Name: Diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 23 s
Description: Aprende a diferenciar células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente una semana. Este protocolo sin suero ni alimentadores permite estudiar la transición endotelial-hematopoyética y generar productos sanguíneos.

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Este trabajo fue parcialmente apoyado por las subvenciones de los NIH HL128064 y U2EB017103. El apoyo adicional fue proporcionado por CT Innovations 15-RMB-YALE-04 subvención.

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El autor no tiene nada que revelar.

En este documento, se describen los pasos para producir células endoteliales hemogénicas a partir de células madre embrionarias humanas en aproximadamente 1 semana utilizando un sistema de cultivo 2D sin alimentador murino y suero (Figura 1). Este protocolo amplía un método descrito por Sriram et al. (2015) para obtener CE primordiales38. La naturaleza primordial y el potencial de especificación de los CD31+ CD45- EC se demuestra cultivando estas...

Las células endoteliales (CE) son una población heterogénea de células que realizan múltiples funciones en todo el cuerpo humano y en tejidos diseñados. Además de apoyar y regular otros tipos de células (es decir, cardiomiocitos1, células osteoblásticas,2), estas funciones incluyen formar una barrera selectiva entre la sangre y los tejidos y ayudar en la formación de tejidos3. La diferenciación de CE maduras durante el desarrollo normal requiere diversas vías de señalización. Las CE primordiales se derivan de progenitores del mesodermo, y luego se especifican hacia fenotipos arteriales, venosos, capilares y linfáticos maduros4. Además, también se especifica que un pequeño subconjunto de CE en el saco vitelino extraembrionario y la región embrionaria de Aorta-Gónada-Meonefros (AGM) se conviertan en CE hemogénicas, que dan lugar a células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) que migran al hígado fetal y a la médula ósea fetal, donde permanecen postnatalmente y generan todos los tipos de células sanguíneas a lo largo de la vida4. La amplia gama de fenotipos EC es esencial para todo el desarrollo y mantenimiento de los tejidos.
Por lo tanto, las CE y sus derivados son componentes críticos de estudios dirigidos a modelar y dilucidar mecanismos de desarrollo humano y/o enfermedad, así como aplicaciones de medicina regenerativa e ingeniería de tejidos 5,6,7,8. Sin embargo, la principal limitación para este tipo de estudios es la falta de disponibilidad de CE humanas primarias en la cantidad requerida. Se ha estimado que se requeriría un mínimo de 3 x 108 CE para la mayoría de las aplicaciones terapéuticas6. Para resolver este problema, se ha propuesto el uso de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) debido a su diverso potencial de linaje y su capacidad para generar un gran número de progenie 6,9.
De hecho, la utilidad de las células derivadas de hESCs o hiPSCs ha sido demostrada en múltiples estudios centrados en el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos10,11,12. La tecnología Organ-on-a-Chip (OOC) se ha utilizado para recapitular más fielmente la fisiología del cuerpo humano mediante la integración de células y tejidos en andamios tridimensionales. Además, la conexión de múltiples OOC individuales (un llamado cuerpo o humano en un chip, BOC / HOC) se puede lograr a través de microfluídica para permitir la diafonía entre los órganos de interés13,14,15. Los tejidos de soporte, como la vasculatura, son componentes críticos de OOC y BOC / HOC; La incorporación de vasculatura permite el transporte de nutrientes, oxígeno y factores paracrinos a través de los tejidos, promoviendo así el microambiente específico del tejido requerido 3,12. Por lo tanto, los métodos para derivar CE humanas maduras, como las CE arteriales, venosas, linfáticas y hemogénicas, son cruciales para avanzar en estos enfoques de ingeniería de tejidos.
Se han publicado múltiples protocolos que detallan los pasos para la derivación de CE humanas primordiales o progenitoras de hESCs o hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Muchos de estos protocolos se basan en la formación del cuerpo embrioide (EB) o en el cocultivo de ESCs/iPSCs con una capa de alimentación murina de células del estroma. Estas estrategias tienden a ser difíciles y requieren mucho tiempo, con bajos rendimientos de EC y / o contaminación de EC humanas con células murinas. Los protocolos que se basan estrictamente en el cultivo 2D sin el uso de células estromales a menudo requieren inducciones largas, utilizan combinaciones complejas de factores de crecimiento y / o inhibidores para la inducción, tienen períodos de expansión prolongados después de la separación celular o una combinación de estos factores. El avance del conocimiento de las vías de señalización y los factores involucrados en la derivación de tipos maduros de EC in vivo proporciona la base para un protocolo de diferenciación in vitro sencillo y sólido.
Anteriormente, se identificaron roles clave para las vías de señalización de Notch y Ácido Retinoico (AR) en la especificación de CE arteriales murinas y hemogénicas, respectivamente, durante el desarrollo. La vía de señalización de Notch desempeña múltiples funciones en la especificación y el mantenimiento del fenotipo arterial de la CE. El trabajo que utilizó el modelo de vascularización retiniana murina identificó una vía en la que el esfuerzo cortante del líquido induce un eje de señalización Notch-Cx37-p27, promoviendo la detención del ciclo celular G1, lo que permite la especificación arterialde EC 27. Se ha planteado la hipótesis de que los estados del ciclo celular desempeñan un papel en las decisiones sobre el destino celular al proporcionar distintas ventanas de oportunidad en las que las células son receptivas a ciertas señales que pueden inducir la expresión génica y cambios fenotípicos28. Esta detención G1 mediada por Notch permitió la expresión de genes enriquecidos en CE arteriales, incluyendo ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 y Notch 4 (revisado en29,30). También se ha demostrado que la especificación hemogénica de EC se promueve in vivo a través de la señalización de AR31,32. Estudios adicionales identificaron que, aguas abajo de la señalización de AR, la expresión de c-Kit y Notch regula al alza p27, lo que permite la especificación hemogénica en el saco vitelino murino y AGM33. Las CE hemogénicas murinas pueden identificarse mínimamente por la expresión de marcadores endoteliales (es decir, CD31, KDR) y hematopoyéticos (es decir, c-Kit, CD34)4. Finalmente, las CE hemogénicas experimentan una transición endotelial-hematopoyética (EHT) para formar HSPC, que pueden dar lugar a todos los tipos de células sanguíneas 4,34,35.
Trabajos recientes probaron si esta misma jerarquía de señalización puede promover la especificación de EC hemogénica humana. Para ello, se desarrolló un protocolo de cultivo 2D sin suero y alimentador para derivar CE hemogénicas a partir de hESCs, y estas CE hemogénicas se caracterizaron a nivel de una sola célula como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-. Este estudio también aprovechó el reportero Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), que identifica diferentes estados del ciclo celular, utilizando H9-hESCs que expresan el constructo del reportero FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. En estudios con estas células, se demostró que la AR promueve la detención temprana del ciclo celular G1 en las CE, y el estado temprano G1 permite la especificación hemogénica in vitro37. En este documento, se proporciona un protocolo detallado para la diferenciación de estas células endoteliales hemogénicas humanas y ensayos que confirman su identidad. Este método sencillo proporciona un medio útil para generar este subconjunto especializado de CE para futuros estudios de los mecanismos del desarrollo de las células sanguíneas humanas.

<table><tbody><tr><td>Placas de 15 cm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>tratamiento con cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Placas de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>tratamiento con cultivo</td></tr><tr>de tejidos Placas<td>de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>tratamiento con cultivo</td></tr><tr><td>de tejidos Reactivo antimicrobiano Marca: Normocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& Sistemas D</td><td>233-FB-025</td><td>uso a 50 ng/mL</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>BioLegend</td><td>595202</td><td>uso a 25 ng/mL</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Cell Detatchment Solution Marca: Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DLL4</td><td>R& D sistemas</td><td>1506-D4/CF</td><td>humano recombinante; uso a 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco</td><td></td><td>< 14190144</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células endotelialesbr/> Marca: EGM-2 Endotelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)</td><td>Tubos Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td> Fondo <td>redondo de poliestireno 352235 Corning con tapa</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de filtroSuero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>uso a 4 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>GSK3i/CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td>10 mM de culata; uso a 5 &mu; M</td></tr><tr><td>Hanks Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Proteína de matriz&nbsp; Marca: Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Factor de crecimiento reducido. Consulte el Certificado de análisis del lote para determinar la concentración de proteína (Matrigel). Esta concentración es necesaria para calcular el volumen de Matrigel que contiene 1 mg de proteína.</td></tr><tr><td>Medio a base de metilcelulosa Marca: MethoCult H4435 Tecnologías</td> de <td>células madre</td> enriquecidas <td>4435</td><td></td></tr><tr><td>Medio de diferenciación de células madre pluripotentes Nombre de la marca: STEMdiff APEL 2</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>5270</td><td></td></tr><tr><td>Células madre pluripotentes: H1, H9, H9-FUCCI</td><td>WiCell</td><td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td><td>humano; H9-FUCCI se obtuvieron del laboratorio del Dr. Ludovic Vallier en el Instituto de Células Madre de Cambridge</td></tr><tr><td>Medio de hibridomas sin proteínas (PFMH)</td><td>Gibco</td><td>12040077</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50 mg</td><td>uso a 0,5 &mu; M</td></tr><tr><td>Transcripción inversa master mix Marca: iScript Transcripción inversa Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>kit de extracción de ARN Marca: RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células madre Marca: mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Mezcla maestra verde Marca: iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td><td>BioRad</td><td>1725121</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25299956</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>VEGF165 (VEGF-A)</td><td>PeproTech</td><td>100-20</td><td>uso a 50 ng/mL</td></tr><tr><td>&alpha;-CD31-FITC</td><td>BioLegend</td><td>303104</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-CD34-Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>343512</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-CD45-APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>304014</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-c-Kit-APC</td><td>BioLegend</td><td>313206</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-Flk-1-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>359911</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-VE-Cadherin-PE</td><td>BioLegend</td><td>348506</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>* Los conjugados fluorescentes de anticuerpos deben optimizarse en función del clasificador de células utilizado. A continuación se presentan las concentraciones finales utilizadas en este estudio.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Los vasos sanguíneos están distribuidos ubicuamente dentro de todos los tejidos del cuerpo y realizan diversas funciones. Por lo tanto, la derivación de células endoteliales vasculares maduras, que recubren los lúmenes de los vasos sanguíneos, a partir de células madre pluripotentes humanas es crucial para una multitud de aplicaciones de ingeniería y regeneración de tejidos. In vivo, las células endoteliales primordiales se derivan del linaje mesodérmico y se especifican hacia subtipos específicos, incluidos arteriales, venosos, capilares, hemogénicos y linfáticos. Las células endoteliales hemogénicas son de particular interés porque, durante el desarrollo, dan lugar a células madre y progenitoras hematopoyéticas, que luego generan todos los linajes sanguíneos a lo largo de la vida. Por lo tanto, la creación de un sistema para generar células endoteliales hemogénicas in vitro proporcionaría una oportunidad para estudiar la transición endotelial a hematopoyética, y puede conducir a la producción ex vivo de productos sanguíneos humanos y una menor dependencia de donantes humanos. Si bien existen varios protocolos para la derivación de células endoteliales progenitoras y primordiales, no se ha descrito la generación de células endoteliales hemogénicas bien caracterizadas a partir de células madre humanas. Aquí, se presenta un método para la derivación de células endoteliales hemogénicas a partir de células madre embrionarias humanas en aproximadamente 1 semana: un protocolo de diferenciación con células de raya primitivas formadas en respuesta al inhibidor de GSK3β (CHIR99021), luego inducción de linaje de mesodermo mediada por bFGF, seguida de desarrollo de células endoteliales primordiales promovidas por BMP4 y VEGF-A, y finalmente especificación de células endoteliales hemogénicas inducida por ácido retinoico. Este protocolo produce una población bien definida de células endoteliales hemogénicas que se pueden utilizar para comprender mejor su regulación molecular y la transición endotelial a hematopoyética, que tiene el potencial de aplicarse a aplicaciones terapéuticas posteriores.

En la Figura 1 se muestra un esquema que describe la especificación de las CE primordiales y las CE hemogénicas de las hESCs, y una imagen representativa de las células 24 h después del recubrimiento. Después de la especificación, los CE primordiales y los CE hemogénicos se purifican con FACS en los días 5 y 8, respectivamente. Las CE primordiales se definen como CD31+ CD45- y las CE hemogénicas se definen como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherina-...

Aquí se presenta un protocolo simple para la diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente 1 semana.

Diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Este protocolo detalla un método para generar una población bien caracterizada de células endoteliales hemogénicas humanas. Estas células se pueden utilizar para estudiar la regulación molecular y la transición endotelial a hematopoyética. Comience cultivando células madre embrionarias humanas durante cuatro días para diferenciarlas en células endoteliales primordiales.En el día cinco, aspirar el medio por encima de las células. Luego lave suavemente las células con un mililitro de DMEM / F-12 por pocillo. Agregue un mililitro de medio de diferenciación de células endoteliales hemogénicas recién preparado por pocillo e incube las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.En el día seis y el día siete, reemplace el medio por encima de las células con un mililitro de medio de diferenciación de células endoteliales homogéneas recién preparado por pocillo e incube las células durante otras 24 horas. El octavo día. Después de separar y lavar las células, divídalas uniformemente en tubos de microcentrífuga en hielo, cada uno con un mínimo de 600 microlitros de células a una densidad de 1 veces 10 a la 5ª célula por mililitro.Agregue anticuerpos a los tubos que contienen células según corresponda e incubar en hielo protegido de la luz durante 30 minutos. Granular las células por centrifugación a 1000 veces G y 4 grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en 600 microlitros de tampón de clasificación helada.Colar las muestras a través de la tapa del filtro de malla de cinco mililitros de tubos FACS y almacenar las células en hielo protegido de la luz para la clasificación inmediata de las células. Para aislar las células endoteliales hemogénicas mediante FACS, primero se debe bloquear la población de células CD45 negativas. Luego, dentro de la población CD45 negativa, compuerta las células CD31 positivas.A continuación, dentro de la población CD31 positiva, la puerta para la población de células VE-cadherina negativa. Y luego, dentro de la población VE-cadherina negativa, puerta para las células c-Kit-positivas. De la población c-Kit-positiva, puerta la población de células CD34-positivas.Y finalmente, de la población de células CD34 positivas, identificar y recolectar las células KDR positivas. Después de sembrar células endoteliales hemogénicas en un medio a base de metilcelulosa formulado para el crecimiento de células progenitoras hematopoyéticas, las colonias eritroides unitarias formadoras de colonias y las colonias eritroides unitarias formadoras de explosiones se cuentan el día ocho. Unidad formadora de colonias-granulocitos-macrófagos y unidad formadora de colonias-granulocito, eritroide, macrófago y megacariocitos.Las colonias progenitoras hematopoyéticas multipotentes se cuentan el día 14. Por cada 1000 células endoteliales hemogénicas plateadas, se generan aproximadamente 20 unidades formadoras de colonias. Las células con morfología de células endoteliales también son visibles en los cultivos.Estas son las células endoteliales hemogénicas que dan lugar a progenitores hematopoyéticos multilinaje a nivel unicelular. Este protocolo es un sistema de cultivo sin suero 2D y alimentador murino que puede generar células endoteliales hemogénicas humanas en aproximadamente una semana.

directed-differentiation-hemogenic-endothelial-cells-from-human

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Generación de linfocitos T de madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células da un enfoque alternativo de la utilización de células madre embrionarias para células T basada en la inmunoterapia. El método muestra que mediante la utilización de...

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El objetivo de este artículo es proporcionar un enfoque estandarizado para inducir la diferenciación de progenitores hepáticos humanos a partir de células madre pluripotentes. El desarrollo de este procedimiento con formulaciones de medios listas para usar ofrece al usuario un sistema fácil para generar células hepáticas humanas para la investigación biomédica y la traducción.

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Aprende a diferenciar células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente una semana. Este protocolo sin suero ni alimentadores permite estudiar la transición endotelial-hematopoyética y generar productos sanguíneos.

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