Preparación rápida de la rejilla para la crio-microscopía electrónica resuelta en el tiempo

Hola, y bienvenidos a este video de JoVE. Queremos presentarle la configuración que tenemos aquí para la creación rápida de cuadrículas, un estudio resuelto en el tiempo que estamos desarrollando en Leeds. Tenga en cuenta que este no es un sistema estándar, pero esperamos que al darle una cuenta detallada de todas las cosas y los parámetros que hacemos, pueda desarrollar sistemas similares en sus propios laboratorios.

Una descripción detallada del dispositivo se da en el protocolo de Richmond. Aquí, vamos a dar una guía paso a paso para una preparación rápida de la cuadrícula y em resuelto en el tiempo. En nuestra experiencia, la concentración de proteínas debe ser de dos miligramos por mililitro o más. El protocolo requiere un volumen mínimo de unos 50 microlitros.

Encienda el dispositivo. Luego encienda la PC de control e inicie el software de control. Inicialice todas las bombas de jeringa presionando el botón de inicialización en cada bomba de jeringa.

Encienda la fuente de alimentación del potenciómetro, configálelo a nueve voltios e inicie el software de control del osciloscopio. Se necesita gas nitrógeno presurizado para generar el aerosol. Abra el cilindro de nitrógeno y ajuste la presión a 2 bar.

Asegúrese de que todas las válvulas de la bomba de jeringa estén en posición de carga. Para hacer esto, cambie todas las válvulas para dispensar en el software de control y luego vuelva a cargar. Ajuste todas las jeringas a cero.

Cualquier burbuja de aire presente en el sistema debe eliminarse en esta etapa. Para hacer esto, las jeringas pueden tener que ser desenroscados, las burbujas retiradas manualmente, y las jeringas montadas de nuevo cuando no contienen más burbujas. El sistema de manejo de líquidos generalmente se almacena en agua.

Antes de cargar la muestra, el sistema se equilibra con el búfer. Esto se hace lavando el tubo con un exceso de tampón. Coloque un tubo que contenga al menos 200 microlitros de tampón sobre la jeringa uno.

La parte superior del tubo debe perforarse para unirlo. Aspire una cantidad adecuada de tampón, entre 50 y cien microlitros con jeringa uno utilizando el software de control. Cambie la válvula uno para dispensar.

Dispense todo el líquido en la jeringa uno. Devuelva la válvula uno a la posición de carga y presione el botón de inicialización en la jeringa uno para preparar el sistema para el siguiente ciclo de lavado. Estos pasos generalmente se repiten tres veces para garantizar un lavado completo de la tubería.

A continuación, se coloca la boquilla de pulverización. Coloque una rejilla EM en el brazo de hundimiento. Coloque la rejilla frente a la boquilla de pulverización.

Dispense el búfer utilizando el software de control. Si la boquilla y la rejilla están alineadas, el líquido debe acumularse después de la pulverización durante un período prolongado de tiempo. Si es necesario, ajuste la posición de la boquilla y luego verifique nuevamente dónde se acumula el líquido en la rejilla.

A continuación, ajuste la posición de la copa de etano. La punta de las pinzas debe llegar aproximadamente al centro de la copa de etano. Realice una ejecución de prueba para asegurarse de que todas las configuraciones son correctas.

Cierre la cámara de humedad. Asegúrese de que el camino del émbolo esté despejado. Aspire el volumen de tampón requerido para una sola carrera en jeringa uno.

Cambie la válvula uno para dispensar. Inicie la ejecución presionando run'in en el software de control. Compruebe que la bomba de jeringa uno está en movimiento, dos segundos en este caso, y la rejilla se hunde después de un retraso apropiado, 1,5 segundos aquí.

Cuando termine la carrera, ajuste la presión sobre el brazo del émbolo al valor deseado. Presione OK'in en el software de control para liberar la presión del brazo que se hunde. Ahora la taza de etano está fría y llena de etano líquido.

Descarga con brillo las rejillas antes de usarlas. Una descarga de resplandor típica es de 90 segundos a 10 miliamperios en aire de 0,1 milibares. El tubo se equilibra con la muestra.

Si el volumen de muestra disponible es bajo, el tubo puede equilibrarse con un solo volumen muerto. Muestra aspirada. Por lo general, el volumen muerto es de alrededor de 30 microlitros.

Cambie la válvula uno para dispensar. Dispensar la muestra a través de tubos y boquillas. A continuación, aspire la cantidad de muestra requerida para una sola ejecución.

Cambie la válvula uno para dispensar. Compruebe que la humedad relativa ha alcanzado el valor deseado. Por lo general, preparamos cuadrículas al 60% o más.

Esto puede tardar unos minutos. Coloque las pinzas que sostienen una rejilla descargada por resplandor en el brazo de inmersión. Coloque la corredera del potenciómetro en la posición de inicio, lista para la medición de velocidad.

Configure el disparador para la medición de velocidad en el software del osciloscopio. Coloque la taza de etano líquido y cerca de la cámara de humedad. Asegúrese de que el camino del émbolo esté despejado.

Inicie la ejecución en el software de control. Cuando termine la ejecución, presione OK'in en el software de control para liberar la presión del brazo que se hunde. Abra la cámara de humedad, afloje la conexión entre el brazo de inmersión y las pinzas.

Suba por el brazo de inmersión mientras mantiene la rejilla en etano líquido. Luego transfiera las rejillas al nitrógeno líquido y al almacenamiento. Guarde la medición del osciloscopio.

Restablezca manualmente la posición del control deslizante y el émbolo del potenciómetro. Repita el protocolo para preparar cuadrículas de réplica. Los experimentos resueltos en el tiempo se realizan de manera similar.

Se necesitan concentraciones de stock más altas para los experimentos resueltos en el tiempo debido a la dilución en la etapa de mezcla. Para un experimento resuelto en el tiempo, use las tres jeringas. El tubo está conectado a las bombas de la jeringa y a la boquilla de pulverización.

La boquilla de pulverización microfluídica utilizada aquí también contiene un elemento de mezcla. Tenga en cuenta que los tubos más largos darán un volumen muerto más grande y los pasos de equilibrio de lavado requieren más tampón y muestra. Equilibre todas las jeringas con tampón y muestree por separado.

Por lo general, la jeringa uno se usa para la muestra A' y las jeringas dos y tres se usan para la muestra B'Después de equilibrar el tubo, cargue la muestra A en la jeringa uno y la muestra B en las jeringas dos y tres. Luego, cambie las válvulas de una a tres para dispensar. Inicie la ejecución en el software de control.

Tenga en cuenta que se necesita un script de ejecución diferente para un experimento resuelto en el tiempo. Se pueden lograr diferentes retrasos de tiempo de dos maneras. Al ajustar la velocidad del émbolo, se puede cambiar el retraso de tiempo desde la mezcla hasta la congelación.

Una velocidad de inmersión más rápida conducirá a un retraso de tiempo más corto. Alternativamente, la distancia de etano de pulverización se cambia ajustando la posición vertical de la boquilla de pulverización. Aumentar la distancia resultará en un retraso de tiempo más largo.

En el microscopio electrónico a bajo aumento, una cuadrícula típica se ve así. Las áreas de hielo delgado, como se indica, son adecuadas para la adquisición de datos. A aumentos más altos, las partículas deben ser claramente visibles.

Con una muestra de prueba como la apoferritina, un conjunto de datos relativamente pequeño de una sola cuadrícula es suficiente para una reconstrucción a una resolución de tres a cuatro angstrom. Para los experimentos resueltos en el tiempo, recopilamos conjuntos de datos de diferentes puntos de tiempo o cuadrículas. Es útil combinar los datos para la clasificación 3D y luego rastrear las partículas hasta sus puntos de tiempo.

De esta manera, los datos pueden proporcionar información estructural e información sobre la cinética de reacción. En conclusión, esperamos que os haya gustado el vídeo. Esperamos que con las descripciones detalladas en el documento de JoVE junto con el video, pueda realizar sus propios experimentos a través de la creación rápida de cuadrículas, que se ha demostrado que alivia algunos de los problemas de mutación o ayuda con las interacciones en la interfaz aire-agua, todo lo que necesita para realizar sus propios estudios resueltos en el tiempo para tratar de atrapar algunos de esos estados de no equilibrio.

Entonces, feliz fabricación de cuadrículas.