Microscopía multifotónica intravital en tiempo real para visualizar ultrasonido enfocado y tratamientos de microburbujas para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica

La exposición al ultrasonido en presencia de microburbujas ha surgido como un método eficaz para aumentar transitoria y localmente la permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Normalmente, la barrera hematoencefálica impide la administración de medicamentos potenciales para varias enfermedades cerebrales. Tras la sonicación, las microburbujas inyectadas comienzan a oscilar e inducen tensión en la pared del vaso, abriendo uniones estrechas y, finalmente, permitiendo que los medicamentos crucen la barrera hematoencefálica En los modelos preclínicos, el efecto del ultrasonido y el tratamiento con microburbujas a menudo se estudia mediante imágenes de resonancia magnética mejoradas con contraste o estudiando la extravasación de tintes ex vivo.

El inconveniente de este enfoque es que no se puede adquirir la respuesta en tiempo real durante e inmediatamente después de la exposición al ultrasonido. Las imágenes multifotónicas intravitales del cerebro brindan la oportunidad de estudiar estos efectos en tiempo real. En el siguiente video, presentaremos instrucciones paso a paso sobre cómo colocar una ventana craneal en un mouse y realizar un tratamiento de microburbujas de ultrasonido utilizando un transductor de anillo montado en el cráneo.

Este procedimiento permite la sonicación simultánea y la obtención de imágenes multifotónicas in vivo. Para comenzar prepare los materiales necesarios para la cirugía de ventana craneal y los tratamientos de microburbujas de ultrasonido. En este video, mostramos una cirugía aguda de ventana craneal sin recuperación.

Para la cirugía de ventana craneal de recuperación crónica, se necesitan herramientas y materiales esterilizados, un espacio quirúrgico estéril y medicamentos apropiados. Antes de la cirugía administrar anestesia y analgesia. Retire el pelaje de la cabeza.

Coloque al animal en un marco estereotáxico. Inserte un catéter en la vena de la cola para inyecciones de dextrano y microburbujas. Mantenga la temperatura central del animal de 37 grados mediante el uso de una fuente de calor.

Aquí estamos usando un guante lleno de agua tibia. Para eliminar el cuero cabelludo, levante la piel entre los ojos con fórceps y corte a lo largo de la sutura sagital. Retire el periostio que cubre la superficie externa del cráneo con un hisopo de algodón.

Luego marque la ubicación deseada de la ventana craneal en el cráneo y comience a perforar a lo largo del contorno. Para evitar que el cráneo se sobrecaliente durante la perforación, gotee solución salina sobre el cráneo con una jeringa o aplique un trozo de esponja quirúrgica empapada en solución salina. Alternar entre perforar y enfriar el cráneo.

Compruebe el progreso de la perforación aplicando una presión suave sobre la isla ósea. Retire la isla de huesos usando un par de fórceps. Asegúrese de que el cerebro se mantenga húmedo mediante el uso de un trozo de esponja quirúrgica que haya sido presomada en solución salina.

Para colocar una ventana craneal, coloque una gota de solución salina en un lado de un labio y maniobra sobre el orificio en el cráneo. Extiende una capa de pegamento alrededor del perímetro de la cubierta para unirla al cráneo. Una vez que el pegamento esté completamente seco, deposite la solución de agarosa en la ventana y coloque el transductor encima.

Aplique una presión firme de tal manera que haya un mínimo de agarosa entre el transductor y la ventana craneal. Cuando la agarosa se haya enfriado a una consistencia similar a la gelatina, corte el exceso de agarosa de las circunferencias de la cubierta del transductor. Extiende una capa de pegamento a lo largo de las circunferencias de la cubierta del transductor para adherirla al cráneo.

Después de que el pegamento se haya secado por completo, coloque al animal debajo de la lente del objetivo del microscopio. Asegúrese de que el objetivo no colisione con el transductor o la cubierta. Seleccione un campo de visión en el microscopio multifotónico.

Configure una exploración por imágenes de la vasculatura y comience la sonicación. Para este protocolo, utilizamos un transductor de anillo que se opera a una frecuencia de conducción de 0,82 megahercios, ciclos de 10 milisegundos indexados mecánicamente de 0,2 a 0,4 y frecuencias de repetición de pulsos entre uno y cuatro Hertz. Las microburbujas sonovue se inyectan a una dosis de un mililitro por kilogramo.

Los tratamientos exitosos de microburbujas de ultrasonido se pueden detectar mediante la extravasación de dextrano fluorescente desde el espacio intravascular hasta el extravascular, lo que indica un aumento en la permeabilidad de BBB. Para evaluar la cinética de la fuga de dextrano como modelo representativo para la administración de fármacos, la intensidad de la señal entre los espacios intra y extravascular se puede evaluar utilizando herramientas como MATLAB. Para evaluar los cambios vasculares inducidos por los tratamientos de microburbujas de ultrasonido, se puede medir el diámetro del vaso de interés antes, durante y después del tratamiento de microburbujas de ultrasonido.

El análisis de imágenes se puede realizar mediante el uso de software como ImageJ, FIJI o herramientas de programación. Aquí Imaris se utilizó para la segmentación y clasificación de los vasos sanguíneos. La microscopía multifotónica intravital del cerebro combinada con transductores de anillo proporciona un método para monitorear los efectos inducidos por el tratamiento de microburbujas de ultrasonido en tiempo real a una alta resolución espacial y temporal.

Se pueden obtener datos cuantitativos y cualitativos para estudiar, por ejemplo, la cinética de extravasación y los cambios vasculares. El método experimental presentado aquí se puede aplicar a varios modelos de investigación y a diversas aplicaciones de ultrasonido.