Name: Detección y análisis automatizados de exocitosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Aprende a detectar y analizar eventos de exocitosis en secuencias de microscopía TIRF usando software automatizado en MATLAB. Este método computacional clasifica fusiones vesiculares y evalúa su distribución espaciotemporal en neuronas.

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Agradecemos a Dustin Revell y Reginald Edwards por probar el código y la GUI. Los Institutos Nacionales de Salud proporcionaron fondos para apoyar esta investigación: incluidos R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) y F31NS103586 (FLU).

1. Elija conjuntos de datos y directorio
<ol><li>Para seleccionar conjuntos de datos para su análisis, haga clic en el botón Buscar conjuntos de datos ( Figura2A, cuadro rojo 1) para navegar a la carpeta donde se depositan los datos (por ejemplo, la carpeta RawData). Los archivos de datos rellenarán automáticamente los archivos de datos como una lista. Puede haber más de un conjunto de datos en la carpeta.</li>
	<li>Haga clic en el botón Elegir directorio y seleccione el directorio (por ejemplo, Prueba) donde se depositarán los archivos analizados(Figura 2A,cuadro rojo 2). Se creará un conjunto de carpetas y archivos de análisis terminados, así como imágenes temporales intermedias en este directorio cuando se presione el botón Análisis. Se producirán errores si no se elige un directorio.</li>
</ol>2. Establece el tamaño de píxel y la velocidad de fotogramas
<ol><li>Rellene la velocidad de fotogramas y el tamaño de píxel apropiados de las imágenes en el cuadro "Velocidad de fotogramas" o "Tamaño de píxel" apropiado(Figura 2A,cuadro verde). Si no se proporcionan valores (se establecen en el "0" predeterminado), el programa buscará en los metadatos asociados con el archivo la velocidad de fotogramas y el tamaño de píxel. Si no se pueden encontrar estos valores, el programa tendrá como valor predeterminado por píxel para la medición y por fotograma para los puntos de tiempo. NOTA: En el ejemplo proporcionado, la velocidad de fotogramas es 100 y el tamaño de píxel es 0,08.</li>
</ol>3. Elige o haz máscaras
<ol><li>Utilice el botón Creador de máscaras para crear automáticamente máscaras de celda para los datos de la lista de conjuntos de datos de archivos(Figura 2A,cuadro azul). Al usar el botón Creador de máscaras, se creará una nueva carpeta en el directorio elegido llamada MaskFiles. El "Indicador de ejecución" se volverá amarillo mientras se ejecuta y volverá a verde cuando se complete. NOTA: Se creará una máscara para cada archivo de la lista Archivos de datos a partir de los primeros 10 fotogramas del archivo de imagen (o de todos los fotogramas si hay menos de 10 en el archivo de imagen) y se depositará en la carpeta MaskFiles utilizando el esquema de nomenclatura adecuado (que se describe a continuación).</li>
	<li>Asegúrese de que los archivos de máscara rellenan automáticamente la lista Archivos de máscara. El usuario podrá proceder directamente al análisis. NOTA: Siempre verifique visualmente los archivos de máscara y confirme que capturan toda la región de interés. El primer fotograma del archivo de datos y el archivo de máscara se muestran en la interfaz de usuario cuando se seleccionan. (Figura 2B). El fabricante de máscaras puede producir errores en el caso de baja señal a ruido, por lo que validar que los archivos de máscara son apropiados es fundamental para el control de calidad.</li>
	<li>Como alternativa al uso de Mask Maker, si la señal de ruido de las imágenes es insuficiente, cree máscaras manualmente en ImageJ.<ol>
<li>Primero, abra el archivo de imagen sin procesar en ImageJ(Figura 3A).</li>
		<li>Haga clic en el botón Selección de polígono y haga clic para dibujar una máscara alrededor de la celda. Una vez terminado, haga doble clic en el último punto para completar el polígono.</li>
		<li>Una vez terminado, vaya a Editar | Selección | Crear máscara (Figura 3B). Se creará una nueva máscara invertida basada en el dibujo del polígono. Guarde las máscaras en una carpeta MaskFiles designada en el directorio elegido. El esquema de nomenclatura de archivos de máscara debe coincidir con los archivos de datos individuales correspondientes seguidos de "_mask_file". Por ejemplo, si un archivo de datos se denomina "VAMP2_488_WT_1.tif", el archivo de máscara correspondiente debe llamarse "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".</li>
		<li>Utilice el botón Buscar archivos de máscara para navegar a la carpeta elegida de archivos de máscara personalizados depositados. Las máscaras rellenarán los archivos de máscara como una lista. NOTA: Es importante tener una máscara para cada archivo de datos antes de ejecutar el análisis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis y extracción de características
<ol><li>Una vez elegido el directorio y rellenados la lista Archivos de datos y la lista De archivos máscara, haga clic en el botón Análisis (Figura 4A). Si se requiere la clasificación de eventos exocióticos, vaya al paso 5. NOTA: El clic del botón Análisis realizará una serie de tareas automatizadas para analizar los datos. Creará carpetas individuales en el directorio elegido para depositar los datos analizados. Mientras se ejecuta, el "indicador de ejecución" cambiará de verde a amarillo(Figura 4A,cuadro rojo). Una vez finalizado el análisis, esto volverá a cambiar a verde.</li>
	<li>Busque una carpeta DataFiles(Figura 4B)con el conjunto completo de archivos de análisis (así como archivos de extracción de características, que se utilizarán en la clasificación posterior) nombrados de acuerdo con cada archivo de datos(Figura 4C). NOTA: A continuación se incluye una descripción de estos archivos de análisis en la sección Resultados representativos.</li>
</ol>5. Clasificación de eventos exocióticos
<ol><li>Para realizar la clasificación simultánea de eventos exocióticos con detección automatizada, marque la casilla de verificación Clasificación antes de hacer clic en el botón Análisis. Para cada evento exocítico, asigne una puntuación de probabilidad entre 0-1 para cada clase. Un evento exocítico se considera clasificado como una de las cuatro clases si la puntuación de probabilidad para esa clase es > 0,5. NOTA: Una vez completado el análisis, aparecerá una nueva carpeta de archivos de datos dentro del directorio elegido. La carpeta contendrá archivos de análisis correspondientes a cada archivo de imagen.</li>
</ol>6. Análisis espaciotemporal de la exocitosis utilizando los valores K de Ripley
<ol><li>Cree un archivo de máscara "neurite" y "soma" separado. Primero, segmentar el soma de la neurita. No existe un método imparcial para segmentar el soma de las neuritas, por lo que el usuario debe cegarse al experimento de condicionamiento y usar el mejor juicio; se sugiere un elipsoide sin extensiones de neurita obvias.</li>
	<li>Abra ImageJ/Fiji.</li>
	<li>Arrastre y suelte el archivo de máscara o use file | Abra y luego seleccione el archivo de máscara.</li>
	<li>Utilice la herramienta de selección de color y haga clic en cualquiera de los píxeles negros en el fondo de la máscara para establecer el color en negro.</li>
	<li>Utilice la herramienta de selección de polígonos o a mano alzada para dibujar un contorno alrededor del soma, separándolo de las neuritas. Esto requiere una toma de decisiones manual.</li>
	<li>Haz clic en Editar | Selección | Hacer máscara. Se abrirá una nueva imagen con el soma en círculos segmentado del resto de la imagen. Esto creará un archivo de máscara soma.</li>
	<li>Sin mover la región dibujada, haga clic en el encabezado del archivo de máscara original.</li>
	<li>Haz clic en Editar | Rellene para rellenar el soma en círculos de modo que solo queden las neuritas de la máscara.</li>
	<li>Una vez que se obtengan los archivos de neurita y máscara separados, guarde ambos archivos de máscara.</li>
	<li>Abra "neurite_2D_network" en Matlab.</li>
	<li>En MATLAB, desplácese hasta el directorio con todos los datos de análisis.</li>
	<li>Cambie la ruta "nombre de máscara" por el nombre de la máscara de neurita, es decir, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"</li>
	<li>Cambie el "csv_file_name" a donde se encuentra fluorescent_traces.csv archivo, es decir, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".</li>
	<li>Haga clic en Ejecutar para esqueletizar el archivo de máscara de neurita. Esto crea una versión esqueletizada del archivo de máscara de neurita y lo deposita como un archivo CSV en la carpeta maskfiles.</li>
	<li>A continuación, genere un archivo CSV para el soma. Abra "CSV_mask_creator.m" en Matlab.</li>
	<li>Coloque la ruta para el "nombre de la máscara" al nombre de la máscara soma, es decir, "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif</li>
	<li>Cambie el "writematrix" al nombre de archivo csv que se creará, es decir, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"</li>
	<li>Haga clic en Ejecutar. Esto crea el nuevo archivo de VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.</li>
	<li>Repita la versión 6.14 para cada archivo de máscara.</li>
</ol>7. Configuración de RStudio
<ol><li>Abra Rstudio y abra ripleys_k_analysis. Archivo R.</li>
	<li>Instale el paquete "spatstat" en RStudio yendo a Herramientas | Instale paquetes y escriba "spatstat" seguido de hacer clic en Instalar. NOTA: Esto solo debe realizarse una vez por instalación de Rstudio.</li>
	<li>Ejecute el spatstat de biblioteca al comienzo de cada sesión.</li>
	<li>Preste atención a dos variables principales en este caso: "neuron_mask" y "neuron_datapoints". Neuron Mask apunta al conjunto de archivos de máscara para ejecutar, es decir, archivos de máscara de soma". NOTA: Ejecute todos los archivos de máscara soma juntos, por separado de los archivos de máscara Neurite, y viceversa.</li>
	<li>Lea en el .csv de los archivos de máscara para cada una de las neuronas a analizar.</li>
	<li>Ejecute varios archivos a la vez copiando neuron_mask_n+1 adicionales. Esto permitirá agregar el análisis de Ripley juntos, utilizando el script descrito en la sección 8.</li>
	<li>Ahora verifique la segunda variable, "neuron_datapoints".</li>
	<li>Lea en el." X_fluorescent_traces.csv" generado por el programa de análisis (por características de todos los extracted_R archivo) con las posiciones x, y, t de los eventos exocíticos, así como el archivo específico de neurita de las posiciones x, y para la red 2D. Esto va en la posición de "neuron_datapoints".</li>
	<li>En RStudio, seleccione el código | Ejecutar | de región Ejecute todo. Esto genera varias gráficas, incluidos los valores K de Ripley agrupados, así como las gráficas de densidad.</li>
	<li>Guarde parcelas yendo a Exportar | Guardar imagen como | Seleccione el formato de imagen y el directorio adecuados, introduzca el nombre de archivo adecuado y, a continuación, haga clic en Guardar. NOTA: La función de trazado para los mapas de calor se llama en el script usando "plot(density(soma_data,0.4))". El número "0.4" aquí representa cuán suavizada debería ser la función de densidad. Se puede cambiar para ajustarse a los datos del usuario de una manera significativa, pero si se van a realizar comparaciones entre diferentes mapas de calor, el número debe ser el mismo entre ellos.</li>
	<li>
Exportar o guardar imagen desde Rstudio. Si un mapa de calor requiere una edición adicional, elija un tipo de archivo apropiado (SVG o EPS).</li>
</ol>8. Análisis de Ripley
NOTA: El Ripleys_k_analysis. El archivo R también generó automáticamente los gráficos de valores k de Ripley. La ejecución de todo el script ejecutará automáticamente las funciones mencionadas a continuación, pero se incluye en detalle si se desea ejecutar cada parte del script individualmente o realizar cambios en el análisis.
<ol><li>Primero, ejecute la función de envolvente para cada celda. Esta función simuló la aleatoriedad espacial completa (CSR) para probar el valor K de Ripley del patrón de punto de evento exocítico en contra. Data_envelope_1 = sobre(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) Data_envelope_2 = sobre(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)</li>
	<li>A continuación, agrupo estos sobres y cree una estimación de la RSE para el grupo: Pool_csr = piscina(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...) A continuación, ejecute la función K de Ripley para todos los puntos de datos. Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = TRUE) Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = TRUE)</li>
	<li>Una vez completado, aglutine los valores K de Ripley y arranque sus intervalos de confianza con el siguiente comando: Grupo de datos = grupo(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)</li>
	<li>Bootstrap con el siguiente comando: Final_Ripleys_K = varblock(diversión = Kest, Data_pool)</li>
	<li>Trazar los datos.</li>
	<li>Si se requiere una diferencia estadística dura, la prueba de permutación studentizada se incluye en el paquete spatstat para probar una diferencia entre grupos de patrones de puntos: Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grupo, nperm = np).</li>
</ol>

<ol><li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).</li>
<li>Urbina, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM67+regulates+exocytic+mode+and+neuronal+morphogenesis+via+SNAP47%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47.</a> Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).</li>
<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+kiss-and-run%3A+Role+in+exocytosis%2C+endocytosis%2C+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission.</a> Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+on+the+kiss-and-run+fusion+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The debate on the kiss-and-run fusion at synapses.</a> Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).</li>
<li>Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+patch+clamp+reveals+that+transient+fusion+%28kiss-and-run%29+is+a+major+mechanism+of+secretion+in+calf+adrenal+chromaffin+cells%3A+high+calcium+shifts+the+mechanism+from+kiss-and-run+to+complete+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion.</a> Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+single-vesicle+astrocyte+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).</li>
<li>Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+direct%2C+dynamin-dependent+recapture+of+fusing+secretory+granules+on+plasma+membrane+lawns+from+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).</li>
<li>Wang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+domains+of+synaptotagmin+control+the+choice+between+kiss-and-run+and+full+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion.</a> Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).</li>
<li>Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+combined+methodologies+to+define+the+role+of+plasma+membrane+delivery+during+axon+branching+and+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Plooster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM9-dependent+ubiquitination+of+DCC+constrains+kinase+signaling%2C+exocytosis%2C+and+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).</li>
<li>Urbina, F. L., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-mediated+exocytosis+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SNARE-mediated exocytosis in neuronal development.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).</li>
<li>Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second-order+analysis+of+stationary+point+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Probability%22%5BJournal%5D)">The second-order analysis of stationary point processes.</a> Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHmScarlet+is+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+to+monitor+exocytosis+docking+and+fusion+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps.</a> Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).</li>
</ol>

Los autores no declaran nada que revelar.

Al utilizar el software de detección y análisis exocítico, tenga en cuenta que el programa solo acepta la compresión sin pérdidas .tif archivos como entrada. Los archivos de imagen .tif pueden ser imágenes de escala de grises (un solo canal) de 8 bits, 16 bits o 32 bits. Otros formatos de imagen deben convertirse a uno de estos tipos antes de la entrada. Como referencia, los ejemplos utilizados aquí son imágenes en escala de grises de 16 bits.
Inherentes al proceso de detección automatizada, l...

Las construcciones VAMP-pHluorin o el receptor de transferrina (TfR)-pHuji son excelentes marcadores de eventos exocióticos, ya que estos fluoróforos sensibles al pH se apagan dentro de la luz de la vesícula ácida y la fluorescencia inmediatamente después de la apertura del poro de fusión entre la vesícula y la membrana plasmática1. Después de la apertura del poro de fusión, la fluorescencia decae exponencialmente, con cierta heterogeneidad que revela información sobre el evento de fusión. Aquí, se describe una aplicación de interfaz gráfica de usuario (GUI) que detecta y analiza automáticamente los eventos exocióticos. Esta aplicación permite al usuario detectar automáticamente eventos exocióticos revelados por marcadores sensibles al pH2 y generar características a partir de cada evento que pueden ser utilizadas para fines de clasificación3 (Figura 1A). Además, se describe el análisis de la agrupación de eventos exocióticos utilizando la función K de Ripley.
Recientemente se informó de la clasificación automatizada de eventos exocióticos en diferentes modos exocióticos3. Se han descrito previamente dos modos de exocitosis, la fusión de vesícula completa (FVF) y la exocitosis de fusión de beso y corrido (KNR)4,5,6,7. Durante la FVF, el poro de fusión se dilata y la vesícula se incorpora a la membrana plasmática. Durante KNR, el poro de fusión se abre transitoriamente y luego vuelve a sesar4,5,8,9,10. Se identificaron cuatro modos de exocitosis en neuronas en desarrollo, dos relacionados con FVF y dos relacionados con KNR. Este trabajo demuestra que tanto FVF como KNR se pueden subdividir en eventos de fusión que proceden inmediatamente a la desintegración de la fluorescencia (FVFi y KNRi) después de la apertura del poro de fusión o eventos exocíticos que exhiben un retraso después de la apertura del poro de fusión antes de que comience la desintegración por fluorescencia (FVFd y KNRd)(Figura 1B). El clasificador identifica el modo de exocitosis para cada evento de fusión. Aquí este análisis se ha incorporado en una GUI que se puede instalar en MATLAB en sistemas operativos basados en Windows y Mac. Todos los archivos de análisis se pueden encontrar en https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing o https://github.com/GuptonLab.

<table><tbody><tr><td></td><td>Equipo</td><td></td><td></td> central</tr> de <tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr> R R https://www.r-project.org/ <tr><td>Rstudio</td><td>, Rstudio, PBC</td><td></td><td>https://rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

detección y análisis automatizados de exocitosis

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

La microscopía TIRF de lapso de tiempo de GFP sensible al pH (pHluorin) unida a las proteínas SNARE de vesícula es un método eficaz para visualizar eventos exocíticos de vesícula única en cultivo celular. Para realizar una identificación y análisis imparcial y eficiente de dichos eventos, se desarrolló e implementó en MATLAB un enfoque basado en la visión por computadora. La canalización de análisis consiste en un algoritmo de segmentación celular e identificación de eventos exocíticos. El enfoque de visión por computadora incluye herramientas para investigar múltiples parámetros de eventos individuales, incluida la vida media de la desintegración por fluorescencia y el pico de ΔF / F, así como el análisis de células enteras de la frecuencia de la exocitosis. Estos y otros parámetros de fusión se utilizan en un enfoque de clasificación para distinguir distintos modos de fusión. Aquí, una GUI recién construida realiza la canalización de análisis de principio a fin. La adaptación adicional de la función K de Ripley en R Studio se utiliza para distinguir entre la ocurrencia agrupada, dispersa o aleatoria de eventos de fusión tanto en el espacio como en el tiempo.

Aquí se utilizó la GUI(Figura 2A)para analizar eventos exocíticos de tres neuronas que expresan VAMP2-pHluorin a 3 DIV utilizando microscopía TIRF (fluorescencia de reflexión interna total). Se aislaron las neuronas corticales E15.5, seguidas de la transfección con VAMP2-pHluorin y el recubrimiento utilizando los protocolos descritos en Winkle et al., 2016 y Viesselmann et al., 201111,12. La metodología de los parámetros de imagen es...

Desarrollamos un software automatizado de visión por computadora para detectar eventos exocióticos marcados por sondas fluorescentes sensibles al pH. Aquí, demostramos el uso de una interfaz gráfica de usuario y RStudio para detectar eventos de fusión, analizar y mostrar parámetros espaciotemporales de fusión y clasificar eventos en distintos modos de fusión.

Detección y análisis automatizados de exocitosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

El software automated Detection and Analysis Of Exocytosis permitirá al usuario detectar automáticamente eventos exocíticos y secuencias de imágenes TIRF de fluoróforos sensibles al pH. También producirá automáticamente características de la exocitosis, como la distribución espacial o la frecuencia, así como propiedades individuales de eventos exocíticos, como la vida media o el cambio en la fluorescencia sobre el fondo. Además, se incluye una opción para clasificar los eventos exocióticos en cuatro modos de exocitosis, previamente descritos en la literatura.Para utilizar el software de detección y análisis automatizado de exocitosis, primero hará clic en el botón Buscar conjunto de datos y navegará hasta donde se depositan sus datos, y querrá colocar una carpeta llamada datos sin procesar. Sus archivos de datos rellenarán automáticamente la lista aquí, y puede tener cualquier número de archivos de datos en esta carpeta. A continuación, querrá elegir un directorio para el que se depositarán sus archivos de análisis.Aquí, he elegido un directorio llamado test. También querrá completar la velocidad de fotogramas de sus imágenes, así como el tamaño de píxel. Aquí mis velocidades de fotogramas son de cien milisegundos por fotograma, mi tamaño de píxel es de ocho nanómetros.Finalmente, necesitará archivos de máscara para ejecutar el software de detección y análisis automatizado de exocitosis. Puede utilizar el botón de creación de máscaras incluido para generar automáticamente archivos de máscaras a partir de sus archivos de datos. El indicador de ejecución se volverá amarillo y luego volverá a verde cuando el fabricante de máscaras termine de funcionar.Su máscara se depositará en una nueva carpeta llamada archivos de máscara en el directorio elegido. Y tenga en cuenta que los archivos de máscara rellenarán automáticamente la lista aquí. Querrá verificar que sus archivos de máscara estén hechos adecuadamente para sus archivos de datos, y puede hacerlo resaltando cualquiera de los archivos de datos en la lista, así como el archivo de máscara correspondiente.Aparecerá el primer fotograma de su archivo de datos y también aparecerá el archivo de máscara seleccionado. Aquí. Podemos ver que nuestros archivos de máscara son apropiados para el análisis en cuestión. Los archivos de máscara también pueden ser suministrados por el usuario por separado.Cuando uno desea hacer un archivo de máscara a partir de un archivo de datos actual, le recomendamos que utilice Image J.In para hacerlo, primero abra la imagen en Image J a partir de la que desea crear un archivo de máscara. A continuación, puede utilizar la herramienta de selección de polígonos para comenzar a crear un archivo de máscara haciendo clic alrededor del borde de la celda. Cuando haya completado la máscara, haga doble clic para conectarse a todo el polígono.Una vez que esto se haya completado, se dirigirá a editar, seleccionar y crear máscara. Se creará una máscara invertida. Querrá guardar este archivo de máscara con el mismo nombre que el archivo de datos seguido de _mask_file.Ahora, si proporciona sus propios archivos de máscara personalizados, es importante que el software de detección automatizada sepa dónde se encuentran esos archivos de máscara. Para hacerlo, hará clic en el botón Buscar archivos de máscara y navegará hasta el directorio con sus archivos de máscara en él. Los nuevos archivos de máscara rellenarán la lista aquí.Es importante que tenga una máscara para cada archivo de datos antes de que se pueda ejecutar el análisis. Ahora, una vez que haya cargado su conjunto de datos, sus archivos de máscara, su velocidad de fotogramas y tamaño de píxel ajustado correctamente, y un directorio elegido, finalmente puede decidir si desea incluir la clasificación como parte de su análisis. Si alterna el botón de clasificación, además de detectar eventos exocióticos, cada evento exocítico se clasificará en una de las cuatro clases.Una vez que haya decidido la forma en que se ejecutará su análisis, puede comenzar el análisis haciendo clic en el botón de análisis. El indicador de ejecución se volverá amarillo para indicar que el análisis está en curso y volverá a verde cuando finalice el análisis. Una vez que se complete el análisis, como lo indica el indicador de ejecución que cambia de amarillo a verde, notará que ha aparecido una nueva carpeta de archivos de datos dentro del directorio elegido.Dentro de la carpeta de archivos de datos, encontrará archivos de análisis correspondientes a cada conjunto de imágenes en su ejecución de análisis. Además, aquí se encuentra un archivo de estadísticas celulares que contiene información resumida, como la frecuencia de exocitosis para cada uno de los conjuntos de imágenes. Para cada conjunto de imágenes, tiene un archivo de trazas fluorescentes, que contiene información sobre la posición X, la posición Y y el número de fotograma para el lugar donde se producen los eventos exocitarios.Además, la fluorescencia media en una región de interés alrededor de cada evento exocítico se presenta tanto antes, durante y después de la exocitosis. Además, también hay un archivo de seguimiento, que contiene información similar de las posiciones X, Y y temporal. Sin embargo, si la casilla de verificación de clasificación está marcada, además, habrá cuatro columnas adicionales, que indican la probabilidad de que el evento exocítico pertenezca a una de las cuatro clases.Fusión de vesícula completa instantánea, fusión de vesícula completa retrasada, instantánea de beso y corrido o retraso de beso y corrida. Un evento exocítico pertenece a una de las cuatro clases si es mayor que 0,5 y es la probabilidad más alta dentro de las cuatro clases gobernadas. En este caso, el primer evento exocítico aquí pertenece a la clase instantánea de fusión de vesículas completas, ya que es el número más alto por encima de las cuatro clases y es mayor que 0.5.Además, hay una serie de otros archivos de características para cada conjunto de imágenes, que se utilizan durante la clasificación de la exocitosis y pueden ser de interés para un análisis posterior. Finalmente, si queremos utilizar el análisis K de Ripley para detectar la organización espacio-temporal de la exocitosis, primero comenzaremos dividiendo nuestro archivo de máscara en un archivo de máscara de neurita y un archivo de máscara de soma. Haremos esto abriendo primero nuestra máscara en la imagen J.Querremos usar el selector de color para seleccionar un píxel de fondo.Y de esta manera, cuando rellenamos el archivo de máscara, es el valor correcto. A continuación, usaremos la herramienta de selección de polígonos y describiremos la región somática. Ahora bien, esto requiere un poco de toma de decisiones subjetiva y manual.sugerimos un elipsoide áspero. Una vez que haya completado eso, irá a editar, seleccionar y crear máscara. Finalmente, volverá a nuestro archivo de máscara original y usará editar y completar para completar el soma, y ahora tenemos un archivo de máscara de neurita y soma separado, que luego guardará.Una vez que haya guardado su archivo separado de neurita y máscara de soma, aquí, lo tengo como neur de subrayado de archivo de máscara para neurita y soma de subrayados, iremos a MATLAB y abriremos el archivo MATLAB de red 2D de neurita. Aquí, navegaremos por la carpeta actual a nuestro directorio donde depositamos todos nuestros datos de análisis. Una vez que hayamos hecho eso, haremos cambiado la ruta del nombre de la máscara a nuestro nuevo archivo de máscara que es la neurita.Entonces, en este caso, tengo mi archivo de máscara de neurita debajo de la carpeta de archivos de máscara. Luego cambiaremos el nombre del archivo CSV a donde se encuentra nuestro archivo de rastros fluorescentes. En este caso, todavía está en la carpeta de archivos de datos, por lo que los archivos de datos se cortan y el nombre del archivo CSV de trazas fluorescentes.Una vez que se haya completado, puede presionar ejecutar. Esto creará una versión esqueletizada del archivo de máscara de neurita y lo depositará como un archivo CSV en la carpeta de archivos de máscara, que podemos ver aquí. A continuación, también generaremos un archivo CSV para el soma.Para ello, abra el archivo de creación de máscaras CSV. Querrás poner la ruta de tu máscara soma y un nombre para el archivo CSV que se creará. Aquí seguí adelante y usé el mismo nombre de archivo exacto, solo que con el punto CSV adjunto.Presione ejecutar y verá que se ha creado un nuevo archivo CSV soma junto con la neurita. Una vez que hemos creado los archivos CSV tanto para la máscara de neurita como para la máscara de soma, podemos ejecutar el análisis K de Ripley. Para hacerlo, navegaremos a R Studio y abriremos el archivo R de análisis K de Ripley.Hay dos variables principales aquí a las que prestar atención, la máscara neuronal y los puntos de datos neuronales. Neuron mask apuntará a los archivos de máscara que desee ejecutar. En este caso, primero estoy ejecutando los archivos de máscara de soma.Querrá ejecutar todos sus archivos de máscara de soma por separado de todos sus archivos de máscara de neurita. Aquí, tengo dos neuronas, que usaré para este análisis. Sin embargo, puede usar tantos como desee para el análisis K de Ripley, solo querrá copiar y pegar este código para la máscara neuronal y cambiar la variable a tres, y en adelante.La segunda variable son los puntos de datos neuronales. Aquí desea apuntarlo al archivo que fue generado por sus características todas las características del archivo R extraído. Ahora el mío se llamaba estadísticas de fusión, y eso es lo que está leyendo aquí.Como se mencionó, tengo un segundo archivo de máscara de soma y una neurona, que se está analizando junto con para que podamos agregar la K de Ripley. Una vez que haya cambiado estas rutas a la ruta correcta, usará código, ejecutará la región y ejecutará todo. Una vez completada la ejecución, se generarán varias gráficas, incluidos los valores K de Ripley agrupados, así como las gráficas de densidad.Estos se pueden guardar yendo a exportar, guardar la imagen como y eligiendo el formato de imagen apropiado, el directorio, el nombre del archivo y, finalmente, presionando guardar. Aquí vemos resultados representativos de 12 neuronas corticales murinas que expresan ventilación a flúor fotografiado a los dos días in vitro utilizando microscopía TIRF. En A, vemos la frecuencia de exocitosis dividida por clase.Aquí podemos ver que la fusión completa de vesículas instantánea ocurre con más frecuencia que las otras clases. En B, podemos ver la distribución de modos, confirmando que la fusión instantánea de vesículas completas constituye más de la mitad de todos los eventos. En C determinamos la distribución espacial de la exocitosis como mapa de calor.Podemos ver que la mayoría de los eventos exocióticos se agrupan en un punto caliente cerca del soma, así como en los extremos distales de las neuritas. En D podemos determinar que los eventos exocíticos están agrupados estadísticamente significativamente, y que el tamaño de estos grupos varía de media micra a una micra de tamaño. El uso de un programa de análisis automatizado para identificar y analizar correctamente los eventos exocióticos de manera imparcial aumenta la eficiencia del análisis y mejora la reproducibilidad y el rigor.Para garantizar la precisión de la detección, es importante mantener una señal alta al ruido durante la obtención de imágenes. La captura de eventos exocióticos u otros eventos transitorios sensibles al pH requiere una frecuencia de imagen lo suficientemente rápida como para capturar todos los eventos y mejorar las estimaciones, como la vida media o el cambio máximo en la fluorescencia. Hemos demostrado que este programa no solo funciona para capturar con precisión la fluorescencia sensible al pH en las neuronas en desarrollo, sino también en otros tipos de células.Sin embargo, si se utiliza otro tipo de célula, es importante comprobar las diferencias en la precisión, debido a los distintos comportamientos de los eventos transitorios en otros tipos de células. Esta clasificación solo se ha utilizado en neuronas en desarrollo hasta la fecha. Y, de hecho, no sabemos que estos procesos existen en otros tipos de células o en puntos de tiempo de desarrollo posteriores en las neuronas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra una técnica para visualizar la exocitosis en mastocitos. Las células se incuban con FITC-dextrano, un reportero fluorescente, que es absorbido por las células dentro de los gránulos secretores (SG), donde el pH ácido apaga su fluorescencia. Tras la estimulación de la exocitosis de gránulos, el pH más alto del medio induce fluorescencia reportera dentro de los SG fusionados, que se visualiza utilizando un microscopio de fluorescencia.

Una técnica in vitro para visualizar la exocitosis de los gránulos secretores en los mastocitos

Endocitosis mediada por clatrina, un proceso rápido y altamente dinámico internaliza muchas proteínas, incluidos los receptores de señalización. El protocolo descrito aquí visualiza directamente la cinética de los eventos endocíticos individuales. Esto es esencial para comprender cómo los miembros centrales de la maquinaria endocítica se coordinan entre sí y cómo la carga de proteínas influye en este proceso.

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

Existen muchos métodos diferentes para la medición de las vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometría de flujo (FCM). Varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Se presentan dos protocolos para vehículos eléctricos de medición, usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas.

Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

El objetivo de este protocolo era desarrollar un método que permita a los análisis de genómica funcional de la secreción de mastocitos. El protocolo se basa en la evaluación cuantitativa de la liberación de un gen indicador fluorescente cotrasfected con el gen de interés y análisis en tiempo real de la morfología de los gránulos de secreción.

Investigando mastocitos secretora gránulos; de Biosíntesis de la exocitosis

Endocitosis de vesículas sinápticas se detectan por microscopia ligera de pHluorin fusionado con la proteína de la vesícula sináptica y por microscopia electrónica de la absorción de la vesícula.

Medición de endocitosis vesícula sináptica en neuronas Hippocampal cultivadas

Estrés osmótico afecta la exocitosis y la cantidad de neurotransmisor liberado durante este proceso. Demostramos cómo la combinación de métodos electroquímicos junto con microscopia electrónica de transmisión se puede utilizar para estudiar el efecto de la presión osmótica extracelular sobre la actividad de la exocitosis, tamaño cuántico de la vesícula y la cantidad de neurotransmisor liberado durante la exocitosis.

El efecto del estrés osmótico en vesículas secretoras y exocitosis de monitoreo

Aquí detallamos un método para obtener imágenes de células vivas de exocitosis regulada. Este método utiliza FITC-los dextranos, que se acumulan en orgánulos relacionados con los lisosomas, como reportero. Este sencillo método permite también distinguir entre los diferentes modos de exocitosis regulada en las células que son difíciles de manipular genéticamente.

Proyección de imagen de FITC-dextrano como reportero para exocitosis regulada

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Las imágenes en vivo de la exocitosis lisosomal en células micropatrnadas permiten una cuantificación espacial de este proceso. La normalización de la morfología utilizando micropatrón es una herramienta excepcional para descubrir reglas generales sobre la distribución espacial de los procesos celulares.

Cuantificación de parámetros espaciotemporales de la exocitostosis celular en células micropatr babeadas

Este protocolo describe los enfoques para la detección y cuantificación de grandes extrusiones de agregados y/o orgánulos (4 m) producidos por células C. elegans en forma de exoferos unidos a la membrana. Describimos las tensiones, las condiciones de crecimiento, los criterios de puntuación, el momento y las consideraciones de microscopía necesarias para facilitar la disección de este mecanismo de expulsión de escombros.

Enfoques cuantitativos para la puntuación in vivo de la extrusión de agregados neuronales y organelle en vesículas de exoféro grandes en C. elegans

Aprende a detectar y analizar eventos de exocitosis en secuencias de microscopía TIRF usando software automatizado en MATLAB. Este método computacional clasifica fusiones vesiculares y evalúa su distribución espaciotemporal en neuronas.

Detección y análisis automatizados de exocitosis

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