Estimación De Nanocristales Urinarios En Humanos Usando Etiquetado De Fluoróforo De Calcio Y Análisis De Seguimiento De Nanopartículas
9 de febrero de 2021
El objetivo de este estudio fue determinar si el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) podría detectar y cuantificar el calcio urinario que contiene nanocristales de adultos sanos. Los hallazgos del estudio actual sugieren que NTA podría ser una herramienta potencial para estimar nanocristales urinarios durante la enfermedad por cálculos renales.
Este protocolo puede detectar específicamente nanocristales que contienen calcio en la orina humana. Esta técnica podría potencialmente ser útil para predecir los primeros tiempos de la formación de la piedra de riñón así como otras enfermedades asociadas a urea cristalina. Demostrando el procedimiento estará el Dr.Parveen Kumar, un investigador IV en mi laboratorio.
Haga que los participantes consuman una dieta baja en oxalato durante tres días y ayunen durante la noche. Luego recoja una muestra de orina de 24 horas de los participantes antes de que consuman una carga de oxalato. Alimente a los participantes con un batido que contenga frutas y verduras con una carga de oxalato de aproximadamente ocho milimoles.
Haga que los participantes recojan su orina durante 24 horas después del consumo de oxalato y la devuelvan al día siguiente. Mantenga todas las muestras de orina a temperatura ambiente antes del procesamiento. Mida y registre el pH de la orina y el volumen de las muestras de orina.
Mezcle bien y agregue 50 mililitros de orina en un tubo cónico estéril etiquetado de 50 mililitros. Centrífuga la muestra a 1, 200 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de sobremesa. Deseche el sobrenadante, luego lave y resuspiente el pellet nuevamente con cinco mililitros de etanol 100%.
Centrífuga la muestra a 1, 200 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de sobremesa. Deseche el sobrenadante y resuspend el pellet en un mililitro de etanol al 100%. Guarde la muestra a menos 20 grados Centígrados para su posterior procesamiento o proceda inmediatamente con la tinción de las muestras.
Diluya nanopartículas de oro de tamaño de 100 nanómetros en agua ultrapura en una proporción de 1:1,000 y utilícelos para optimizar los ajustes del instrumento. Diluya las muestras de orina 20 veces en agua antes de la tinción con cinco milimoares Fluo-4 AM durante 30 minutos en la oscuridad y analice las muestras usando NTA. Prepare el oxalato del calcio y los cristales del fosfato de calcio según lo descrito en el manuscrito del texto antes del análisis de NTA.
Encienda la computadora y el instrumento, luego abra el software y encienda la cámara. Haga clic en el icono de captura en la esquina superior izquierda de la ventana para iniciar el modo de captura. Limpie la plataforma bombeando primero aire en ella usando una jeringa de un mililitro hasta que la plataforma parezca limpia.
Agregue suavemente agua al aparato dos o tres veces y use otra jeringa de un mililitro para eliminar cualquier burbuja de aire. Una vez que la plataforma esté limpia, agregue agua y verifique si hay contaminación en la superficie viendo la cámara, luego agregue nanopartículas de oro como control al inyector de la bomba de carga de muestras para configurar el instrumento. Ajuste el nivel de la cámara en la pantalla o en la perilla del lado derecho del instrumento hasta que la imagen comience a mostrar píxeles de colores y, a continuación, reduzca el nivel de la cámara.
A continuación, ajuste la pantalla para optimizar la imagen. Haga clic con el botón izquierdo del ratón en la imagen de vídeo. Mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón y arrastre la imagen hacia arriba y hacia abajo para obtener toda la vista.
Configure la velocidad de infusión y enfoque la cámara para que las nanopartículas de oro sean visibles en la pantalla de la cámara. Establezca la velocidad de infusión en alta para la configuración inicial para asegurarse de que se detectan las nanopartículas de oro. Una vez detectado, reduzca la velocidad a 50 microlitros por minuto para visualizar nanopartículas de oro.
Ajuste el nivel de la cámara para visualizar las partículas. Para muestras no manchadas, ajuste la ganancia de pantalla en el nivel cinco para lograr el enfoque de la cámara y establezca el nivel de la cámara en ocho. Una vez establecido el foco, registre el ejemplo.
Después de la optimización, vuelva a limpiar el aparato con agua antes de evaluar otras muestras para asegurarse de que el tubo esté limpio y las partículas no estén presentes. Para analizar las muestras teñidas, ajuste la cámara a la posición del filtro que contiene el filtro fluorescente adecuado y cargue las muestras diluidas y teñidas en el inyector de la bomba de carga de la muestra, reduciendo la velocidad a 20 microlitros por minuto para el análisis. Ajuste la ganancia de pantalla a cinco y el nivel de la cámara a 13.
Guarde los datos después de cada medición. Calcule el número promedio de nanopartículas para las cinco lecturas de cada muestra individual y analice los datos utilizando la desviación estándar o el error estándar de la media. Utilice pruebas T para el análisis por pareado.
Fluo-4 AM fue capaz de unirse tanto a los cristales de oxalato de calcio, que tenían entre 50 y 270 nanómetros de tamaño y tenían una concentración media de 1,260 millones de partículas por mililitro, como a los cristales de fosfato de calcio, que estaban entre 30 y 225 nanómetros y tenían una concentración media de 2, 220 millones de partículas por mililitro. Las muestras de orina de 24 horas recogidas antes de que la carga del oxalato contuviera algunos nanocrystals urinarios entre 110 a 300 nanómetros de tamaño. En cambio, había un aumento significativo en nanocrystals urinarios presentes en muestras del poste-oxalato.
Para confirmar la reproducibilidad del método, las muestras se midieron tres veces y no hubo variación significativa en las réplicas técnicas. Al intentar este protocolo, puede haber alguna dificultad con la adición de muestras sin burbujas a la máquina. Para evitar esto, agregue aire y agua a la máquina y luego agregue muestras lentamente.
Además, asegúrese de monitorear continuamente sus muestras y que no haya burbujas presentes. Este nuevo método será probado en individuos con enfermedad de la piedra de riñón del oxalato del calcio para supervisar la progresión de la enfermedad y/o para predecir riesgo de la piedra de riñón.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este estudio investiga el uso del análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para detectar y cuantificar nanocristales que contienen calcio en la orina, lo cual podría ayudar a comprender la enfermedad de los cálculos renales. Los hallazgos indican que el NTA podría servir como una herramienta valiosa para estimar los nanocristales urinarios.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Nefrología
- Nanotecnología
- Urología
Antecedentes
- Los cálculos renales son un problema de salud común asociado con cristales en la orina.
- Los nanocristales que contienen calcio pueden indicar etapas tempranas de la formación de cálculos renales.
- Los métodos actuales para detectar estos cristales pueden ser inadecuados.
- El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) ofrece un enfoque novedoso para cuantificar nanocristales urinarios.
Objetivo del estudio
- Evaluar la eficacia de la NAN en la detección de nanocristales de calcio en la orina.
- Evaluar el potencial de la NAN para predecir la enfermedad de cálculos renales.
- Establecer un protocolo confiable para el análisis de muestras de orina.
Métodos Utilizados
- Los participantes siguieron una dieta baja en oxalatos y proporcionaron muestras de orina de 24 horas.
- Las muestras de orina se procesaron y analizaron utilizando NTA.
- Se utilizaron nanopartículas de oro para la calibración del instrumento.
- La tinción con Fluo-4 AM se empleó para visualizar los cristales de calcio.
Resultados principales
- Se observaron diferencias significativas en las concentraciones de nanocristales urinarios antes y después de la carga de oxalato.
- Se detectaron y cuantificaron con éxito cristales de oxalato de calcio y de fosfato.
- El método demostró reproducibilidad con variación mínima en réplicas técnicas.
- Se observaron dificultades en el manejo de las muestras, particularmente relacionadas con la formación de burbujas.
Conclusiones
- La TAN es una técnica prometedora para el monitoreo de nanocristales urinarios.
- Este método podría mejorar la detección temprana de la enfermedad de cálculos renales.
- Se necesitan más estudios para validar su aplicación en entornos clínicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección de nanocristales urinarios proporciona una comprensión temprana y mecanicista de la patogénesis de los cálculos renales, permitiendo una evaluación predictiva del riesgo antes de la formación clínica de cálculos. Este enfoque apoya la validación de objetivos en nefrología mediante la cuantificación de nanocristales que contienen calcio como biomarcador de la cristalización patológica. El método ofrece una lectura cuantitativa y escalable para evaluar intervenciones modificadoras de la enfermedad en investigaciones preclínicas y traslacionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición de la carga de nanocristales como lectura funcional de la sobresaturación urinaria.
- Valor operativo: Proporciona un ensayo estandarizado basado en fluorescencia para nanocristales de oxalato y fosfato de calcio utilizando la tinción con Fluo-4 AM.
- Valor predictivo: Apoya la validación de modelos preclínicos mediante la correlación entre la carga de nanocristales y el riesgo de lesión epitelial in vitro.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Listo para el ensayo: La NTA proporciona recuentos cuantitativos de partículas resueltos por tamaño tras la purificación con etanol y la tinción con fluoróforo.
- Reproducibilidad: Las réplicas técnicas muestran variaciones mínimas, lo que respalda la precisión del ensayo en estudios longitudinales.
- Escalabilidad: El método permite el procesamiento de muestras en alto volumen mediante pasos estandarizados de centrifugación y dilución.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Detecta la nanocristaluria en humanos sanos sometidos a una sobrecarga de oxalato, modelando las condiciones iniciales de formación de cálculos.
- Continuidad traslacional: Conecta los hallazgos sobre la citotoxicidad de nanocristales in vitro con la detección de biomarcadores urinarios in vivo.
- Estratificación de riesgo: Permite el monitoreo longitudinal de las fluctuaciones de nanocristales para orientar el momento de la intervención profiláctica.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta las pruebas de eficacia preclínica, ofreciendo un biomarcador cuantitativo para las vías de cristalización.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante la cuantificación de la formación de nanocristales como una lectura directa de la saturación mineral en la orina.
- Tamizaje: Permite obtener muestras listas para ensayos con métricas definidas de tamaño y concentración para el tamizaje de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Genera datos de concentración de partículas y distribución de tamaño susceptibles de comparación estadística entre diferentes condiciones.
- Investigación Traductiva: Se alinea con los esfuerzos de cualificación de biomarcadores al proporcionar una señal urinaria detectable y vinculada mecanísticamente.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la cuantificación de nanocristales en diversos modelos de enfermedad y estudios de intervención.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en las vías de cristalización al proporcionar una enumeración directa de nanocristales.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante lavados estandarizados con etanol y calibración del instrumento con nanopartículas de oro.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar o descartar al permitir la detección temprana de cambios favorables a la cristalogénesis en la orina.
- Impacto en la cartera: Informa la priorización ajustada al riesgo de compuestos dirigidos a la sobresaturación urinaria o a la inhibición del crecimiento cristalino.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en análisis de seguimiento de nanopartículas y microscopía de fluorescencia.
- Depende de instrumentación para análisis de seguimiento de nanopartículas equipada con filtros fluorescentes y sistemas de inyección de muestras calibrados.
- Necesita la recolección estandarizada de orina, el registro de pH y volumen, y una purificación basada en etanol para evitar contaminación.
- Requiere optimización de la dilución de la muestra y de la duración de la tinción para prevenir la agregación o la atenuación de la señal.
- Está limitado por la necesidad de minimizar la formación de burbujas durante la carga de la muestra para garantizar un seguimiento preciso de las partículas.
