Caracterización funcional de variantes de RYR1 humanas expresadas endógenamente

Este protocolo es importante porque utiliza material para el paciente. Si el paciente tiene la enfermedad, el uso de sus células debe reflejar con mayor precisión la respuesta biológica del paciente. Esta técnica es simple de realizar, directa y no requiere equipos sofisticados.

Estos métodos se pueden utilizar para el diagnóstico, por ejemplo, para demostrar que una mutación RYR1 cambia funcionalmente la homeostasis del calcio, así como para probar la posible función terapéutica de un compuesto. Dependiendo del conocimiento y las habilidades técnicas del investigador individual, los experimentos de prueba deben realizarse antes de que se utilicen muestras reales de pacientes. Para monitorear los cambios en la concentración intracelular de calcio de los linfocitos B transformados en EBV, resuspenda las células B inmortalizadas a una concentración de una vez 10 a la séptima célula por mililitro en la solución de Krebs Ringer y Fura-2 AM a una concentración final de cinco micromolares para una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius.

Al final de la incubación, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en la solución fresca de Krebs Ringer a una concentración de dos veces 10 a la sexta célula por mililitro. Justo antes de comenzar el experimento, centrifugue las células nuevamente y resuspenda rápidamente las células en 1.5 mililitros de la solución de Krebs Ringer suplementada con EGTA 0.5 milimolar pero sin calcio agregado. Transfiera las células a una cubeta de espectrofluorómetro de vidrio de tres mililitros y registre la relación de fluorescencia en un espectrofluorómetro equipado con un agitador magnético a la velocidad máxima y 37 grados Celsius durante aproximadamente 30 segundos.

Para evaluar la respuesta de liberación de calcio en células individuales, coloque una placa una vez 106 células cargadas con Fura-2 AM en un mililitro de solución de Krebs Ringer suplementada con cloruro de calcio de un milimolar en deslizamientos individuales de cubierta de vidrio recubierto de poli-L-lisina, e incube los deslizamientos de cubierta a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo celular humidificado durante 30 minutos. Cuando las células se hayan adherido, coloque un deslizamiento de cubierta en una cámara de perfusión y comience a perfundir las células a dos mililitros de solución de Krebs Ringer complementada con una tasa de flujo de calcio por minuto de un milimolar. Utilizando un microscopio fluorescente invertido equipado con un objetivo de inmersión de aceite de 40 veces y los filtros apropiados, registre las mediciones en línea con un accesorio de cámara de dispositivo de carga acoplada controlado por software a intervalos de un segundo, a un tiempo de exposición fijo.

Para lograr la estimulación celular, utilice un estimulador de perfusión celular con 12 válvulas para agregar las diferentes concentraciones de agonista. Para aislar los miotubos de las biopsias de músculo humano, primero enjuague la biopsia con PBS estéril para eliminar el exceso de sangre antes de picar el tejido en pequeños fragmentos de 0,5 a un milímetro. Coloque de dos a tres fragmentos en insertos individuales en cada pozo de una placa de cultivo de tejido de seis pocillos que contenga 1,5 mililitros de medio de crecimiento muscular humano por pozo y 500 microlitros de medio por inserto, y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular.

Para medir los cambios en la expresión de calcio en los miotubos humanos, cuando se puedan observar miotubos multinucleados, reemplace los sobrenadantes de cultivo de miotubos con un medio de diferenciación fresco complementado con 10 microlitros de Fura-2 AM de un milimolar durante una incubación de 30 minutos en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, transfiera un cultivo deslizante de cubierta de vidrio a la cámara de perfusión y enjuague las células con la solución de Krebs Ringer suplementada con cloruro de calcio de dos milimolares. Luego realice mediciones de calcio en línea como se demuestra utilizando un objetivo de inmersión en agua de 20 veces.

En este análisis representativo, se observó un rápido aumento de calcio en los linfocitos B inmortalizados por el VEB después de la adición de agonistas que disminuyeron lentamente a niveles de reposo con el tiempo. En un experimento similar, la adición de thapsigargin 400-nanomolar causó un gran transitorio de calcio que alcanzó un valor máximo de fluorescencia de 2,4 unidades arbitrarias. Este valor de fluorescencia se consideró del 100% cuando se construyó la curva de dosis-respuesta correspondiente.

En este análisis, las células B inmortalizadas fueron estimuladas con cafeína de cinco milimolares durante 20 segundos, lo que resultó en un aumento inmediato en la relación de fluorescencia de 340 y 380 nanómetros. Para cada concentración de cafeína probada, se calculó el pico inducido por cafeína en la proporción de 340 por 380 nanómetros de fluorescencia y se utilizó para construir una curva de dosis-respuesta. La liberación de calcio de los miotubos diferenciados también se puede evaluar en respuesta al enrojecimiento con cloruro de potasio, se pueden generar diferentes concentraciones de agonistas y / o cafeína, y se pueden generar curvas de respuesta a dosis normales.

Es importante asegurarse de que las células estén cargadas correctamente con Fura-2 y que tanto las longitudes de onda de 340 como las de 380 nanómetros respondan a la adición del agonista. Las mediciones de calcio intracelular con indicadores de calcio fluorescentes se pueden investigar en la mayoría de las células de mamíferos y se pueden aplicar al estudio de los cambios de calcio intracelular en respuesta a diferentes estímulos.