de los DWs 8,9.
La doxiciclina (DOX), un inhibidor de MMP-9, fue elegida para suprimir los niveles elevados de MMP-9, un mediador inflamatorio importante responsable de la inflamación persistente en DWs 10,11,12. Además, dox poseen antioxidante (producir radicales hidroxi y fenoxi libres capaces de unirse con especies reactivas de oxígeno) 13 y anti-apoptótico (inhibir la expresión de caspasa y estabilización mitocondrial) 14 actividades que son esenciales para el tratamiento de dw. Se eligió la disposición de los marcos que contenían DOX, colágeno (COL) y quitosano (CS). La elección del COL depende de la forma en que ayuda a proporcionar el marco necesario responsable de la resistencia mecánica y la regeneración tisular 15. Por otra parte, el CS es estructural homólogo al glycosaminoglycan, asociado a varias fases curativas de la herida. También se informa que el CS posee una propiedad antibacteriana significativa 15. Por lo tanto, el andamio COL/CS de DOX está formulado para suprimir la inflamación prolongada, seguido de apoyar la formación de la matriz para la cura exitosa de heridas en condiciones de DM.

<table><tbody><tr><td>Clorhidrato de carbodiimida de 1-etil-(3-3-dimetil aminopropilo) (EDC)</td><td>Merck Millipore, Mumbai, India</td><td>E7750</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino) etano sulfónico (MES)</td><td>Merck Millipore, Mumbai, India</td><td>137074 bromuro</td><td></td></tr><tr><td>de 3-(4, 5 dimetil tiazol-2 il) -2, 5-difenil tetrazolio (MTT)</td><td>Thermo Fisher, Mumbai, India</td><td>M6494</td><td></td></tr><tr><td>Vértice</td> <td>de congeladorLabline Instruments, Kochi, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saco de diálisis</td><td>Merck Millipore, Mumbai, India</td><td>D6191-Anchura plana media 25 mm (1,0 pulg.), MWCO 12.000 Da</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Elisa kit</td><td>R& D Systems</td><td>RMP900</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli (E. coli)</td><td>Colección Nacional de Microorganismos Industriales, Pune, India</td><td>NCIM 2567</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck Millipore, Mumbai, India</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador-SZ042</td><td>Instrumentos de laboratorio Sub-Zero, Chennai, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador mecánico-RQ-122/D</td><td>Instrumentos de laboratorio Remi, Mumbai, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peso molecular medio Chitosan</td><td>Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India</td><td>18824</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo-RM2135</td><td>Leica, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células embrionarias de fibroblastos de ratón (3T3-L1)</td><td>Centro Nacional de Ciencias Celulares, Pune, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas múltiples -Inifinte M200 Pro</td><td>Tecan Instrumentos, Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)</td><td>Colección Nacional de Microorganismos Industriales, Pune, India</td><td>NCIM 2036</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía electrónica de barrido (SEM)-S-4800</td><td>Hitachi, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pellets de hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Productos químicos finos de Qualigen, Mumbai, India</td><td>Q27815</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus (S. aureus)</td><td>Colección Nacional de Microorganismos Industriales, Pune, India</td><td>NCIM 5022</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus epidermis (S. epidermis)</td><td>Colección Nacional de Microorganismos Industriales, Pune, India</td><td>NCIM 5270</td><td></td></tr><tr><td>Estreptozotocina (STZ)</td><td>Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India</td><td>14653</td><td></td></tr><tr><td>Rata tipo 1 Colágeno</td><td>Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Ultravioleta&ndash; espectroscopía visible-1700</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

andamio compuesto de colágeno-quitosano cargado de doxiciclina para la curación acelerada de heridas diabéticas

Doxycycline Loaded Collagen-Chitosan Composite Scaffold for the Accelerated Healing of Diabetic Wounds

Una complicación importante de la diabetes mellitus son las heridas diabéticas (DW). La fase prolongada de inflamación en diabetes obstruye las etapas posteriores de lesión que lleva a la herida retrasada que cura. Se seleccionó la doxiciclina (DOX), como un fármaco potencial de elección, debido a sus propiedades antibacterianas junto con sus propiedades antiinflamatorias reportadas. El estudio actual tiene como objetivo formular andamios no reticulados (NCL) y reticulados (CL) cargados con DOX y evaluar su capacidad curativa en condiciones diabéticas. El resultado de la caracterización de los andamios revela que el andamio DOX-CL tiene una porosidad ideal, una baja tasa de hinchazón y degradación, y una liberación sostenida de DOX en comparación con el andamio DOX-NCL. Los estudios in vitro revelan que el andamio DOX-CL fue biocompatible y mejoró el crecimiento celular en comparación con los grupos de control y tratados con andamios CL. Los estudios antibacterianos han demostrado que el andamio DOX-CL era más efectivo que el andamio CL contra las bacterias más comunes que se encuentran en DW. Usando el streptozotocin y el modelo dieta-inducido alto en grasas de DW, un índice perceptiblemente (p≤0,05) más rápido de contracción de la herida en el grupo tratado andamio de DOX-CL fue observado comparado a ésos en el andamio del CL tratados y los grupos de control. El uso del andamio DOX-CL puede resultar ser un enfoque prometedor para el tratamiento local para los trabajadores de la mujer.

Caracterización del andamio NCL y CL cargado dox En la examinación visual, el ncl y el andamio del CL fueron encontrados para ser crema en color. Además, ambos andamios parecen ser como una esponja, rígidos e inelásticos cuando se examinan físicamente. Las imágenes SEM de los andamios NCL y CL se muestran en la Figura 1. De la figura, estaba claro que había una disminución en el tamaño de los poros después de la reticulación mediante la formación de enlaces intermolecular...

El andamio DOX-CL preparado satisfizo los requisitos previos de un apósito DW ideal en resistencia mecánica, porosidad, absorción de agua, tasa de degradación, liberación sostenida, propiedades antibacterianas, biocompatibilidad y antiinflamatorias, que se consideran esenciales para la recuperación del tejido dañado en los trabajadores de la muerte.

Andamio compuesto de colágeno-quitosano cargado de doxiciclina para la curación acelerada de heridas diabéticas

One major complication of diabetes mellitus is diabetic wounds (DW). The prolonged phase of inflammation in diabetes obstructs the further stages of an ...

El trabajo de investigación actual es andamios compuestos de colágeno-quitosano cargados de doxiciclina para la curación acelerada de heridas diabéticas. La diabetes es una enfermedad metabólica crónica caracterizada por niveles elevados de glucosa en sangre. Cuanto más largo sea el tiempo que el individuo tenga diabetes, mayor será el riesgo de complicaciones, como enfermedad cardiovascular, nefropatía, neuropatía, retinopatía y daño en los pies, etcétera.El daño a los nervios en los pies y también el flujo sanguíneo deficiente a los pies aumentan el riesgo de varias complicaciones en los pies. Si no se tratan, estas heridas pueden requerir amputaciones en última instancia de los dedos de los pies, los pies o las piernas. Aproximadamente, el 25% de los pacientes con diabetes mellitus tienen la oportunidad de acumular una herida diabética en su vida.La gerencia terapéutica de heridas diabéticas sigue siendo un cañizo hasta la fecha que necesita ser cruzado eventual. Aunque la patofisiología de la herida diabética es multifactorial, se cree que el tratamiento local con las drogas antiinflamatorias podría disminuir los niveles elevados de MMP-9 y restablece el arreglo cutáneo del marco de la homeostasis y los prompts que curan en heridas diabéticas. Doxycycline, el inhibidor MMP-9, fue elegido en este estudio para suprimir estos niveles elevados de MMP-9, una molécula inflamatoria importante responsable de la inflamación continua de heridas diabéticas.Por otro lado, los biomateriales han fascinado a los humanos durante varias décadas y han estado en el centro de muchos avances médicos que cambian las reglas del juego para la administración eficiente de medicamentos y macromoleculares y el desarrollo de dispositivos biomédicos hechos a medida. Por lo tanto, con esta breve introducción, hemos preparado un andamio de colágeno-quitosano cargado de doxiciclina para atenuar, para acelerar la cicatrización retrasada en heridas diabéticas. Se trata de Bharat Kumar Reddy, investigador del Departamento de Farmacología, JSS College of Pharmacy, Ooty, India.Hoy estamos aquí para ver en el procedimiento, cómo preparar doxiciclina cargado colágeno-quitosano andamio para la curación acelerada de heridas diabéticas. Echemos un vistazo al procedimiento, cómo prepararse. Vamos a preparar un 1,2% de solución de colágeno, para lo cual estamos tomando 1,2 gramos de colágeno tipo I, que es de origen cola de rata.A esto, estamos agregando 100 ml de agua millipore y lo mantuvimos a un lado durante media hora para permitir que el colágeno se abulte en agua. En el siguiente paso, se preparó un 0,8% de solución de quitosano, para lo cual estamos tomando 0,8 gramos de quitosano de peso molecular medio, y este se mezcló con 100 ml de ácido acético al 1%. Esta solución también, la hemos mantenido a un lado durante media hora.Después de media hora, ambas soluciones fueron sometidas a agitación mecánica durante la noche a una RPM de 2000. A la solución de colágeno agitado durante la noche estamos agregando lentamente un gramo de doxiciclina. Y la solución que contenía este colágeno y doxiciclina fue sometida durante media hora de agitación a una RPM de 2000.A esta solución estamos añadiendo lentamente la solución de quitosano agitado durante la noche. Y esto, asegúrese de que está etiquetado como mezcla física que contiene doxiciclina, colágeno, quitosano. Esta mezcla física la hemos sometido durante otra media hora de agitación a una RPM de 2000.Después de media hora, estas mezclas físicas se transfirieron a los respectivos moldes de aluminio, que tienen unas dimensiones de dos en dos centímetros y un espesor de 0,5 centímetros. Más tarde, estos moldes fueron transferidos a un contenedor de metal. Estos contenedores metálicos contenían los moldes de aluminio, fueron sometidos a congelación profunda.Después de 24 horas, podemos ver claramente la mezcla física solidificada que contiene doxiciclina, colágeno y quitosano. Esta mezcla física solidificada fue sujetada más a fondo para la liofilización. La liofilización se realizó a menos 85 grados más/menos cuatro grados centígrados durante 72 horas.Después de 72 horas, el material liofilizado fue sacado del liofilizador. Y aquí podemos ver claramente la mezcla física completamente seca, que no es más que conocida como andamio de colágeno-quitosano cargado de doxiciclina. Estos andamios fueron sometidos a reticulado Con el fin de realizar el reticulado, inicialmente, el tampón MES se preparó tomando 0,488 gramos de MES y 15 ml de agua, de los que estamos sacando 20 ml de tampón MES y transfiriéndolos por separado a su casto.A estos 20 ml de casto se añadieron 50 mg de doxiciclina cargado de colágeno-quitosano. Y el remojo de este andamio se realizó durante media hora. Después de media hora, el andamio de colágeno-quitosano cargado de doxiciclina fue sacado del tampón MES de 20 ml.Además, se empapó en una solución que contenía 19,5 ml de tampón MES, 0,1264 gramos de EDC y 0,014 gramos de NHS. El remojo se realizó durante un intervalo de tiempo de cuatro horas para la finalización de la reticulación. Después de la reticulación, el andamio de colágeno-quitosano cargado de doxiciclina reticulado se sacó de la solución y se transfirió a un contenedor, que se detalló en el procedimiento anterior, y se secó por separado.Aquí podemos ver claramente el andamio no reticulado y reticulado, junto con las mismas imágenes. De las imágenes se desprende claramente que la reticulación del andamio dio lugar a una disminución del tamaño de los poros debido a la formación de fuertes enlaces intramoleculares. La rata masculina de Wistar fue tomada y los dos en la marca de dos centímetros fueron dibujados en la región torácica dorsal.La herida de la supresión fue creada alrededor de la marca y el trazo de la herida fue tomado en una hoja de OHP. El rastro de la herida fue medido con la ayuda del método gráfico. La herida creada en el animal fue de unos 176 mm.Más adelante, la herida creada fue tratada con el andamio cargado doxycycline reticulado del colágeno-quitosano con la preparación primaria y supervisada por 21 días. Una vez que el animal fue recuperado de la anestesia, cada animal fue enjaulado individualmente. Y estos animales fueron alimentados con dieta normal y agua.Todos los animales, después de crear la herida, fueron divididos en tres grupos en los cuales cada grupo contenía seis animales. Aquí podemos ver claramente la diferencia entre el día cero y el día siete en el que la reducción de la herida de andamios reticulados cargados de doxiciclina fue de alrededor del 48% Y en esta imagen podemos ver claramente la diferencia entre el día 14 y el día 21 de todos los grupos en los que el andamio reticulado de colágeno cargado de doxiciclina se curó alrededor del 99% El área curada se aisló y procesó para estudios histopatológicos con la ayuda de la tinción de HMB. Aquí podemos ver claramente la epidermis reepithelized, el día 21, en el andamio de quitosano de colágeno cargado de doxiciclina.Mientras que en el andamio de control y reticulado, nada más que placebo, todavía la epidermis tuvo que ser formada. Al igual que nuestro propio estudio, los andamios reticulados de doxiciclina preparados han exhibido muchas propiedades ideales, como buena resistencia mecánica, biocompatibilidad, absorción de agua de liberación sostenida, junto con propiedades antibacterianas y antiinflamatorias. Estos andamios pueden ser una forma de dosis ideal para el tratamiento de heridas diabéticas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un obstáculo importante en las actuales terapias con células madre es determinar el método más eficaz para proporcionar a estas células a los tejidos del huésped. A continuación, describimos un método de entrega basado en quitosano que sea eficiente y simple en el planteamiento, al tiempo que permite derivadas de tejido adiposo de células madre para mantener su multipotencia.

La construcción de un hidrogel de colágeno para la entrega de la madre microesferas cargadas con células quitosano

La ingeniería de tejidos incluye a menudo la expansión in vitro con el fin de crear autoinjertos para la regeneración de tejidos. En este estudio se desarrolló un método para la expansión del tejido, la regeneración, y la reconstrucción in vivo con el fin de reducir al mínimo el procesamiento de células y materiales biológicos fuera del cuerpo.

Tejido picado en colágeno comprimido: Un Bio Transplant que contiene células para la reparación reconstructiva-puesta en escena individual

Células madre procedentes de adiposo (ASCs) son fácilmente aisladas y extraídas de la grasa de las ratas normales. Hojas de ASC pueden crearse utilizando ingeniería hoja de la célula y pueden ser transplantadas en Zucker ratas diabéticas grasosas exhibiendo espesor total defectos con hueso expuesto de la piel y luego se cubrieron con una bicapa de piel artificial.

Creación y el transplante de una hoja de células madre derivadas de adiposo (ASC) en un modelo de curación de herida diabética

Las heridas crónicas se desarrollan a partir de heridas agudas en un modelo de ratón diabético induciendo altos niveles de estrés oxidativo después de una herida cutánea de espesor completo. La herida se trata con inhibidores de la catalasa y glutatión peroxidasa, lo que resulta en un deterioro de la cicatrización y el desarrollo de biopelículas por bacterias presentes en el microbioma de la piel.

Protocolo para crear heridas crónicas en ratones diabéticos

En este trabajo se presenta un nuevo método para la síntesis de hidrogeles de matriz extracelular de cartílago descelularizado (DC-ECM). Los hidrogeles DC-ECM tienen una excelente biocompatibilidad y proporcionan un microambiente superior para el crecimiento celular. Por lo tanto, pueden ser andamios celulares ideales y sistemas de administración biológica.

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Optimización de la administración de vesículas extracelulares mediante un andamio bioimpreso en 3D con vaina central para el tratamiento de heridas crónicas

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Aquí presentamos un protocolo integrado para generar lesiones osteocondrales controladas en rodillas de oveja con el fin de establecer un modelo experimental adecuado para estudios de regeneración de tejido óseo y cartílago. El protocolo describe un método para inducir un defecto osteocondral de grosor completo en el cóndilo femoral, utilizando técnicas que minimizan los impactos en el bienestar animal y la variabilidad en los resultados.

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Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado.  Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.

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Aprenda a preparar andamios de colágeno-quitosano con doxiciclina para acelerar la curación de heridas diabéticas en modelos animales. Este método combina liberación sostenida del fármaco con propiedades antibacterianas y antiinflamatorias.

Andamio compuesto de colágeno-quitosano cargado de doxiciclina para la curación acelerada de heridas diabéticas

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