Name: In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Aprende a analizar la actividad de ligasas E3 ubiquitina in vitro para estudiar la cooperación E2-E3 y la especificidad de sustratos. Estos protocolos permiten evaluar la función catalítica de ligasas E3 usando proteínas recombinantes de cualquier fuente eucariota.

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Agradecemos a los miembros de nuestro laboratorio por la discusión crítica y los consejos útiles sobre el manuscrito. Nos disculpamos por no haber citado contribuciones valiosas debido a la limitación de tamaño. Este trabajo cuenta con el apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 y Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD a TH. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania - EXC 2030 - 390661388 y - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 a T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.

1. Preparación de tampones y reactivos
NOTA: Los tampones y reactivos que se prepararon manualmente en el laboratorio se enumeran a continuación. Todos los demás tampones y reactivos utilizados en los protocolos se compraron de diferentes fuentes y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
<ol><li>Prepare 10x solución salina tamponada con fosfato (10x PBS). Para este propósito, mezcle 1.37 M de cloruro de sodio (NaCl), 27 mM de cloruro de potasio (KCl), 80 mM de dihidrato de hidrógeno-fosfato disódico (Na2HPO4.2H2O) y 20 mM de fosfato de potasio-dihidrógeno (KH2PO4) en 1 L de H2O de doble destilación (ddH2O). Autoclave el PBS 10x y prepare una solución de PBS 1x en ddH2O.<ol>
<li>El autoclave se realiza durante 15 min a 121 °C y 98,9 kPa. NOTA: El autoclave se lleva a cabo en estas condiciones para todos los búferes y soluciones. Si no se indica lo contrario, las soluciones se almacenan a temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 1 L de solución PBS-Tween (PBS-T) agregando 0.1% Tween a 1 L de 1x PBS.</li>
	<li>Preparar 10 ml de una solución madre de L-lisina de 0,5 M disolviendo L-lisina en ddH2O. Alícuota de L-lisina en porciones de 1 ml, y almacenarlas a -20 °C hasta su uso posterior. NOTA: La L-lisina se puede congelar y descongelar repetidamente.</li>
	<li>Preparar una solución de ácido tetra acético (EDTA) de etileno diamina de 0,25 M disolviendo EDTA en 200 mL de ddH2O.<ol>
<li>Ajuste el pH a 8.0 con hidróxido de sodio (NaOH).</li>
		<li>Ajuste el volumen a 250 ml con ddH2O.</li>
		<li>Autoclave la solución.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 10 ml de una solución de albúmina sérica bovina (BSA) de 20 mg/ml disolviendo BSA en ddH2O. Conservar a -20 °C en alícuotas de 200 μL. NOTA: BSA se puede congelar y descongelar repetidamente.</li>
	<li>Prepare 1 L de ácido 2-(N-morfolino)etano sulfónico (MES) ejecutando tampón disolviendo 50 mM MES, 50 mM base Tris, 3.47 mM dodecil sulfato de sodio (SDS) y 1.03 mM EDTA en 0.9 L de ddH2O. Después de mezclar correctamente, ajuste el volumen a 1 L.<ol>
<li>El pH del tampón 1x es 7.6. No ajuste el pH con ácido o base.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 200 ml de solución bloqueadora (5% de leche) disolviendo 10 g de leche en polvo en 1x PBS-T. Guarde la solución de bloqueo a 4 °C durante un máximo de una semana.</li>
	<li>Prepare 1 L de tampón de transferencia (consulte la Tabla de materiales) deacuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Prepare 2x tampón de muestra SDS disolviendo 125 mM de base Tris, 4% SDS, 4% de glicerol, 0.03% de azul de bromofenol y 50 μL / ml de β-mercaptoetanol en 50 mL ddH2O. Alícuota en porciones de 1 ml y guárdela a -20 ° C hasta su uso.</li>
</ol>2. Ensayo de auto-ubiquitilación in vitro
<ol><li>Preparación y ejecución de ensayos<ol>
<li>Calcule el volumen de cada reactivo requerido por reacción en función de las molaridades dadas de las proteínas y las concentraciones de proteínas de las soluciones proteicas. Por reacción de auto-ubiquitilación, use 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 y 50 μM Ub. Ajuste el volumen de la reacción a 20 μL con ddH2O. NOTA: La solución de ATP y el búfer de ubiquitilación se compraron como soluciones de stock 10x y se utilizaron a 1x.</li>
		<li>Prepare un esquema de pipeteo para todas las reacciones. Pruebe nueve enzimas E2 diferentes para determinar su capacidad para funcionar (I) con CHIP, (II) con un mutante CHIP (H260Q) catalíticamente inactivo y (III) sin CHIP en reacciones de ubiquitilación individuales.</li>
		<li>Para evitar errores de pipeteo, prepare una mezcla maestra sobre hielo que contenga el volumen requerido para todas las reacciones más una reacción adicional. Calcule la cantidad de mezcla maestra requerida por reacción. NOTA: Los componentes de la mezcla maestra son reactivos que son igualmente necesarios para cada reacción, es decir,E1, E3, Ub, ATP y tampón de ubiquitilación.</li>
		<li>Agregue ddH2O y mezcla maestra a los tubos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mantenga los tubos en hielo.</li>
		<li>Antes de iniciar las reacciones de ubiquitilación añadiendo las enzimas E2, configure un termociclador pcr con el siguiente programa: 2 h, 37 °C seguido de 4 °C, infinitamente.</li>
		<li>Añadir 1 μM de las enzimas E2 en los tubos respectivos, e incubar las muestras en el termociclador de PCR durante el período de tiempo indicado.</li>
		<li>Después de 2 h, agregue el búfer de muestra SDS a cada reacción y mezcle canalizando hacia arriba y hacia abajo varias veces. NOTA: El volumen requerido del tampón de muestra depende de la concentración de existencias del tampón de muestra. Aquí, se agregaron 20 μL de tampón de muestra SDS 2x a cada reacción.</li>
		<li>Hervir las muestras inmediatamente a 95 °C durante 5 min, y continuar con la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Conservar las proteínas desnaturalizadas a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Electroforesis en gel y western blot<ol>
<li>Después de la descongelación, gire las muestras durante aproximadamente 10 s y cargue el gel SDS-PAGE. Utilice una escalera de proteínas como referencia de tamaño. NOTA: Aquí, se utilizaron geles de gradiente Bis-Tris al 4-12% y 3 μL de escalera de proteínas. Divida los volúmenes de muestra y cargue dos geles por igual utilizando 20 μL de cada muestra.</li>
		<li>Ejecute el gel a 160-200 V durante aproximadamente 30-45 minutos para que el frente de la muestra llegue a la parte inferior del gel.</li>
		<li>Transfiera cada gel a un recipiente de plástico lleno de tampón secante semiseco e incube durante 2-5 minutos en RT. Retire el gel de apilamiento.</li>
		<li>Prepare dos trozos de papel secante del tamaño de un gel y una membrana de nitrocelulosa del tamaño de un gel por gel SDS y sumérjalo previamente en un tampón de secado semiseco. Ensamble el sándwich western blot (WB) en una cámara WB de abajo hacia arriba en el siguiente orden: papel secante, membrana de nitrocelulosa, gel SDS-PAGE, papel secante.</li>
		<li>Retire las burbujas de aire que puedan haber quedado atrapadas entre las capas sándwich. Para este propósito, use un rodillo para enrollar cuidadosamente el sándwich varias veces.</li>
		<li>Cierre la cámara y permita que el exceso de amortiguación de manchas se drene.</li>
		<li>Coloque la cámara en el dispositivo de borrado respectivo y use el siguiente programa para el borrado semiseco: 25 V, 1.0 A, 30 min.</li>
		<li>Transfiera la membrana filtrada a un recipiente de plástico lleno de solución de bloqueo e incube durante 30 minutos en RT.</li>
		<li>Prepare la solución primaria de anticuerpos agregando el anticuerpo a 10 ml de PBS-T que contenga un reactivo bloqueador (consulte la Tabla de materiales). NOTA: La concentración de trabajo del anticuerpo es específica del anticuerpo. En este caso, se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-ubiquitina de ratón a una dilución de 1:5.000. Para el segundo gel, se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-CHIP de conejo a 1:5.000 en PBS-T/reactivo bloqueador.</li>
		<li>Reemplace la solución de bloqueo con la solución de anticuerpos primarios e incube durante la noche a 4 ° C en un balancín.</li>
		<li>Lave la membrana tres veces durante 10 min con PBS-T.</li>
		<li>Prepare la solución secundaria de anticuerpos agregando el anticuerpo respectivo a 10 ml de PBS-T. NOTA: Aquí, los anticuerpos anti-ratón de cabra y anti-conejo de ratón se utilizan en una dilución de 1:10.000.</li>
		<li>Incubar la membrana con el anticuerpo secundario durante 1 h a RT en un balancín.</li>
		<li>Lave la membrana tres veces durante 5 min con PBS-T.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de datos<ol>
<li>Agregue reactivos de detección de western blot para anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) a la membrana lavada de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y capture la señal HRP mediante el uso de películas de rayos X o una cámara de dispositivo de carga acoplada(Figura 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ensayo de ubiquitilación de sustrato in vitro
<ol><li>Preparación y ejecución de ensayos<ol>
<li>Calcule el volumen de cada reactivo requerido por reacción, basado en las molaridades dadas de las proteínas y las concentraciones de proteínas de las soluciones proteicas. Por reacción de ubiquitilación del sustrato, utilice 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM de sustrato y 50 μM Ub. Use 10x solución de ATP y 10x buffer de ubiquitilación a 1x. Ajuste el volumen de la reacción de ubiquitilación del sustrato a 20 μL con ddH2O.</li>
		<li>Prepare un esquema de pipeteo para todas las reacciones. Incluya reacciones de control adecuadas que verifiquen que la ubiquitilación del sustrato es específica de E3. Utilice la proteína UNC-45B como sustrato representativo de CHIP y un mutante CHIP catalíticamente inactivo (H260Q) como control. Prepare las siguientes reacciones: E1, E2, ub mix (incluyendo Ub, ATP, tampón de ubiquitilación); E1, E2, Ub mix, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP(H260Q), UNC-45B; y E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.</li>
		<li>Para evitar errores de pipeteo, prepare una mezcla maestra sobre hielo que contenga el volumen requerido para todas las reacciones más una reacción adicional. Calcule el volumen de la mezcla maestra que se requiere por reacción. NOTA: Los componentes maestros de la mezcla para este ensayo incluyen E1, E2, Ub, ATP y tampón de ubiquitilación.</li>
		<li>Agregue componentes de reacción en el siguiente orden: ddH2O, sustrato, ligasa E3.</li>
		<li>Antes de comenzar la reacción de ubiquitilación mediante la adición de la mezcla maestra, configure un termociclador de PCR con el siguiente programa: 2 h, 37 ° C seguido de 4 ° C, infinitamente.</li>
		<li>Añadir la mezcla maestra a cada tubo, e incubar las muestras en el termociclador PCR durante el periodo de tiempo indicado.</li>
		<li>Después de 2 h, agregue 2x tampón de muestra SDS a cada reacción y mezcle canalizando hacia arriba y hacia abajo varias veces.</li>
		<li>Después de la ejecución, hierva las muestras inmediatamente a 95 °C durante 5 min, y continúe con PAGE. Alternativamente, almacene las proteínas desnaturalizadas a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Electroforesis en gel y western blot<ol>
<li>Realizar electroforesis en gel y western blot como se describe en la sección 2.2. Utilizar anticuerpos específicos para la detección del sustrato y de la ligasa E3, respectivamente. NOTA: Aquí, UNC-45B se fusiona con una etiqueta de proteína polipeptídica derivada del producto del gen c-myc que permite el uso de un anticuerpo monoclonal anti-MYC de ratón. Anti-MYC se utiliza a 1:10.000.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis de datos<ol>
<li>Realizar el análisis de los datos como se describe en la sección 2.3 (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ensayo de descarga de lisina
<ol><li>Preparación y ejecución de ensayos<ol><li>Carga de la enzima E2 con Ub por E1<ol>
<li>Calcule el volumen de cada reactivo requerido por reacción en función de las molaridades dadas de las proteínas y las concentraciones de proteínas de las soluciones proteicas. Por reacción de carga, use 2 μM E1, 4 μM E2 y 4 μM de ubiquitina libre de lisina (Ub K0). Use 10x ATP y 10x buffer de ubiquitilación a 1x. Ajuste el volumen de la reacción de carga a 20 μL con ddH20. NOTA: El mutante Ub K0 libre de lisina se utiliza para imponer la producción exclusiva de E2 monoubiquitilado. También se puede utilizar Ub de tipo salvaje; sin embargo, esto podría conducir a diversas modificaciones de E2 ~ Ub(por ejemplo,poli-ubiquitilación de E2), que son más difíciles de analizar. Para el uso por primera vez o cuando se utiliza una nueva enzima E2, determine el nivel de carga Ub en E2 que se puede lograr con E1. Para determinar el rendimiento de la carga, visualice E2 sin carga frente a E2 cargado a través de la tinción de Coomassie. Aquí, aproximadamente la mitad de Ub K0 se convirtió de manera confiable a UBE2D2 ~ Ub cuando se usaron relaciones equimolares de UBE2D2 y Ub K0(Figura suplementaria S2A).</li>
			<li>Prepare un esquema de pipeteo para la reacción de carga. Ajuste el volumen de la reacción de carga a las reacciones de descarga posteriores de su elección, por ejemplo,use CHIP y CHIP (H260Q) en reacciones de descarga individuales. Por lo tanto, prepare el doble del volumen de una reacción de carga. NOTA: Para su primer uso, pruebe diferentes concentraciones de la ligasa E3 de elección para monitorear las condiciones óptimas de descarga y analícelas mediante western blotting. En una condición ideal, la descarga de Ub de E2 aumentará con el tiempo hasta que la respectiva banda de proteína E2 ~ Ub desaparezca.</li>
			<li>Incubar la reacción de carga durante 15 min a 37 °C.</li>
		</ol></li>
		<li>Terminación de la reacción de carga<ol>
<li>Detenga la reacción de carga mediante la adición de apirasa a una concentración final de 1,8 U/ml. Realizar la incubación con apirasa durante 5 min en RT, seguido de la adición de EDTA a una concentración final de 30 mM. Ajuste el volumen de la reacción de carga a 30 μL con ddH2O. NOTA: La apirasa se utiliza para convertir las moléculas de ATP en moléculas de ADP (difosfato de adenosina). Como la actividad de la enzima E1 es dependiente de ATP, E1 ya no puede cargar E2. El EDTA también se utiliza para garantizar que el E1 se inhiba apagando los iones Mg2+ que son cofactores necesarios para E1. El volumen de apirasa que se requiere para detener la reacción puede variar entre las condiciones del ensayo. Aunque la apirasa sola ya apaga las moléculas de ATP disponibles, una combinación de apirasa y EDTA fue más efectiva para detener la reacción de carga para el par E1-UBE2D2. Como detener la reacción es un factor crítico para la reproducibilidad del ensayo, se debe probar una parada eficiente para los nuevos pares E1-E2. Para este propósito, configure una reacción de carga, deténgala y recolecte muestras en puntos de tiempo específicos, por ejemplo,después de 2, 5, 10 y 15 minutos. Los niveles no cambiantes de E2 ~ Ub indican que la reacción se ha detenido y que el tioéster fue estable durante ese período de tiempo (Figura suplementaria S2B).</li>
		</ol></li>
		<li>Descarga de E2 ~ Ub por E3<ol>
<li>Preparar cuatro tubos correspondientes a los diferentes puntos de tiempo (t0, t1, t2, t3); agregue un tampón de muestra no reductor (6,7 μL de 4 tampón de dodecil sulfato de litio (LDS)) a cada tubo. NOTA: No utilice agente reductor en el búfer de muestra.</li>
			<li>Retire 6 μL de la reacción de carga detenida para t0y ajuste el volumen a 20 μL con ddH2O.</li>
			<li>Incubar la muestra t0 durante 10 min a 70 °C. NOTA: No hierva la muestra extendiendo el tiempo de incubación ya que los tioésteres son lábiles a temperaturas más altas.</li>
			<li>Calcule el volumen de cada reactivo requerido por reacción de descarga. Use los 24 μL restantes de la E2 cargada y agregue 10 mM de L-lisina, 1 mg/ml de BSA y 500 nM de la ligasa E3. Utilice el tampón de ubiquitilación a 1x y ajuste el volumen a 80 μL con ddH2O.</li>
			<li>Prepare un esquema de pipeteo para todas las reacciones de descarga y use CHIP(H260Q) como control además de CHIP(WT).</li>
			<li>Configure las reacciones de descarga en hielo agregando los componentes requeridos en el siguiente orden: ddH2O, tampón de ubiquitilación, BSA, lisina, ligasa E3 y E2 cargado para iniciar la reacción.</li>
			<li>Incubar la reacción de descarga en RT.</li>
			<li>Tome muestras después de 5, 30 y 60 min transfiriendo 20 μL de la reacción de descarga a los respectivos tubos de muestra. NOTA: Los puntos de tiempo adecuados que permiten un monitoreo adecuado de la descarga pueden variar entre los pares E2-E3.</li>
			<li>Vórtice la muestra inmediatamente e incube a 70 °C durante 10 min.</li>
			<li>Proceda directamente con PAGE. NOTA: Los tioésteres E2 ~ Ub pueden ser lábiles incluso después de desnaturalizarse en el tampón de muestra. Por lo tanto, la electroforesis en gel debe realizarse directamente después de la ejecución del ensayo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Electroforesis en gel y western blot<ol>
<li>Realizar la electroforesis en gel y el western blotting tal y como se describe en la sección 2.2. Use un anticuerpo específico de Ub y, si está disponible, también use un anticuerpo específico de E3 que se haya criado en una especie diferente, lo que permite la detección simultánea de la señal de la ligasa Ub y E3.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de datos<ol>
<li>Realizar el análisis de los datos como se describe en la sección 2.3(Figura 3).</li>
	</ol></li>
</ol>

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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Este artículo describe los métodos básicos de ubiquitilación in vitro para el análisis de la función de la ligasa E3. Al realizar ensayos de ubiquitilación in vitro, se debe considerar que algunas enzimas E2 pueden realizar auto-ubiquitilación debido al ataque de su cisteína activa sobre sus propios residuos de lisina que se encuentran muy cerca del sitio activo30. Para evitar este problema, se recomienda el uso de un mutante E2 en el que el residuo de lisina respectivo se interc...

La ubiquitilación es el proceso por el cual Ub se une covalentemente a una proteína de sustrato1. La modificación de Ub es catalizada por sucesivas reacciones enzimáticas que involucran la acción de tres clases diferentes de enzimas, es decir,enzimas activadoras de Ub (E1s), enzimas conjugantes de Ub (E2s), ligasas de Ub (E3s) y posiblemente factores de elongación de la cadena ub (E4s)2,3,4,5. Después de la activación dependiente de trifosfato de adenosina (ATP) y magnesio (Mg2+)de Ub por E1, la cisteína del sitio activo de E1 ataca la glicina C-terminal de Ub, formando un complejo tioéster (Ub ~ E1). La energía extraída de la hidrólisis de ATP hace que el Ub alcance un estado de transición de alta energía, que se mantiene a lo largo de la siguiente cascada de enzimas. A continuación, la enzima E2 transfiere el Ub activado a su cisteína catalítica interna, formando así un enlace tioéster Ub ~ E2 transitorio. Posteriormente, Ub se transfiere a la proteína del sustrato.
Esto se puede hacer de dos maneras. La ligasa E3 puede unirse primero a E2, o la ligasa E3 puede unirse directamente a Ub. Esta última forma da como resultado la formación de un intermedio E3 ~ Ub. En cualquier caso, Ub está unido a la proteína sustrato mediante la formación de un enlace isopéptido entre el grupo carboxilo C-terminal de Ub y el grupo lisina Ɛ-amino del sustrato6. El genoma humano codifica dos E1, aproximadamente 40 E2, y más de 600 ligasas de ubiquitina putativas7. Sobre la base del mecanismo de transferencia ub del E3, las ligasas de Ub se dividen en tres categorías que involucran ligasas homólogas a E6AP C-Terminus (HECT), really interesting New Gene (RING)/U-box-type y RING entre ligasas de tipo RING (RBR)8. En este estudio, la caja U que contiene ligasa, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), se utiliza como una enzima E3 representativa. En contraste con las enzimas E3 de tipo HECT que forman tioésteres Ub ~ E3, el dominio U-box de CHIP se une a E2 ~ Ub y promueve la posterior transferencia Ub / sustrato directamente desde la enzima E28,9. Basado en la importancia de la U-box para la función enzimática, un mutante chip U-box inactivo, CHIP(H260Q), se utiliza como control. CHIP(H260Q) no se une a sus E2 cognados, perdiendo así su actividad de ligasa E310.
La ubiquitilación de proteínas juega un papel crucial en la regulación de una multitud de eventos celulares en las células eucariotas. La diversidad de resultados celulares que son promovidos por la unión reversible de las moléculas de Ub a las proteínas de sustrato se puede atribuir a las características moleculares de Ub. Como la propia Ub contiene siete residuos de lisina (K) para una mayor ubiquitilación, existe una rica variedad de tipos de cadenas de Ub con diferentes tamaños y/o topologías11. Por ejemplo, los sustratos pueden ser modificados por una sola molécula de Ub en una (mono-ubiquitilación) o múltiples lisinas (multi mono-ubiquitilación), e incluso por cadenas de Ub (poli-ubiquitilación)11. Las cadenas de Ub se forman homo o heterotípicamente a través de los mismos o diferentes residuos de lisina de Ub, lo que incluso podría dar lugar a cadenas de Ub ramificadas9. Por lo tanto, la ubiquitilación de proteínas conduce a diversos arreglos de moléculas de Ub que proporcionan información específica, por ejemplo,para la degradación, activación o localización de proteínas conjugadas12,13. Estas diferentes señales Ub permiten una reprogramación rápida de las vías de señalización celular, que es un requisito importante para la capacidad de la célula para responder a las necesidades ambientales cambiantes.
Un aspecto central de la ubiquitilación está relacionado con el control de calidad de las proteínas. Las proteínas mal plegadas o dañadas irreversiblemente deben ser degradadas y reemplazadas por proteínas recién sintetizadas para mantener la homeostasis o proteostasis de las proteínas14. La ligasa E3 de control de calidad, CHIP, colabora con chaperonas moleculares en la degradación dependiente de Ub de proteínas dañadas9,15,16,17. Aparte de eso, CHIP regula la estabilidad de la chaperona dirigida por miosina, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), que está estrechamente coordinada con la función muscular y las desviaciones de los niveles óptimos conducen a la miopatía humana18,19,20,21. La degradación de UNC-45B por el proteasoma 26S está mediada por la unión de una cadena poli-Ub ligada a K489. En ausencia de proteínas de sustrato, CHIP realiza la auto-ubiquitilación10,22,23,que es característica de las ligasas de ubiquitina RING/U-box E324,25 y se considera que regula la actividad de la ligasa26. La aplicación de los métodos de ensayo de ubiquitilación in vitro descritos en este artículo ayudó a identificar sistemáticamente las enzimas E2 que se asocian con CHIP para promover la formación de cadenas libres de poli-Ub y / o la auto-ubiquitilación de CHIP (protocolo sección 2). Además, se observó ubiquitilación dependiente de CHIP de UNC-45B, que es un sustrato conocido de la ligasa E318,19 (protocolo sección 3). En última instancia, se monitorizó la transferencia dependiente de CHIP de Ub activado desde el tioéster Ub~E2 (sección 4 del protocolo).

<table><tbody><tr><td>Amershan Protran 0.1 y micro; m NC</td><td>GE Healthcare</td><td>10600000</td><td>membrana de nitrocelulosa</td></tr><tr><td>Anti-CHIP</td><td>Cell Signaling</td><td>2080</td><td>Anticuerpo monoclonal anti-CHIP de conejo, clon C3B6</td></tr><tr><td>Anti-MYC</td><td>Roche</td><td>OP10</td><td>Anticuerpo anti-MYC monoclonal de ratón, clon 9E10</td></tr><tr><td>Anti-ubiquitina</td><td>Upstate</td><td>05-944</td><td>Anticuerpo anti-Ub monoclonal de ratón, clon P4D1-A11</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma</td><td>A6535-100UN</td><td></td></tr><tr><td>ATP (10x)</td><td>Enzo</td><td>12091903</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A6003-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de muestras LDS (4x)</td><td>novex</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>L-Lisina</td><td>Sigma</td><td>L5501-5G</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Roth</td><td>4256.4</td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>VWR Productos químicos</td><td>2,08,47,307</td><td>100%</td></tr><tr><td>Milchpulver</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>P029.3</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE</td><td>Invitrogen</td><td>antioxidante NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transferencia tampón (20x)</td><td>novex</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Regla de página plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>26619</td><td>Escalera de proteínas</td></tr><tr><td>RotiBlock</td><td>Roth</td><td>A151.1</td><td>Reactivo de bloqueo</td></tr><tr><td>SDS (20%)</td><td>Roth</td><td>1057.1</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Termociclador</td><td>Bio Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo</td><td>Bio Rad</td><td>1704150EDU</td><td>Sistema de transferencia</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>UbcH Juego de enzimas</td><td>BostonBiochem</td><td>K-980B</td><td>E2 enzimas</td></tr><tr><td>Ubiquitina</td><td>BostonBiochem</td><td>U-100H Enzima</td><td></td></tr><tr><td>activadora de ubiquitina E1</td><td>Enzo</td><td>BML-UW941U-0050</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de ubiquitilación (10x)</td><td>Enzo</td><td>BML-KW9885-001</td><td></td></tr><tr><td>Papel secante Whatman</td><td>Bio Rad</td><td>1703969</td><td>Papel de filtro extra grueso</td></tr></tbody></table>

in vitro análisis de la función e3 ubiquitina ligasa

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

La unión covalente de la ubiquitina (Ub) a los residuos internos de lisina de una proteína de sustrato, un proceso denominado ubiquitilación, representa una de las modificaciones post-traduccionales más importantes en los organismos eucariotas. La ubiquitilación está mediada por una cascada secuencial de tres clases de enzimas, incluidas las enzimas activadoras de ubiquitina (enzimas E1), las enzimas conjugantes de ubiquitina (enzimas E2) y las ligasas de ubiquitina (enzimas E3) y, a veces, los factores de elongación de la cadena de ubiquitina (enzimas E4). Aquí, se proporcionan protocolos in vitro para ensayos de ubiquitilación, que permiten la evaluación de la actividad de la ubiquitina ligasa E3, la cooperación entre pares E2-E3 y la selección de sustratos. Los pares E2-E3 que cooperan se pueden detectar mediante el monitoreo de la generación de cadenas libres de poli-ubiquitina y / o la auto-ubiquitilación de la ligasa E3. La ubiquitilación del sustrato se define por la unión selectiva de la ligasa E3 y puede detectarse mediante western blotting de la reacción in vitro. Además, se describe un ensayo de descarga E2 ~ Ub, que es una herramienta útil para la evaluación directa de la cooperación funcional E2-E3. Aquí, la transferencia de ubiquitina dependiente de E3 se sigue desde la enzima E2 correspondiente a aminoácidos de lisina libre (imitando la ubiquitilación del sustrato) o lisinas internas de la propia ligasa E3 (auto-ubiquitilación). En conclusión, se proporcionan tres protocolos in vitro diferentes que son rápidos y fáciles de realizar para abordar la funcionalidad catalítica de la ligasa E3.

Para identificar las enzimas E2 que cooperan con la ubiquitina ligasa CHIP, se probó un conjunto de candidatos E2 en reacciones individuales de ubiquitilación in vitro. Los pares E2-E3 cooperantes fueron monitoreados por la formación de productos de ubiquitilación dependientes de E3, es decir,auto-ubiquitilación de la ligasa E3 y la formación de polímeros Ub libres. Los productos de ubiquitilación fueron analizados por western blotting. La interpretación de los datos se basa en la comparación del tamaño...

El presente estudio proporciona protocolos detallados de ensayo de ubiquitilación in vitro para el análisis de la actividad catalítica de la ubiquitina ligasa E3. Las proteínas recombinantes se expresaron utilizando sistemas procariotas como el cultivo de Escherichia coli.

In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

El objetivo general de este protocolo es analizar aspectos clave importantes de la función de la ligasa E3, incluida la especificidad de la enzima E2, la selección de sustrato y la transferencia de ubiquitina. La principal ventaja de esta técnica es su amplia aplicabilidad, ya que las proteínas de todas las fuentes eucariotas pueden expresarse y estudiarse in vitro de forma recombinante sin necesidad de equipos especiales. Cuando se utiliza la técnica de descarga de lisina por primera vez, es importante optimizar los parámetros del ensayo, como las concentraciones de enzimas, para identificar las condiciones ideales de descarga para la ligasa E3 de elección.Para realizar un ensayo de auto-ubiquitilación in vitro, configure un esquema de pipeteo para probar la capacidad funcional de diferentes enzimas E2 y prepare una mezcla maestra en hielo para todas las reacciones de ubiquitilación más una reacción adicional. A continuación, agregue un micromolar de enzimas E2 a los tubos apropiados e incube las muestras en un termociclador de PCR durante dos horas en las condiciones indicadas. Después de la incubación, agregue el tampón de muestra SDS a cada reacción y mezcle mediante pipeteo varias veces.Luego hierva inmediatamente las muestras a 95 grados Celsius durante cinco minutos y almacene las proteínas desnaturalizadas a 20 grados Celsius. Para realizar un ensayo de ubiquitilación de sustrato in vitro, prepare el esquema de pipeteo para todas las reacciones. Después de calcular la cantidad de mezcla maestra requerida para una reacción, prepare la mezcla maestra para todas las reacciones en hielo y agregue la mezcla maestra a cada tubo.Agregue las respectivas ligas E3 individualmente. A continuación, incubar las muestras en el termociclador de PCR durante dos horas como se ha demostrado. Al final de la incubación, agregue dos veces el tampón de muestra SDS a cada reacción, mezcle varias veces mediante pipeteo y hierva las muestras durante cinco minutos a 95 grados centígrados.Para realizar un ensayo de descarga de lisina, configure el esquema de pipeteo para la reacción de carga e incube las reacciones de carga durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Para detener la reacción de carga, agregue apirasa a una concentración final de 1,8 unidades por mililitro e incube la reacción durante cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, agregue EDTA a una concentración final de 30 milimolares y use agua de doble destilación para ajustar el volumen de la reacción a 30 microlitros.Para descargar la ubiquitilación E2 por E3, configure cinco tubos correspondientes a los puntos de tiempo para el experimento, agregue 6.7 microlitros de tampón de muestra no reductor a cada tubo, elimine seis microlitros de la reacción de carga detenida del tubo de punto cero de tiempo y ajuste el volumen total a 26.7 microlitros. Para configurar las reacciones de descarga, agregue agua de doble destilación, tampón de ubiquitilación, BSA, lisina, ligasa E3 y la E2 cargada a cada reacción. Después de los períodos de tiempo seleccionados, transfiera muestras de 20 microlitros de cada reacción de descarga al tubo de muestra correspondiente.Luego, vórtice inmediatamente las muestras y colóquelas a 70 grados centígrados durante 10 minutos. En este análisis representativo de Western blot, el CHIP inactivo no fue auto-ubiquitilado. Sin embargo, los productos de ubiquitina independientes de E3 se formaron en presencia de CHIP inactivo y en ausencia de CHIP.El CHIP de tipo salvaje fue auto-ubiquitilado cuando se combinó con las proteínas de las familias UBE2D y UBE2E, mientras que las cadenas de poliubiquitina libre se produjeron en cooperación con las proteínas de la familia UBE2D pero no con las proteínas de la familia UBE2E. La unión de la ubiquitina por UBE2N/V1 dirigió la formación de cadenas libres de ubiquitina. La auto-ubiquitilación y ubiquitilación de UNC-45B se observó con CHIP de tipo salvaje pero no con el mutante inactivo de CHIP, lo que indica que UNC-45B actúa como sustrato conservado para CHIP.Cuando se analizó la actividad catalítica de CHIP utilizando un ensayo de descarga de lisina, la enzima UBE2D2 no cargada tenía un peso molecular de 17 kilodaltons y la UBE2D2 cargada con una sola molécula de ubiquitina tenía un peso molecular de aproximadamente 26 kilodaltons. En el momento 0, se observó todo el rendimiento E2 cargado. En presencia de CHIP inactivo, se detectó una débil descarga independiente de la ligasa E3 de UBE2D2 pero no auto-ubiquitilación de CHIP.En presencia de CHIP de tipo salvaje, la descarga de UBE2D2 fue rápida y se completó en 60 minutos, y la auto-ubiquitilación de CHIP indicó una transferencia de ubiquitina a sus propios residuos de lisina. Debido a la capacidad limitada de E2, trabaje lo más rápido posible e inmediatamente proceda con la reacción de descarga seguida de SDS-PAGE y Western blotting. Siguiendo estos protocolos de ubiquitilación in vitro, los tipos específicos de enlace de ubiquitilación se pueden identificar sondeando los Western blots con anticuerpos específicos de enlace.

in-vitro-analysis-of-e3-ubiquitin-ligase-function

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A diferencia de ligasas de ubiquitina ligasas E3 SUMO algunos han sido identificados. Este modificado en vitro protocolo de sumoilación es capaz de identificar nuevos SUMO E3 ligasas por un ensayo de reconstitución en vitro .

In Vitro Ensayo de la sumoilación estudiar SUMO E3 ligasa actividad

La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en los procesos celulares y está estrechamente coordinada por la desubiquitinación. Los defectos en ambas reacciones subyacen a patologías humanas. Proporcionamos protocolos para la realización de la ubiquitinación y la reacción de desubiquitinación in vitro utilizando componentes purificados.

Ensayos in Vitro Ubiquitination y Deubiquitination de histonas nucleosomales

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

El objetivo de este manuscrito es presentar un esquema para los estudios bioquímicos y funcionales completos de las ligasinas de ubiquitina tipo RING E3. Esta canalización de varios pasos, con protocolos detallados, valida una actividad enzimática de la proteína probada y demuestra cómo vincular la actividad a la función.

Caracterización funcional de las ligasinas de ubiquitina RING-Tipo E3 In Vitro y In Planta

Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.

Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones

La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

Proporcionamos un protocolo detallado para un ensayo de ubiquitilación de un sustrato específico y una ubiquitina ligasa E3 en células de mamíferos. Se utilizaron líneas celulares HEK293T para la sobreexpresión de proteínas, el sustrato poliubiquitilado se purificó a partir de lisados celulares por inmunoprecipitación y se resolvió en SDS-PAGE. Se utilizó immunoblotting para visualizar esta modificación post-traduccional.

Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

Se desarrolló un método simple y escalable para evaluar la importancia funcional de las variantes sin sentido en Ube3a, un gen cuya pérdida y ganancia de función están relacionadas tanto con el síndrome de Angelman como con el trastorno del espectro autista.

Un método escalable basado en células para la evaluación funcional de variantes de Ube3a

Este protocolo explica cómo medir el efecto de la variación genética asociada con los trastornos del neurodesarrollo sobre la actividad de la enzima desubiquitilante mediante la combinación de la purificación de proteínas recombinantes con ensayos de escisión de la cadena de ubiquitina.

Medición de la actividad enzimática de las enzimas desubiquitilantes asociadas a trastornos del neurodesarrollo mediante un ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro

La ubiquitinación es un regulador crítico de las funciones intracelulares de las proteínas. Aquí describimos dos métodos de lisis celular para detectar los niveles de ubiquitinación de proteínas del sustrato en células de mamíferos y comparamos su eficacia para analizar los niveles de ubiquitinación. La sobreexpresión de proteínas en HEK293T células fue inducida por transfección transitoria, y proteínas ubiquitinadas fueron detectadas mediante análisis de western blot.

Estrategias comparativas para la detección de ubiquitinación en lisados celulares de mamíferos utilizando SMAD2/SMURF2 como modelo

Este protocolo describe un método para ubiquitinar Streptococcus pneumoniae utilizando lisado celular de mamífero o complejo enzimático puro de ubiquitina puro, seguido de un tratamiento con complejo proteico purificado VCP/p97-UFD1-NPLOC4 para evaluar su actividad bacteriolítica, permitiendo el estudio de efectores inmunitarios dependientes de ubiquitina.

In vitro Reconstitución de la ubiquitinación bacteriana y eliminación mediada por VCP/p97

Aprende a analizar la actividad de ligasas E3 ubiquitina in vitro para estudiar la cooperación E2-E3 y la especificidad de sustratos. Estos protocolos permiten evaluar la función catalítica de ligasas E3 usando proteínas recombinantes de cualquier fuente eucariota.

In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa

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