Diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas
31 de marzo de 2021
Aquí se presenta un protocolo simple para la diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente 1 semana.
Este protocolo detalla un método para generar una población bien caracterizada de células endoteliales hemogénicas humanas. Estas células se pueden utilizar para estudiar la regulación molecular y la transición endotelial a hematopoyética. Comience cultivando células madre embrionarias humanas durante cuatro días para diferenciarlas en células endoteliales primordiales.
En el día cinco, aspirar el medio por encima de las células. Luego lave suavemente las células con un mililitro de DMEM / F-12 por pocillo. Agregue un mililitro de medio de diferenciación de células endoteliales hemogénicas recién preparado por pocillo e incube las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
En el día seis y el día siete, reemplace el medio por encima de las células con un mililitro de medio de diferenciación de células endoteliales homogéneas recién preparado por pocillo e incube las células durante otras 24 horas. El octavo día. Después de separar y lavar las células, divídalas uniformemente en tubos de microcentrífuga en hielo, cada uno con un mínimo de 600 microlitros de células a una densidad de 1 veces 10 a la 5ª célula por mililitro.
Agregue anticuerpos a los tubos que contienen células según corresponda e incubar en hielo protegido de la luz durante 30 minutos. Granular las células por centrifugación a 1000 veces G y 4 grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en 600 microlitros de tampón de clasificación helada.
Colar las muestras a través de la tapa del filtro de malla de cinco mililitros de tubos FACS y almacenar las células en hielo protegido de la luz para la clasificación inmediata de las células. Para aislar las células endoteliales hemogénicas mediante FACS, primero se debe bloquear la población de células CD45 negativas. Luego, dentro de la población CD45 negativa, compuerta las células CD31 positivas.
A continuación, dentro de la población CD31 positiva, la puerta para la población de células VE-cadherina negativa. Y luego, dentro de la población VE-cadherina negativa, puerta para las células c-Kit-positivas. De la población c-Kit-positiva, puerta la población de células CD34-positivas.
Y finalmente, de la población de células CD34 positivas, identificar y recolectar las células KDR positivas. Después de sembrar células endoteliales hemogénicas en un medio a base de metilcelulosa formulado para el crecimiento de células progenitoras hematopoyéticas, las colonias eritroides unitarias formadoras de colonias y las colonias eritroides unitarias formadoras de explosiones se cuentan el día ocho. Unidad formadora de colonias-granulocitos-macrófagos y unidad formadora de colonias-granulocito, eritroide, macrófago y megacariocitos.
Las colonias progenitoras hematopoyéticas multipotentes se cuentan el día 14. Por cada 1000 células endoteliales hemogénicas plateadas, se generan aproximadamente 20 unidades formadoras de colonias. Las células con morfología de células endoteliales también son visibles en los cultivos.
Estas son las células endoteliales hemogénicas que dan lugar a progenitores hematopoyéticos multilinaje a nivel unicelular. Este protocolo es un sistema de cultivo sin suero 2D y alimentador murino que puede generar células endoteliales hemogénicas humanas en aproximadamente una semana.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo detallado para obtener células endoteliales hemogénicas a partir de células madre embrionarias humanas en aproximadamente una semana. El método permite a los investigadores generar una población bien caracterizada de estas células, que son cruciales para estudiar la transición de endotelial a hematopoyética y que tienen aplicaciones potenciales en medicina regenerativa y en la generación de productos sanguíneos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de células madre
- Biología vascular
- Hematopoyesis
- Ingeniería de tejidos
Antecedentes
- Los vasos sanguíneos son esenciales para la función de los tejidos y están revestidos por células endoteliales vasculares.
- Las células endoteliales hemogénicas son un subtipo especializado que da origen a células madre y progenitoras hematopoyéticas durante el desarrollo.
- Generar estas células in vitro es valioso para estudiar el desarrollo de las células sanguíneas y para aplicaciones terapéuticas potenciales.
- Los protocolos existentes para la obtención de células endoteliales no producen células endoteliales hemogénicas bien caracterizadas a partir de células madre humanas.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo reproducible para generar células endoteliales hemogénicas a partir de células madre embrionarias humanas.
- Permitir el estudio de la regulación molecular y la transición endotelial a hematopoyética in vitro.
- Proporcionar un sistema libre de células alimentadoras y libre de suero adecuado para aplicaciones posteriores.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células madre embrionarias humanas y diferenciación escalonada durante ocho días.
- Inducción de las líneas mesodérmica y endotelial mediante factores de crecimiento específicos y moléculas pequeñas (por ejemplo, inhibidor de GSK3β, bFGF, BMP4, VEGF-A, ácido retinoico).
- Citometría de flujo (FACS) para la selección secuencial y aislamiento de células endoteliales hemogénicas según marcadores de superficie (CD45-, CD31+, VE-cadherina-, c-Kit+, CD34+, KDR+).
- Evaluación funcional mediante ensayos de formación de colonias en medio basado en metilcelulosa para determinar el potencial hematopoyético.
Resultados principales
- El protocolo produce una población definida de células endoteliales hemogénicas en una semana.
- Se generan aproximadamente 20 unidades formadoras de colonias por cada 1000 células endoteliales hemogénicas, lo que indica un potencial hematopoyético robusto.
- Se observan colonias de progenitores hematopoyéticos tanto eritroides como multipotentes.
- La morfología de las células endoteliales se mantiene en cultivo, confirmando la identidad celular.
Conclusiones
- Este protocolo sin suero ni células alimentadoras genera eficientemente células endoteliales hemogénicas humanas a partir de células madre embrionarias.
- El método facilita estudios in vitro de la transición endotelial a hematopoyética y su regulación molecular.
- Proporciona una plataforma para la posible generación ex vivo de productos sanguíneos y reduce la dependencia de donantes humanos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas a partir de células madre pluripotentes humanas aborda un cuello de botella crítico en la modelización del desarrollo hematopoyético y en la generación de linajes sanguíneos ex vivo. Esta capacidad permite reducir de forma mecanicista los riesgos asociados a la transición de endotelial a hematopoyética y respalda la confianza predictiva en las fases iniciales de las líneas de desarrollo de terapias celulares y medicina regenerativa. El diseño del protocolo, libre de células alimentadoras y suero, mejora la reproducibilidad y escalabilidad para carteras empresariales de I+D.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación de las vías moleculares que regulan la transición de endotelial a hematopoyética.
- Apoya la validación funcional de objetivos dirigidos a factores que influyen en la especificación de la línea sanguínea.
- Facilita la desestimación predictiva de objetivos candidatos en el desarrollo hematopoyético.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona una población celular estandarizada y bien caracterizada para ensayos funcionales posteriores.
- Permite la evaluación cuantitativa de la formación de colonias hematopoyéticas a partir de progenitores definidos.
- Facilita el cribado reproducible de moduladores que afectan el destino endotelial o hematopoyético.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Establece una plataforma para modelar defectos hematopoyéticos relevantes para enfermedades in vitro.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de estrategias de generación de células sanguíneas.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de conceptos terapéuticos basados en células.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este protocolo se integra en la continuación de descubrimiento a preclínico al permitir la generación y aislamiento robustos de células endoteliales hemogénicas para estudios mecanicistas y ensayos funcionales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la regulación molecular de la emergencia de linajes sanguíneos.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles de formación de colonias para análisis comparativo.
- Análisis: Ofrece cuantificación de colonias y estrategias de selección basadas en citometría de flujo para lecturas objetivas.
- Investigación Traslacional: Conecta la modelización in vitro con la evaluación preclínica del potencial hematopoyético.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un sistema escalable y sin células alimentadoras, adaptable a distintas líneas de células madre y modelos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la modelización de linajes hematopoyéticos y en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los flujos de trabajo de diferenciación celular.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción en programas de terapia celular y medicina regenerativa.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos celulares en etapas iniciales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el cultivo de células madre pluripotentes humanas y protocolos de diferenciación.
- Exige acceso a instrumentación de citometría de flujo para ordenación celular multiparamétrica.
- Necesita la estandarización entre equipos de las estrategias de selección de eventos (gating) y la cuantificación de colonias.
- Adaptable a diversas líneas de células madre humanas mediante la optimización del protocolo.
- Dependiente de paneles de anticuerpos validados y ensayos funcionales basados en metilcelulosa.
