Preparación de la rejilla microscópica crio-electrónica para estudios resueltos en el tiempo utilizando un nuevo sistema robótico, Spotiton
25 de febrero de 2021
El protocolo presentado aquí describe el uso de Spotiton, un novedoso sistema robótico, para entregar dos muestras de interés en una rejilla de nanocables auto-absorbentes que se mezclan durante un mínimo de 90 ms antes de la vitrificación en criógeno líquido.
Usando el sistema robótico Spotiton, uno puede mezclar y vitrificar una proteína de interés con un compañero que interactúa en una rejilla de microscopio electrónico en tan solo 90 milisegundos. Este protocolo permite la captura de confirmaciones de proteínas intermedias que son demasiado transitorias para ser capturadas por técnicas estándar de preparación de rejillas. Spotiton resuelto en el tiempo puede informar sistemas biológicos o bioquímicos de menos de un segundo, como la activación del canal de membrana, la síntesis de ADN o ARN, o la interacción temprana de un medicamento o anticuerpo con su proteína objetivo.
El usuario debe administrar simultáneamente varios componentes que afectan directamente la calidad de una red. Es importante entender el sistema antes de usarlo y tener paciencia al preparar las rejillas. Para comenzar, abra la válvula principal en el tanque de suministro de nitrógeno y asegúrese de que el depósito del sistema esté lleno de agua ultrapura des gaseada.
Encienda el ordenador y el sistema Spotiton en la regleta de alimentación multicorriente. Haga clic en el icono del escritorio para abrir la interfaz de usuario del software Spotiton. En el menú Herramientas, seleccione Inicializar etapas para inicializar y alojar los robots de tres ejes y el conjunto del cabezal del dispensador giratorio, asegurándose de que las puntas del dispensador apunte hacia abajo antes de la inicialización y el homing.
En el menú principal, haga clic en Ir a posición segura para enviar los robots a la posición segura. En la pestaña Aspirar, seleccione Prime para enjuagar los cabezales del dispensador varias veces con agua del depósito. Continúe hasta que se puedan ver dos corrientes ininterrumpidas de agua emergiendo de las puntas.
En la pestaña Inspeccionar, envíe la punta uno a la cámara de inspección y pruebe el agua contra incendios, ajustando la amplitud hasta que se produzcan gotas discretas. Presione el botón Grabar en el monitor superior de la cámara para grabar un video de la punta uno disparando. Envíe el consejo dos a la cámara de inspección.
Reproduzca el video de la punta uno disparando en el monitor del lado derecho al mismo tiempo que la punta dos se dispara en el monitor superior de la cámara, coincidiendo con el patrón de producción de gotas de los dos dispensadores. Retire las pinzas del soporte del robot de rejilla con la llave Allen suministrada. En un banco cercano, coloque un nanocable de rejilla de prueba hacia arriba en el borde del bloque de rejilla.
Agarra con cuidado el borde de la rejilla y colóquelo correctamente en las pinzas. Luego vuelva a montar las pinzas. En la pestaña Cryo, haga clic en Sugerencia a la cámara para mover la punta uno al campo de visión de la cámara de trayectoria de inmersión superior, asegurándose de que Live esté seleccionado en el monitor superior de la cámara.
Encienda y ajuste la luz superior de la cámara. Coloque la punta uno visible en el monitor superior de la cámara, haciendo clic con el mouse dentro del monitor. Haga clic en Cuadrícula a cámara para colocar la cuadrícula frente a la cámara superior, luego ajuste la punta una posición nuevamente si es necesario.
En la pestaña Cryo, asegúrese de que Vitrified Grid no esté seleccionada, haga clic en Destino de cola y luego en Plunge. Evalúe las imágenes superiores e inferiores para confirmar que los dispensadores funcionan normalmente. Diluya dos muestras a las concentraciones deseadas con un tampón apropiado, idealmente usando el mismo para ambos, y llene el recipiente criogénico con nitrógeno líquido.
El plasma limpia de tres a cuatro rejillas de nanocables utilizando cinco vatios de hidrógeno y oxígeno, y 1,5 minutos como punto de partida. Conecte el nebulizador y observe la salida de vapor del puerto central de la tapa del nebulizador. Observe el Monitor de humedad en vivo en la ventana principal o abra el Rastreador de humedad ambiental en Informes y ambiente.
Compruebe los niveles de humedad en las zonas de la cámara y el sudario. Agregue cinco microlitros de cada muestra en las tazas de muestra. Cargue las tazas de muestra en la bandeja de retención con una muestra para la punta uno a la izquierda y para la punta dos a la derecha.
Luego empuje la bandeja hacia atrás en la máquina hasta que se asiento. En la pestaña Aspirar, seleccione tres microlitros para el volumen que se aspirará por cada punta. Asegúrese de que la bandeja de muestras se haya asentado de forma segura, haga clic en Aspirar y observe cómo la etapa de pipeta mueve los cabezales del dispensador hacia las tazas de muestra.
Verifique la aspiración exitosa de ambas muestras retirando las tazas de muestra y observando una caída en los niveles de líquido. En la pestaña Inspeccionar, envíe cada punta a la cámara de inspección para confirmar la dispensación sin obstáculos. Ajuste la amplitud según sea necesario para que coincida con la formación de gotas de cada punta.
Cargue una rejilla recién limpiada con plasma en las pinzas, pero aún no monte las pinzas. Asegúrese de que el nivel de humedad se eleve a aproximadamente 90 a 95% Llene la taza de etano y realice una prueba final de fuego de ambas puntas frente a la cámara de inspección, confirmando que no hay obstrucción. En la pestaña Cryo, haga clic en Consejo para la cámara.
Compruebe la taza de etano. Si se ha formado hielo de etano, derrita según sea necesario con gas etano adicional. Monte las pinzas con la rejilla en el escenario de la rejilla.
En la pestaña Cryo, haga clic en Grid to Camera, asegurándose de que la punta uno esté colocada correctamente en el monitor superior de la cámara. Haga clic en Cuadrícula vitrificada, Destino de cola y luego En sumergirse. Haga clic en Aceptar cuando se le pida que ordene al robot de rejilla que salte la rejilla del etano al nitrógeno líquido y la suelte en el estante sumergido.
Examine las imágenes de la cuadrícula para decidir si debe conservarse o descartarse. Si mantiene la rejilla, enfríe previamente las forrórceps de punta fina, agarre suavemente la rejilla por el borde y colóquela en una ranura de caja de rejilla, comenzando con la primera ranura a la izquierda de la muesca y yendo en el sentido de las agujas del reloj. Utilice el Visor de experimentos para revisar y comparar las imágenes de cuadrícula de las cámaras superior e inferior junto con la configuración de la máquina y las mediciones de humedad en el momento de la inmersión seleccionando Informes y Experimento.
Aquí se muestran imágenes de cuadrículas preparadas durante una sola sesión de Spotiton resuelta en el tiempo mezclando ARN polimerasa en un oligómero de ADN de par de 105 bases que lleva una secuencia promotora durante 150 milisegundos antes de la vitrificación. De las seis cuadrículas, solo una muestra una absorción subóptima. El patrón de deposición de hielo en una rejilla vitrificada coincide estrechamente con el patrón de líquido depositado que se ve en la imagen superior de la cámara.
La absorción efectiva de las muestras mezcladas ocurre a lo largo de las barras de rejilla cubiertas de nanocables donde la muestra rara vez se desborda en cuadrados adyacentes a aquellos en los que aterrizó. En los cuadrados llenos de hielo, el hielo es típicamente más grueso dentro de los agujeros en el centro del cuadrado y se vuelve más delgado en los agujeros más cercanos a las barras de la rejilla. Los agujeros inmediatamente adyacentes a las barras de la rejilla a menudo están vacíos, debido a la proximidad a los nanocables.
La preparación y el manejo adecuados de las rejillas de nanocables garantizarán un buen espesor de hielo en las rejillas de muestra mixtas. El sistema Spotiton también permite al usuario depositar las dos muestras por separado en una sola rejilla, lo que permite la recolección de un control no mezclado durante la misma sesión de mantenimiento de la red. Spotiton ha permitido la captura de los primeros intermedios en la expresión génica bacteriana en tiempo real.
Debido a que se forman en una escala de tiempo de menos de un segundo, sus estructuras han sido desconocidas hasta ahora.
Visión general
Este estudio presenta un protocolo que utiliza el sistema robótico Spotiton para la mezcla rápida y la vitrificación de proteínas en una rejilla de microscopio electrónico. La técnica captura conformaciones proteicas transitorias que los métodos estándar no pueden, allanando el camino para obtener información sobre procesos biológicos dinámicos.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Interacciones proteicas
- Conformaciones transitorias
- Microscopía crioelectrónica
Antecedentes
- Importancia de estudiar interacciones proteicas rápidas
- Desafíos en la captura de estados transitorios
- Utilidad de la vitrificación en la investigación biológica
Métodos utilizados
- Uso del sistema Spotiton para la mezcla y vitrificación de muestras
- Aplicación involucra proteínas y su socio interactuante en rejillas de nanohilos
- Mezcla de alta velocidad para capturar intermedios
Principales resultados
- Vitrificación exitosa de muestras de proteínas mezcladas en tan solo 90 ms
- Empapamiento eficiente a lo largo de las rejillas de nanohilos asegurando la integridad de la muestra
- Visualización clara de patrones de deposición de hielo correlacionados con los resultados de la mezcla
Conclusiones
- Este estudio demuestra efectivamente la utilidad de Spotiton de resolución temporal para observar procesos biológicos rápidos.
- Los hallazgos mejoran la comprensión de la dinámica y las interacciones de proteínas cruciales para la investigación biológica.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Capturing transient molecular intermediates is a critical challenge in early-stage drug discovery and structural biology. The Spotiton robotic system enables time-resolved cryo-EM grid preparation, allowing R&D teams to interrogate rapid biomolecular interactions and conformational changes with high temporal precision. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of short-lived protein conformations relevant to target engagement.
- Supports mechanistic de-risking by capturing intermediate states in protein-ligand or protein-nucleic acid interactions.
- Facilitates functional target validation by revealing structural transitions on sub-second timescales.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological grids for downstream cryo-EM analysis with minimal sample volume.
- Standardizes grid preparation for reproducible, quantitative structural readouts.
- Enables rapid, scalable grid production to support high-throughput screening of molecular interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural snapshots with disease-relevant mechanisms, informing translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical model validation.
- Reduces ambiguity in structure-based drug design by capturing elusive intermediate states.
Pipeline & Workflow Integration
The Spotiton system integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging mechanistic interrogation with structural validation workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling capture of rapid molecular events and pathway transitions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cryo-EM grids for comparative analysis of compound or biomolecule effects.
- Analytics: Provides high-resolution structural data to inform condition comparisons and mechanistic hypotheses.
- Translational Research: Connects early structural findings to preclinical validation when disease-relevant systems are studied.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for repeated use across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable grid preparation for structural studies.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of discovery assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing transient states critical to biological function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM grid handling and robotic system operation.
- Needs access to Spotiton instrumentation and compatible nanowire EM grids.
- Demands rigorous calibration and cross-team standardization for reproducible results.
- Adaptation may be needed for different biomolecular systems or sample types.
- Grid quality is sensitive to humidity control, dispenser calibration, and sample preparation protocols.
