Medición in vivo de la función muscular extensora de la rodilla en ratones

La cuantificación de la fuerza máxima extensora de la rodilla es imprescindible para comprender las adaptaciones funcionales al envejecimiento, la enfermedad, las lesiones y la rehabilitación. Presentamos un método novedoso para medir repetidamente el par tetánico máximo isométrico de extensión de rodilla in vivo.

La fuerza extensora de la rodilla es un resultado funcional común evaluado en la investigación clínica. Sin embargo, los métodos para evaluar repetidamente el músculo extensor de la rodilla, particularmente la fuerza del cuádriceps, en estudios con roedores han sido relativamente limitados. Este protocolo no invasivo se puede utilizar para medir el par tetánico máximo isométrico de los extensores de rodilla en ratones, y se puede repetir longitudinalmente.

Nuestros métodos apoyan el desarrollo de modelos preclínicos para mejorar la recuperación después de las lesiones o en pacientes con artrosis. Dada la amplitud de los modelos de roedores desarrollados para estudiar los resultados musculoesqueléticos después de una lesión de rodilla u osteoartritis, existe la necesidad de una evaluación no invasiva de la fuerza del cuádriceps. La demostración visual es fundamental para la integridad de los datos, ya que demostraremos cómo colocar de manera óptima los electrodos para estimular al máximo los extensores de la rodilla.

Antes de comenzar el experimento, compruebe que todas las máquinas estén conectadas de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Conecte el motor de palanca muscular de doble carga con el aparato de extensión de rodilla a la plataforma animal, encienda la bomba de agua a 37 grados centígrados, luego encienda la computadora, el estimulador bifásico de alta potencia y el sistema de palanca de modo dual de 2 canales, y agregue isoflurano al vaporizador a la línea de llenado máximo. Para optimizar la colocación de la sonda, en el software del instrumento, seleccione Preparar experimento y Configurar instant Stim, y establezca la frecuencia de pulso en 125 hercios, el ancho de pulso en 0,2 metros por segundo, el número de pulsos en uno, la frecuencia del tren en 0,5 hercios y el tiempo de ejecución en 120 segundos.

A continuación, seleccione Archivo y abra Live Data Monitor. Para realizar experimentos de contracción y frecuencia de torque, seleccione un estudio de programa previo que incluya los experimentos apropiados de frecuencia de torque de contracción y extensión de rodilla. Seleccione el ratón experimental apropiado o Agregar nuevo animal y proporcione la información correspondiente del ratón que se almacenará con los datos de par.

A continuación, seleccione Siguiente experimento o Experimento anterior para pasar del protocolo de contracción a la secuencia de frecuencia de fuerza. Después de la anestesia, confirme la sedación por falta de respuesta al reflejo del pedal y coloque al ratón en posición supina en una plataforma calentada con la cabeza y un cono nasal. Use cortapelos eléctricos para afeitar el cabello de la extremidad posterior derecha.

Después de limpiar el cabello del ratón y la plataforma, sujete firmemente la extremidad posterior superior de la rodilla. Después de sujetar, coloque la extremidad posterior inferior en el aparato de extensión de la rodilla con la tibia anterior tocando ligeramente la pieza de plástico ajustable, y envuelva la cinta quirúrgica alrededor de la parte inferior de la pieza de plástico ajustable para asegurar la pierna al aparato, luego ajuste las perillas en la plataforma hasta que la rodilla se doble en un ángulo de 60 grados, y coloque un trozo de cinta adhesiva sobre el torso del ratón para evitar el movimiento compensatorio con la máxima extensión de la rodilla. Coloque el electrodo por vía subcutánea de dos a cuatro milímetros proximal a la rodilla directamente por encima de los músculos cuádriceps y extensores de la rodilla aproximadamente a uno o dos milímetros de distancia.

Para determinar la ubicación óptima del electrodo, en el software, seleccione Estimulación instantánea y Monitor de datos en vivo y ajuste la corriente a 50 miliamperios para contracciones repetidas para confirmar la extensión según lo indicado por una curva de contracción negativa. Para lograr el máximo par de contracción de la extensión de la rodilla, ajuste las sondas mientras revisa la respuesta en la ventana Live Data Monitor. Mientras entrega contracciones repetidas con estimulación instantánea, palpe los músculos flexores de la rodilla del ratón con el dedo índice para confirmar que no hay activación de los músculos antagonistas.

Para una máxima estimulación extensora de rodilla, reposicione las sondas según sea necesario. Cuando se haya determinado la ubicación óptima de la sonda, establezca la corriente en 50 miliamperios y seleccione Ejecutar experimento para producir una sola contracción. Seleccione Analizar resultados para mostrar la salida de par y registrar el par de contracción que se muestra en Fuerza máxima con la línea de base restada.

Repita el experimento que se ha demostrado hasta que el par de contracción se estabilice o comience a disminuir. Aumentar la corriente a 10 a 20 miliamperios y registrar el par de contracción para cada experimento. Registre la corriente más baja a la que se logra el mayor par de contracción.

Esta corriente se utilizará para el experimento de frecuencia de fuerza. Para determinar el efecto de par tetánico isométrico máximo, seleccione el experimento de frecuencia de par preprogramado para la extensión de la rodilla y establezca la duración del estímulo en 0,35 segundos, las secuencias de frecuencia en 10, 40, 120, 150, 180 y 200 Hertz y el período de descanso entre los pulsos y las contracciones en 120 segundos. Luego, haga clic en Ejecutar experimento y analizar resultados, y registre manualmente el par en cada frecuencia, asegurándose de que el canal de fuerza esté invertido ya que la contracción del extensor de la rodilla producirá un par negativo.

Tenga en cuenta el valor de fuerza máxima más alto como el par tetánico isométrico máximo. Al final del experimento de frecuencia de par, realice una contracción de seguimiento y compare la contracción de seguimiento con la contracción máxima inicial a la misma corriente para evaluar el daño o la fatiga. Cuando se hayan adquirido todas las mediciones de par, retire suavemente las sondas de electrodos y la sujeción de la rodilla y coloque el mouse en una jaula de recuperación en una almohadilla térmica con monitoreo hasta la recostación completa.

En este análisis representativo, se introdujeron tres contracciones aisladas a una estimulación de corriente inicial de 10 Hertz. Se observó fusión de contracción parcial a 40 Hertz y la salida de par tetánico máximo se alcanzó a 120 a 180 Hertz. En este experimento, se obtuvieron curvas de frecuencia de par de extensión de rodilla para tres ratones en el momento cero y a las dos semanas después de la evaluación inicial.

Como se observó, los valores de par bruto y los valores de par bruto normalizados al peso corporal del ratón fueron estadísticamente similares en ambos puntos de tiempo, lo que confirma la reproducibilidad del análisis. Como se ilustra en esta área bajo el análisis de la curva utilizando datos de torque isométrico normalizado de peso corporal para experimentos completos de frecuencia de torque para cuatro ratones separados, se obtuvo un torque total similar después de análisis repetidos con los mismos animales. La salida de par tetánico máximo también demostró una variabilidad mínima dentro de cada animal.

El protocolo de par tetánico de pico extensor de rodilla es una herramienta útil para detectar diferencias de fuerza en múltiples modelos de ratón. Por ejemplo, en este análisis, se puede observar un marcado contraste entre la fuerza extensora de la rodilla y un ratón de tipo salvaje no lesionado y un modelo de ratón transgénico de hipertrofia suprafisiológica. Además, se observó una disminución de casi el 50% en el par máximo en animales de tipo salvaje siete días después de la transección quirúrgica del ligamento cruzado anterior.

La colocación óptima de los electrodos es fundamental para lograr resultados significativos y repetibles. La fatiga muscular extensora de la rodilla es un indicador importante de la función física, incluidas las contracciones submáximas repetidas y las evaluaciones futuras agregarían una mayor relevancia traslacional a este método en modelos preclínicos. Los estudios que investigan los mecanismos de adaptación muscular, a menudo utilizan modelos de ratón debido a la simplicidad de la modificación genética.

Esta técnica ofrece un método no invasivo para medir repetidamente la función extensora de rodilla in vivo en estos modelos preclínicos.