Name: Sondas de tensión de ADN para mapear las fuerzas transitorias del receptor de piconewton por las células inmunes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprende a preparar sondas de tensión de ADN para mapear fuerzas transitorias de piconewton generadas por células inmunes. Este protocolo utiliza microscopía de fluorescencia convencional para capturar y almacenar eventos mecánicos breves mediante un mecanismo de bloqueo único.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01GM131099 de los NIH, NIH R01GM124472 y NSF CAREER 1350829. Agradecemos a la Instalación de Tetrámeros de los NIH por los ligandos pMHC. Este estudio fue apoyado, en parte, por el Emory Comprehensive Glycomics Core.

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</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Con los procedimientos detallados proporcionados aquí, se pueden preparar sustratos de sonda de tensión de horquilla de ADN para mapear y cuantificar la tensión del receptor producida por las células inmunes. Cuando las células se colocan en el sustrato de la sonda de tensión de horquilla de ADN, aterrizan, se unen y se propagan a medida que los receptores detectan los ligandos tanto química como mecánicamente, el último de los cuales es detectado por nuestras sondas. Sin embargo, en algunos casos las células pueden no p...

Las células inmunes se defienden contra patógenos y células cancerosas rastreando y escaneando continuamente las superficies de las células diana en busca de antígenos, tachonando su superficie 1,2. El reconocimiento de antígenos se inicia tras la unión entre el receptor de células T (TCR) y el complejo MHC del complejo de histocompatibilidad péptido-mayor (pMHC) expresado en la superficie de las células diana. Debido a que el reconocimiento TCR-pMHC ocurre en la unión entre dos células móviles, durante mucho tiempo se ha sospechado que experimenta fuerzas mecánicas. Además, esto condujo al modelo mecanosensor de activación TCR, que sugiere que las fuerzas TCR contribuyen a su función 3,4. Para comprender cuándo, dónde y cómo las fuerzas mecánicas contribuyen a la función de las células T, es imperativo desarrollar herramientas para visualizar las fuerzas moleculares transmitidas por las células T. Tradicionalmente, métodos como la microscopía de fuerza de tracción (TFM) y las matrices de micropilares se utilizan para investigar las fuerzas celulares 5,6. Sin embargo, la sensibilidad a la fuerza de las matrices TFM y micropilares está en la escala nanonewton (nN) y, por lo tanto, a menudo es insuficiente para estudiar las fuerzas moleculares de piconewton (pN) transmitidas por los receptores celulares7. Para mejorar la fuerza y la resolución espacial para la detección, nuestro laboratorio fue pionero en el desarrollo de sondas de tensión molecular, que inicialmente se sintetizaron utilizando polímeros de polietilenglicol (PEG)7. Las sondas de tensión molecular están compuestas por un "resorte" molecular extensible (PEG, proteína, ADN) flanqueado por un fluoróforo y un quencher y están anclados en una superficie. Las fuerzas aplicadas al extremo de la sonda conducen a su extensión, separando el fluoróforo y el exprimidor, generando así una fuerte señal de fluorescencia (Figura 1A)8,9,10.
Durante la última década hemos desarrollado una biblioteca de diferentes clases de sondas de tensión molecular con elementos de resorte hechos de ácidos nucleicos11, proteínas10 y polímeros8. Entre estos, las sondas de tensión basadas en ADN proporcionan la mayor relación señal / ruido y la mayor sensibilidad de fuerza, que se sintoniza fácilmente desde unos pocos pN hasta ~ 20 pN11. Hemos utilizado estas sondas de tensión de ADN en tiempo real para estudiar las fuerzas moleculares generadas por muchos tipos de células diversas, incluidos fibroblastos, células cancerosas, plaquetas y células inmunes11,12,13. Este manuscrito describirá protocolos para sintetizar y ensamblar sondas de tensión de ADN en una superficie para mapear las fuerzas del receptor molecular con resolución de fuerza pN utilizando un microscopio de fluorescencia convencional. Si bien el procedimiento actual incluye modificaciones químicas al ácido nucleico para introducir el reportero fluorescente (Figura 1B), es importante tener en cuenta que muchos de los pasos de modificación y purificación pueden subcontratarse a compañías personalizadas de síntesis de ADN. Por lo tanto, la tecnología de sondas de tensión de ADN es fácil y accesible para las comunidades más amplias de biología celular y mecanobiología.
Brevemente, para ensamblar sensores de tensión de ADN, una horquilla de ADN se hibrida con una hebra de ligando fluorescente en un brazo y una hebra de anclaje de quencher en el otro brazo y luego se inmoviliza en un sustrato de vidrio (Figura 1C, tensión en tiempo real). En ausencia de fuerza mecánica, la horquilla se cierra y, por lo tanto, la fluorescencia se apaga. Sin embargo, cuando la fuerza mecánica aplicada es mayor que F1/2 (la fuerza en equilibrio que conduce a una probabilidad del 50% de despliegue), la horquilla se derrite mecánicamente y se genera una señal fluorescente.
Sobre la base del sensor de tensión de ADN en tiempo real, también describimos protocolos para mapear las fuerzas acumuladas, lo que es particularmente útil para estudiar las interacciones entre los receptores en las células inmunes y su ligando natural. Esto se debe a que los receptores inmunes a menudo muestran enlaces de corta duración 3,14. Las fuerzas acumuladas se visualizan utilizando una hebra de "bloqueo" que se une preferentemente a horquillas de ADN abiertas y permite el almacenamiento de señales de fluorescencia asociadas con eventos de tracción mecánica (Figura 1C, tensión bloqueada). La hebra de bloqueo está diseñada para unir un sitio de unión críptico que se expone al derretir mecánicamente la horquilla inducida mecánicamente y bloquear la horquilla en estado abierto bloqueando el plegado de la horquilla, almacenando así la señal de tensión y generando un mapa de tensión acumulada. Además, la hebra de bloqueo está diseñada con un punto de apoyo de ocho nucleótidos, que permite una reacción de desplazamiento de la hebra mediada por la puntera con su complemento completo, la hebra de "desbloqueo". Con la adición de la hebra de desbloqueo, la hebra de bloqueo atada se quita de la construcción de horquilla, borrando la señal de tensión almacenada y restableciendo la horquilla al estado en tiempo real.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de las sondas de tensión molecular de última generación. (A) Diseño general de sondas de tensión molecular en tiempo real, (B) hebras para la construcción de la sonda de tensión basada en ADN, y (C) sondas de tensión basadas en ADN diseñadas y su alternancia entre el estado en tiempo real y el estado bloqueado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El protocolo principal consta de cuatro secciones principales: preparación de oligonucleótidos, preparación de superficies, imágenes y análisis de datos. Este protocolo ha sido demostrado con éxito por nuestro laboratorio y otros en células T OT-1 CD8 + ingenuas y activadas, células OT-II CD4 +, así como hibridomas, y se puede aplicar para interrogar diferentes receptores de células inmunes, incluidos el receptor de células T, el receptor de muerte celular programada (PD1) y las fuerzas del antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1). Las células T OT-1 CD8 + no naïve se utilizan como una línea celular de ejemplo en este documento.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Ácido 3-hidroxipicolínico (3-HPA)</td><td>Sigma</td><td>56197</td><td>matriz maldi-TOF-MS</td></tr><tr><td>&nbsp; mPEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>MF001023-2K preparación de</td><td>superficie</td></tr> <tr><td>(3-aminopropil)trietoxisilano</td><td>Acros</td><td>AC430941000</td><td>preparación de superficie</td></tr><tr><td>10x Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Biolegend</td><td>00-4333-57</td><td>tampón</td></tr> de <tr><td>8,8 nm nanopartículas de oro, ácido tánico</td><td>Nanocomposix</td><td>pedido personalizado</td><td>preparación</td></tr><tr><td>de superficie Atto647N NHS éster</td><td>Sigma</td><td>18373-1MG-F</td><td>fluoróforo, oligo prep</td></tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber, para microscopía</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>BD Jeringas solo con Luer-Lok</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td>células</td></tr><tr><td>anti-ratón CD3e biotiniladas</td><td>ebioscience</td><td>13-0031-82</td><td>anticuerpo/ligando</td></tr><tr><td>Ovoalbúmina pMHC biotinilada (SIINFEKL)</td><td>Instalación central de tetrámero de los NIH en la Universidad de Emory</td><td>Anticuerpo</td><td>/ligando</td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>735078001</td><td>bloquear interacciones inespecíficas</td></tr><tr><td>Filtros de células</td><td>Biologix</td><td>15-1100</td><td>celdas</td></tr><tr><td>Coverslip Mini-Rack, teflón</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C14784</td><td>preparación de superficie</td></tr><tr><td>Cy3B NHS éster GE</td><td>Healthcare</td><td>PA63101</td><td>fluoróforo, oligo prep</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>tampón</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma</td><td>459836</td><td>preparación</td></tr><tr><td>de superficies Hank' sales equilibradas (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td>tampón</td></tr><tr><td>de peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>preparación de superficie</td></tr><tr><td>LA-PEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>HE039023-3.4K</td><td></td></tr> preparación <tr><td>de superficie Midi MACS (LS) kit de inicio Miltenyi Biotec</td><td>130-042-301</td><td>células</td><td>ratón</td></tr><tr><td>CD8+ kit de aislamiento de células</td><td>T Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td>células</td></tr><tr><td>Dispositivos centrífugos Nanosep MF</td> Laboratorio <td>Pall</td><td></td><td>ODM02C35 preparación de oligonucleótidos</td></tr><tr><td>Nº 2 cubreobjetos de vidrio redondos</td><td>VWR</td><td>48382-085</td><td>preparación de superficie</td></tr><tr><td>NTA-SAM</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>N475-10 preparación de</td><td>superficie</td></tr><tr><td>P2 Gel</td><td>Bio-rad</td><td>1504118</td><td>oligo Preparación</td></tr> de <tr><td>ácido sulfúrico</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>SX1244-6 preparación de</td><td>superficie</td></tr><tr><td>Acetato Sulfo-NHS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26777</td><td></td></tr> preparación <tr><td>de superficieEquipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 columna, 4,6 x 150 mm, 2,7 &m; m</td><td>653950-702</td><td></td><td>preparación de oligonucleótidos</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure sistema de purificación de agua</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>agua</td></tr><tr><td>CFI Apo 100&times; NA 1.49 objetivo</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopía</td></tr><tr><td>Cy5 cubo CHROMA</td><td></td><td></td><td>Microscopía</td></tr><tr><td>evolve dispositivo acoplado de carga multiplicadora de electrones (EMCCD)</td><td>Microscopía</td> <td>fotométrica</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografía líquida de alta resolución</td><td>Preparación de oligonucleótidos</td><td>Agilent 1100</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de epifluorescencia Intensilight</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopía</td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS)Preparación</td> <td>de oligonucleótidos</td> <td>Voyager STR</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis Nanodrop 2000 Preparación</td><td>de oligonucleótidos</td><td>Thermo</td> Fisher <td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Nikon Eclipse Ti</td><td>Microscopía</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de enfoque perfecto Nikon</td><td></td><td></td><td>Microscopía</td></tr><tr><td>Software NIS Elements</td><td>Microscopía Nikon</td><td></td><td>microscopía</td></tr><tr><td>cuatribanda TIRF 405/488/561/647 cubo</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Microscopía</td></tr><tr><td>RICM cubo</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Microscopía</td></tr><tr><td>TIRF lanzador TIRF con microscopía coherente de 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) y 640 nm</td><td></td><td></td><td>Microscopía</td></tr><tr><td>TRITC cubo</td><td>CHROMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td><Nombre >oligo fuerte</Modificación ></td> fuerte<td>><5' / Modificación </secuencia >> fuerte</td><td>< (5' a 3')</fuerte></td><td><fuerte>Uso</fuerte></td></tr><tr><td>15mer hebra de bloqueo de amina</td><td><fuerte>5' modificación:</fuerte> sin modificación <fuerte>3' modificación: </fuerte> /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA bloqueo TA</td><td>señal de tensión en tiempo real</td></tr><tr><td>15mer Atto647N hebra de bloqueo</td> <td><fuerte>5' modificación:</fuerte> Atto647N <fuerte>3' modificación:</fuerte> /3AmMO/</td><td>AAA AAA GATO TTA TAC CCT ACC TA</td> bloqueo de la <td>señal de tensión en tiempo real</td></tr> de <tr><td>15mer hebra de bloqueo no fluorescente de</td> <td>15 mm<fuerte>5' modificación:</fuerte> sin modificación <fuerte>3' modificación:</fuerte> sin modificación</td><td>A AAA AAC ATT TAT AC</td> bloqueo <td>de CA señal de tensión para análisis cuantitativo</td></tr><tr><td>4.7 pN horquilla <fuerte</td><td>>5' modificación:</fuerte> sin modificación <fuerte>3' modificación: </fuerte> sin modificación</td><td>GTGAAATACCGCACAGATGGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCGCACGTAGCC CAGC</td><td>sonda de horquilla</td></tr><tr><td>amina hebra de ligando</td><td><fuerte>5' modificación:</fuerte> /5AmMC6/ <fuerte>3' modificación:</fuerte> /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC Sonda</td><td>de horquilla</td></tr><tr><td>TTT BHQ2</td><td><fuerte>5' modificación:</fuerte> /5ThiolMC6-D/ <fuerte>3' modificación:</fuerte> /3BHQ_2/</td><td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Sonda de horquilla Modificación</td></tr> <tr><td>< >5' del ligando Cy3Bstrong: Cy3B 3' modificación: /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT TTT</td><td>sonda</td><td></td></tr> <tr><td>de horquilla de desbloqueo de la hebra</td><td>5' modificación:</fuerte> sin modificación 3' modificación: </fuerte> sin modificación</td><td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td><td>desbloqueo de la señal de tensión acumulada</td></tr></tbody></table>

sondas de tensión de adn para mapear las fuerzas transitorias del receptor de piconewton por las células inmunes

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Las fuerzas mecánicas transmitidas en la unión entre dos células vecinas y en la unión entre las células y la matriz extracelular son críticas para regular muchos procesos que van desde el desarrollo hasta la inmunología. Por lo tanto, desarrollar las herramientas para estudiar estas fuerzas a escala molecular es fundamental. Nuestro grupo desarrolló un conjunto de sensores de tensión molecular para cuantificar y visualizar las fuerzas generadas por las células y transmitidas a ligandos específicos. La clase más sensible de sensores de tensión molecular se compone de horquillas de bucle madre-bucle de ácido nucleico. Estos sensores utilizan pares fluoróforo-apagador para informar sobre la extensión mecánica y el despliegue de horquillas de ADN bajo fuerza. Un desafío con los sensores de tensión de horquilla de ADN es que son reversibles con un rápido repliegue de horquilla al finalizar la tensión y, por lo tanto, las fuerzas transitorias son difíciles de registrar. En este artículo, describimos los protocolos para preparar sensores de tensión de ADN que pueden "bloquearse" y evitar que se vuelvan a plegar para permitir el "almacenamiento" de información mecánica. Esto permite el registro de fuerzas piconewton altamente transitorias, que posteriormente pueden ser "borradas" mediante la adición de ácidos nucleicos complementarios que eliminan la cerradura. Esta capacidad de alternar entre el mapeo de tensión en tiempo real y el almacenamiento de información mecánica revela fuerzas débiles, de corta duración y menos abundantes, que son comúnmente empleadas por las células T como parte de sus funciones inmunes.

Aquí mostramos imágenes representativas del control de calidad de la superficie (Figura 4). Una superficie de alta calidad debe tener un fondo limpio en el canal RICM (Figura 4B) y una intensidad de fluorescencia uniforme en el canal Cy3B (Figura 4C). Con el mismo equipo de imágenes y condiciones idénticas de adquisición de imágenes de fluorescencia, la intensidad de fluorescencia de fondo debe ser consistente y reproducible cada ve...

Este documento describe un protocolo detallado para usar sondas de tensión basadas en ADN para obtener imágenes de las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunes. Este enfoque puede mapear las fuerzas del receptor >4.7pN en tiempo real y puede integrar fuerzas a lo largo del tiempo.

Sondas de tensión de ADN para mapear las fuerzas transitorias del receptor de piconewton por las células inmunes

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Este protocolo ofrece un método para mapear las fuerzas moleculares generadas por las células y particularmente las células inmunes. El protocolo es crítico para los laboratorios interesados en estudiar la mecanotransducción en mecanobiología. La principal ventaja de esta técnica es que es súper fácil y permite utilizar la microscopía de fluorescencia convencional para cuantificar la transmisión de fuerza en células inmortalizadas y primarias.Para comenzar, coloque cubreobjetos de 25 milímetros en una rejilla de politetrafluoroetileno en un vaso de precipitados de 50 mililitros y enjuague los cubreobjetos tres veces sumergiéndolos en agua. Mezcle volúmenes iguales de etanol y agua y agregue 40 mililitros de esta solución al vaso de precipitados que contiene la rejilla y los cubreobjetos. Luego, selle el vaso de precipitados con cinta de parafilm.Limpie los cubreobjetos sonicando el vaso de precipitados durante 15 minutos en un limpiador ultrasónico y deseche el líquido después de la sonicación. Luego, enjuague el vaso de precipitados que contiene la rejilla y los cubreobjetos con agua al menos seis veces para eliminar cualquier solvente orgánico restante. Para preparar una solución

dna-tension-probes-to-map-transient-piconewton-receptor-forces-immune

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se presentan dos independientes, basados ​​en microscopio de herramientas para medir las deformaciones inducidas nuclear y del citoesqueleto en habitaciones individuales, que viven las células adherentes en respuesta a la aplicación de la tensión global o localizada. Estas técnicas se utilizan para determinar la rigidez nuclear (es decir, la deformabilidad) y para investigar la transmisión de fuerza intracelular entre el núcleo y el citoesqueleto.

Los ensayos biofísicos investigará las propiedades mecánicas del núcleo celular Interfase: Aplicación del sustrato deformación y manipulación de Microneedle

En este video, se utilizan sondas de fuerza de biomembrana (BFP) para medir las fuerzas entre receptores y ligandos. Esta técnica puede detectar interacciones mediante el monitoreo de la presión necesaria para romper los enlaces entre el pMHC conjugado en las perlas de la sonda y los TCR en las celdas objetivo.

Sonda de fuerza de biomembrana para cuantificar las interacciones receptor-ligando

El video muestra un método para evaluar las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunitarias utilizando nanopartículas de oro ancladas en polietilenglicol y sondas de tensión de horquilla de ADN. Las interacciones de los linfocitos T CD8 positivos desencadenan el despliegue de la sonda, emitiendo fluorescencia, mientras que las hebras de bloqueo mantienen la señal para cuantificar las fuerzas aplicadas por las células inmunitarias.

Uso de sondas de tensión basadas en ADN para evaluar las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunitarias

Se midió la liberación de la tensión en un axón que fue parcialmente lesionada con un disector de láser por la medición simultánea de espectroscopia de fuerza se realiza en una sonda ópticamente atrapado adherido a la membrana del axón. El protocolo experimental desarrollado evalúa la adhesión axón al sustrato de cultivo.

Medición de la tensión de salida durante Laser Induced Axon lesión axonal a evaluar la adhesión al sustrato en picoNewton y Millisecond Resolución

Describimos una técnica para medir simultáneamente la cinética de unión a un solo receptor regulado por fuerza e imágenes en tiempo real de la señalización de calcio en un solo linfocito T.

Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

Recientemente se han desarrollado varios biosensores de fuerza basados en FRET, que permiten la resolución de la fuerza intracelular específica de la proteína. En este protocolo, demostramos cómo uno de estos sensores, diseñado para el enlazador de la proteína del complejo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, se puede utilizar para medir las fuerzas de actomiosina en el complejo nuclear LINC.

Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

En este protocolo, se describe un método de la micropipeta para aplicar directamente una fuerza controlada al núcleo en una célula viva. Este ensayo permite interrogatorio de nucleares propiedades mecánicas en la célula viva, adherente.

Un sondeo de la fuerza directa para medir la integración mecánica entre el núcleo y el citoesqueleto

Aquí, presentamos un protocolo para el uso simultáneo de Förster Resonancia Sensores de tensión basado en la transferencia de energía para medir recuperación de carga y de la fluorescencia de la proteína después de photobleaching para medir la dinámica de la proteína que permite la medida de fuerza-sensible dinámica de proteínas dentro de células vivas.

Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Integrina tensión juega un papel importante en diversas funciones celulares. Con un sensor de tensión integradora, integrina tensión es calibrada con sensibilidad picoNewton (pN) y reflejada en la resolución del submicron.

Proyección de imagen integrina tensión y fuerza celular en la resolución del Submicron con un Sensor de tensión integradora

Este protocolo definido describe un enfoque de microscopía de alto rendimiento en tiempo real para visualizar y cuantificar la liberación de trampas extracelulares (NET) de neutrófilos humanos in vitro. El método reproducible permite la investigación de las características y la cinética de la liberación de NET tras la estimulación con distintos inductores de NETosis y permite la evaluación de la farmacología de los antagonistas de NETosis.

Cuantificación microscópica en tiempo real y de alto rendimiento de la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y evaluación de la farmacología de los antagonistas

Este método mide la propensión de una célula a romper dúplex de ADN inmovilizado que presentan ligandos para informar sobre las fuerzas de tracción celular relativas. Los oligonucleótidos fluorescentes rotos se introducen en la célula y se analizan mediante citometría de flujo, registrando la historia mecánica de la célula. Esto permite la medición de alto rendimiento de la generación de fuerza celular en el contexto del mecanofenotipado celular.

Medición de citometría de flujo de alto rendimiento del mecanotipo celular basada en la ruptura y la entrega de sondas de tensión de ADN en las células

Aprende a preparar sondas de tensión de ADN para mapear fuerzas transitorias de piconewton generadas por células inmunes. Este protocolo utiliza microscopía de fluorescencia convencional para capturar y almacenar eventos mecánicos breves mediante un mecanismo de bloqueo único.

Sondas de tensión de ADN para mapear las fuerzas transitorias del receptor de piconewton por las células inmunes

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