Name: Aislamiento de poblaciones adultas de astrocitos humanos de la corteza recién congelada utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprende a aislar poblaciones de núcleos de astrocitos adultos de corteza cerebral humana congelada mediante clasificación de núcleos activada por fluorescencia (FANS). Este protocolo permite obtener astrocitos de alta pureza para análisis transcriptómicos y de accesibilidad cromatínica en estudios de neurociencia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nos gustaría agradecer a los miembros de Patología y Neurocirugía de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai por su ayuda con la adquisición de tejido cerebral no identificado y al CORE de Citometría de Flujo de ISMMS por el asesoramiento de expertos. El estudio fue parcialmente financiado por NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (a N.M.T.) y R61DA048207 (a S.A.).

NOTA: El Programa para la Protección de Sujetos Humanos de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai (ISMMS) y su Junta de Revisión Institucional (IRB) asegura la conducta ética de la investigación y el cumplimiento de las regulaciones federales, estatales e institucionales. En este estudio, todas las muestras postmortem utilizadas fueron desidentificadas, obtenidas bajo el consentimiento apropiado a través del biorepositorio, y fueron exentas de la designación de "investigación humana" por el IRB de ISMMS (HS # 14-01007).
1. Preparación del búfer
NOTA: Si realiza la secuenciación de ARN aguas abajo, trate a fondo todos los espacios de trabajo y herramientas con RNase Decontamination Solution para evitar la degradación de mRNA.
<ol><li>Prepare el búfer de lisis.<ol>
<li>Disolver lo siguiente en destilado H2O hasta 50 mL: 5,47 g de sacarosa (0,32 M final), 250 μL de 1 M CaCl2 (5 mM final), 150 μL de 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM final), 10 μL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,1 mM final), 500 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 50 μL de Tritón X-100 (0,1% final), y 17 μL de 3 M de ditiotreitol (TDT, 1 mM final, añadir fresco) (ver la Tabla de Materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar tampón de sacarosa<ol>
<li>Disolver lo siguiente en destilado H2O hasta 50 mL: 30,78 g de sacarosa (1,8 M final), 150 μL de 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM final), 500 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 17 μL de 3 M TDT (1 mM final, añadir fresco).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Disociación de tejido congelado en suspensión de un solo núcleo
<ol><li>Agregue 4 ml de tampón de lisis helado a un douncer de tejido de vidrio de 7 ml (molinillo) y manténgalo en hielo. Diseccionar aproximadamente 200-400 mg de corteza adulta humana recién congelada, doblar aproximadamente 50x, y transferir el homogeneizado del tejido a un tubo de polipropileno ultracentrífuga de 12 ml.</li>
	<li>Usando una pipeta de 5 ml, agregue 6.5 ml de tampón de sacarosa helada al fondo del tubo de la ultracentrífuga, teniendo cuidado de no perturbar la capa entre la sacarosa y el homogeneizado del tejido. NOTA: Si procesa muestras adicionales, equilibre cuidadosamente los tubos por peso agregando un tampón de lisis adicional a la muestra más ligera. El equilibrado preciso de los tubos de la ultracentrífuga es esencial para evitar daños en el rotor y garantizar la rotación a la velocidad adecuada.</li>
</ol>3. Ultracentrifugación
<ol><li>Ultracentrífuga el lisado a 24.400 rpm (101.814 × g) durante 1 h a 4 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y los escombros sin molestar el perdigón. NOTA: Un pellet puede no ser visible si comienza con menos de 200 mg de tejido.</li>
	<li>Añadir 600 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Ca2+, Mg2+ libre) al pellet de núcleos e incubar en hielo durante 10 min antes de volver a su disolución.</li>
	<li>Pipete hacia arriba y hacia abajo 50 veces para resuspendir el pellet de núcleos en hielo.</li>
	<li>Utilice un hemocitómetro para visualizar los núcleos intactos bajo un microscopio y para asegurar que la concentración de la resuspensión es superior a 105 núcleos/ml antes de pasar al siguiente paso (combinar 10 μL de los núcleos resuspendidos con 10 μL de azul de tripano).</li>
</ol>4. Incubación de anticuerpos
<ol><li>Para inmunoetiquetar la muestra para FANS, agregue 500 μL del pellet de muestra resuspendido, 490 μL de 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libre), 10 μL de BSA al 10% (0.1% final), 1 μL de anticuerpo anti-NeuN de ratón conjugado a AF555 (NeuN-AF555, concentración final de 1:1000) y 1 μL de anticuerpo anti-PAX6 de ratón conjugado a aloficocianina (PAX6-APC, concentración final de 1:1000). NOTA: Se pueden agregar anticuerpos alternativos conjugados con otros fluoróforos (ver discusión). Aquí, se utilizó anti-OLIG2 de ratón conjugado a AF488 (concentración de 1:1000) con resultados favorables.</li>
	<li>Realice controles de 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) y de un solo color para configurar los parámetros de cierre, utilizando una pequeña cantidad de la muestra según sea necesario.<ol>
<li>Para realizar el control de color único AF555, agregue 20 μL del pellet de muestra resuspendido, 970 μL de 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libre), 10 μL de BSA al 10% (0.1% final) y 1 μL de anticuerpo NeuN-AF555 (concentración de 1:1000).</li>
		<li>Para realizar el control de color único de APC, agregue 20 μL del pellet de muestra resuspendido, 970 μL de 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libre), 10 μL de BSA al 10% (0.1% final) y 1 μL de anticuerpo PAX6-APC (concentración de 1:1000).</li>
		<li>Para realizar el control solo de DAPI, agregue 20 μL del pellet de muestra resuspendido, 970 μL de 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libre) y 10 μL de BSA al 10% (0.1% final) (DAPI se agregará más adelante, ver 4.4). NOTA: Si se usan más de dos anticuerpos, se recomienda realizar un control de fluorescencia menos uno (FMO) además de los controles de un solo color.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar las muestras y los controles con rotación en la oscuridad durante 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Agregue DAPI a 1:1000 a todas las muestras y controles, y continúe con la clasificación.</li>
</ol>5. Clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS)
NOTA: Se recomienda utilizar una instalación de citometría de flujo institucional con la ayuda de personal capacitado a menos que ya sea competente en técnicas de citometría / clasificación de flujo.
<ol><li>Puerta como se muestra a continuación.<ol>
<li>Primero, y para cada muestra, puerta por dispersión hacia adelante (FSC-A) vs. dispersión lateral (SSC-A) para incluir partículas en el rango de tamaño apropiado para los núcleos, excluyendo así los glóbulos rojos y los desechos (Figura 1A). NOTA: Una preparación de núcleos muy limpia puede distinguir entre un grupo de escombros más pequeño y un grupo de núcleos.</li>
		<li>A continuación, y para cada muestra, compuerta por FSC-A vs. FSC-W (o FSC-A vs. FSC-H) y SSC-A vs. SSC-W (o SSC-A vs. SSC-H) para incluir solo núcleos singletes (Figura 1B).</li>
		<li>A continuación, y para cada muestra, puerta por DAPI para incluir singletes de núcleos intactos (DAPI-high gated population), excluyendo escombros (DAPI-low, a la izquierda de la población cerrada) y dobletes (a la derecha de la población cerrada) (Figura 1C).</li>
		<li>Establezca una compuerta adicional basada en controles de fluorescencia, determinados visualmente como grupos distintos en parcelas FACS.<ol>
<li>Ejecute el control solo DAPI para determinar la tinción de fondo de las poblaciones, en ausencia de anticuerpos (Figura 1D y Figura 2A).</li>
			<li>Ejecute el control neuN-AF555-only para determinar el corte de tinción NeuN+ en el canal para AF555 (Figura 2B).</li>
			<li>Ejecute el control solo PAX6-APC para determinar el corte para la tinción PAX6+ en el canal APC (Figura 2C).</li>
			<li>Ejecute controles adicionales de un solo color si usa más anticuerpos (Figura 2D, E). NOTA: Si se usan más de dos anticuerpos, se recomienda un control FMO para visualizar cualquier cambio en las poblaciones.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Una vez que se hayan ejecutado todos los controles, dibuje las puertas para las colecciones NeuN+ y PAX6+ por encima de los umbrales establecidos.<ol>
<li>Compuerta a la población NeuN+ para recolectar neuronas (Figura 1E y Figura 2F).</li>
			<li>Gatear la población PAX6+ de la población NeuN- para recolectar astrocitos (Figura 1E, F y Figura 2F).</li>
			<li>Gate y recolecta poblaciones gliales adicionales (como las células progenitoras de oligodendrocitos, como se muestra aquí por OLIG2+) de la población NeuN-PAX6- (Figura 1F). NOTA: En caso de que determinar los puntos de corte apropiados sea difícil con el software de citometría de flujo debido a las poblaciones indistintas, puede ser útil modificar el número de eventos que se visualizan (ya sea aumentando o reduciendo el número de eventos en la gráfica FANS).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolectar muestras adecuadamente en función del análisis posterior previsto.</li>
</ol>6. Recopilación de poblaciones de FANS para análisis moleculares posteriores
<ol><li>Para la secuenciación de ARN a granel, recolectar 50.000-500.000 núcleos en PBS (ver también sección 7.1).<ol>
<li>Añadir 2 mL de solución de sacarosa, 50 μL de 1 M De CaCl2 y 30 μL de 1 M Mg(CH3COO)2, y rellenar con PBS hasta 10 mL.</li>
		<li>Invierta e incube en hielo durante 15 min, luego centrífique a 900 × g durante 10-15 min a 4 °C.</li>
		<li>Aspire el sobrenadante, resuspenda en 1 ml de reactivo extractor de ARN, vórtice, congele sobre hielo seco y almacene a -80 °C.</li>
		<li>Alternativamente, recolecte las muestras directamente en 200 μL del reactivo extractor de ARN. Agregue el reactivo de extracción de ARN hasta 1 ml después de la clasificación, manteniendo una proporción de 1: 1 del reactivo a la muestra clasificada. Vórtice, congele sobre hielo seco y almacene a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para el ensayo a granel para la cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq), recolecte 50,000-75,000 núcleos en PBS en un tubo de microcentrífuga recubierto con albúmina sérica bovina (BSA) al 5%. Congele los núcleos en hielo seco/-80 °C o úselos inmediatamente para la preparación de ATAC.</li>
	<li>Para sn RNA-seq o ATAC-seq, recolectar núcleos en BSA al 0,04% en PBS (ver también sección 7.2).</li>
</ol>7. Consejos de preparación previa a la biblioteca
<ol><li>Preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN nuclear a granel<ol>
<li>Después de recolectar en el reactivo de extracción de ARN, realice la extracción estándar de ARN de fenol / cloroformo agregando fenol / cloroformo y precipitando ARN de la capa acuosa superior con etanol, seguido de la digestión de DNasa en el tubo (15 min).</li>
		<li>Realice la limpieza de ARN y concéntrese en un volumen final de 15 μL de agua. NOTA: Usando este método, la recuperación representativa de 300 mg de muestra de corteza adulta es de ~ 300,000 núcleos NeuN + (15-20 ng / μL de ARN total después de la limpieza y concentración) y ~ 250,000 núcleos PAX6 + (10-12 ng / μL de ARN total después de la limpieza y concentración). Este rendimiento representativo puede variar mucho en función de la calidad de la muestra, la rigurosidad de la compuerta y la recuperación de ARN.</li>
		<li>Realizar una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR) antes de la secuenciación para confirmar el enriquecimiento de astrocitos basado en la alta expresión diferencial de marcadores canónicos de astrocitos (GFAP, SOX9), 10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa (ALDH1L1)) y agotamiento de marcadores neuronales y otros marcadores de linaje celular (Figura 1G). NOTA: La recolección de la población doble negativa (NeuN-PAX6-) permite un análisis de control de calidad qPCR más preciso y multinivel para el enriquecimiento relativo de astrocitos (Figura 2H).</li>
		<li>Genere bibliotecas de ARN-seq utilizando un kit recomendado para valores bajos de número de integridad de ARN, como se espera de las muestras postmortem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la biblioteca de secuenciación de un solo núcleo<ol>
<li>Realizar secuenciación sn a través de un núcleo de secuenciación institucional.</li>
		<li>Para el procesamiento y la secuenciación basados en nanofluídica, utilice la concentración recomendada de 1 × 106 células/ml en al menos 60 μL de 1x PBS + 0,04% BSA para la secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq) y 3 × 106 células/ml en al menos 20 μL de 1x PBS + 0,04% BSA para el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación (snATAC-seq).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42(2008).</li>
<li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PsychENCODE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914(2008).</li>
<li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li>
<li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70(2015).</li>
<li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurogenesis-controlling+factor%2C+Pax6%2C+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li>
<li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li>
<li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6%3A+25th+anniversary+and+more+to+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li>
<li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li>
<li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue%3A+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li>
<li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+%CE%B1A%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El diseño experimental siguiendo el protocolo esbozado debe finalizarse después de considerar varios factores biológicos y técnicos. Las muestras de tejido iniciales se congelan frescamente, sin haber sido fijadas, y preferiblemente tienen un corto intervalo de recolección post mortem para maximizar la recuperación de los núcleos. Según la experiencia, un PMI de hasta 24 h permite una adecuada recuperación de los núcleos; sin embargo, un PMI de 12 h o menos es preferible para optimizar la recuperación de núcleos intactos...

La complejidad molecular de los astrocitos humanos sigue estando mal definida en el tejido primario, requiriendo mejores herramientas para su aislamiento y caracterización a alta resolución, tanto en salud como en enfermedad. La separación de las neuronas y glías humanas intactas de su nicho ha demostrado ser difícil debido al acceso limitado de muestras de tejido cerebral fresco, la naturaleza fuertemente interconectada de los procesos gliales y neuronales, y la inevitable activación celular durante el procesamiento, todo lo cual limita la caracterización molecular de estos tipos de células ex vivo1 . La clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS) ha surgido como una alternativa a la clasificación de células vivas, permitiendo la disociación e inmunoetiquetado de poblaciones de núcleos de tejido congelado. En la última década, FANS se ha utilizado ampliamente para aislar y caracterizar molecularmente poblaciones de núcleos neuronales humanos (NeuN +) en una variedad de especímenes cerebrales y regiones anatómicas 1,2,3,4.
Sin embargo, los métodos similares para aislar subpoblaciones específicas de núcleos gliales de la corteza humana han sido limitados, lo que lleva a una relativa falta de sofisticación en la comprensión de la complejidad de los astrocitos tanto en tejidos normales como enfermos. Para ello, se adaptó un protocolo previamente publicado para aislar poblaciones neuronales humanas utilizando FANS4, y se validó un método para enriquecer para astrocitos (y para progenitores oligodendrogliales) utilizando una combinación de triple anticuerpo, capturando astrocitos tanto en condiciones de reposo comoreactivas 5. Para enriquecer específicamente los astrocitos en la fracción NeuN-, se utilizaron anticuerpos contra uno de los dos factores de transcripción que se sabe que se expresan diferencialmente entre las poblaciones de astrocitos, PAX6 o factor de transcripción SRY-box 9 (SOX9)6,7. PAX6 se expresa altamente durante el desarrollo fetal temprano dentro de progenitores radiales similares a la glía en zonas germinales y contribuye tanto a la neurogénesis como a la gliogénesis 8,9,10,11, así como a la especificación neuronal retiniana12. En el adulto, PAX6 se sobreexpresa diferencialmente en astrocitos humanosen reposo 6 y muestra coexpresión proteica con proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en astrocitos tisulares de epilepsia humana13.
Este protocolo describe el aislamiento simultáneo de poblaciones de núcleos neuronales y astrocitos neocorticales por FANS. El tejido postmortem fresco (no fijo) congelado al instante (es decir, fresco congelado) recolectado de la corteza adulta primero se disocia mecánica y químicamente. Después de la lisis y la ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa, los componentes citoplasmáticos y extracelulares se descartan mientras que los núcleos se retienen. Los núcleos se etiquetan con anticuerpos nucleares conjugados fluorescentemente correspondientes a los linajes objetivo deseados y se clasifican utilizando FANS. Siguiendo este enfoque, el enriquecimiento de astrocitos se demuestra en las poblaciones PAX6 + NeuN- recolectadas, validado tanto por un panel de qPCR dirigido como por la secuenciación de ARN nuclear aguas abajo.

<table><tbody><tr><td>10x PBS pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>70013073</td><td></td></tr><tr><td>CLON DE ANTICUERPO ANTI-NEUN A60</td><td>Millipore</td><td>MAB377A5MI</td><td>ratón anti-NeuN conjugado con un compuesto fluorescente AF555 (excitación, 553 nm; emisión, 568 nm)</td></tr><tr><td>CLON DE ANTICUERPO ANTI-OLIG2 211</td><td>Millipore</td><td>MABN50A4MI</td><td>ratón anti-OLIG2 conjugado con un compuesto fluorescente AF488 (excitación, 499 nm; emisión, 520 nm)</td></tr><tr><td>Bovino albúmina sérica</td><td>Fisher</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento de línea brillante</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110V</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio anhidro</td><td>Fisher</td><td>C614-3</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células, 40 y micro; M</td><td>SP Scienceware</td><td>136800040</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DL-ditiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Library Kit</td><td>Illumina, Nextera</td><td>FC-121&ndash; 1030</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Trituradora de tejidos</td><td>WHEATON</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>FACS Clasificadora BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td>BD FACSAria III</td></tr><tr><td>Acetato de magnesio tetrahidratado</td><td>Fisher</td><td>M13-500</td><td></td></tr><tr><td>PAX6 (PAX6/496) - 100 PRUEBAS</td><td>Novus</td><td>NBP234705J</td><td></td></tr><tr><td>ARN Clean & Concentrador</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Solución de descontaminación de ARNasa</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Kit de secuenciación de ARN total trenzado Pico Input Mammalian</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635005</td><td>Tiempo de fragmentación de 2,5 minutos, como se recomienda para valores bajos de ARN RIN.</td></tr><tr><td>Sacarosa, certificación de cristal, ACS, 500 mg</td><td>Fisher</td><td>S5500</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor de cubeta oscilante</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, solución 1M, pH 8,0, grado de biología molecular, ultrapuro</td><td>Thermo Scientific</td><td>J22638AE</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td>tensioactivo no iónico en tampón de lisis</td></tr><tr><td>Reactivo</td> <td>TRIzol LSReactivo Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td> de <td>15596026</td><td>Invitrogen</td><td>para el aislamiento de ARN Solución de</td></tr><tr><td>azul de tripano, 0,4%</td><td>Ultracentrífuga 15250061</td><td></td><td></td>Gibco</tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter Optima XE-100</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga PP 9/16 X 3-1/2</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada ultrapura ( Libre de ARNasa, ADNasa)</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>conoce como agua destilada</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>ultrapura 15576-028</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de poblaciones adultas de astrocitos humanos de la corteza recién congelada utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

La complejidad de los astrocitos humanos sigue estando mal definida en el tejido humano primario, requiriendo mejores herramientas para su aislamiento y caracterización molecular. La clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS) se puede utilizar para aislar y estudiar con éxito las poblaciones de núcleos neuronales humanos (NeuN +) a partir de tejido de archivo congelado, evitando así problemas asociados con el manejo de tejido fresco. Sin embargo, faltan esfuerzos para aislar de manera similar la astroglía del elemento no neuronal (NeuN-). Una estrategia de inmunoetiquetado recientemente desarrollada y validada utiliza tres anticuerpos de factor de transcripción para aislar simultáneamente poblaciones de núcleos neuronales enriquecidos (NeuN+), astrocitos (proteína de caja pareada 6 (PAX6)+NeuN-) y progenitores de oligodendrocitos (OLIG2+NeuN-) de tejido neocórtex temporal humano no enfermo, fresco (no fijo) congelado al instante.
Esta técnica demostró ser útil para la caracterización de alteraciones del transcriptoma específico del tipo celular en neocórtex de epilepsia patológica primaria. Los análisis transcriptómicos confirmaron que las poblaciones clasificadas con PAX6 + NeuN- están sólidamente enriquecidas para marcadores de pan-astrocitos y capturan astrocitos tanto en condiciones de reposo como reactivas. Este artículo describe la metodología FANS para el aislamiento de poblaciones de núcleos enriquecidos con astrocitos de la corteza humana recién congelada, incluida la disociación de tejidos en suspensión de un solo núcleo (sn); inmunoetiquetado de núcleos con anticuerpos conjugados fluorescentemente anti-NeuN y anti-PAX6; Estrategias de cierre de FANS y métricas de control de calidad para optimizar la sensibilidad y la especificidad durante la clasificación y para confirmar el enriquecimiento de astrocitos; y la adquisición recomendada para la secuenciación de la accesibilidad al transcriptoma y la cromatina aguas abajo a resolución masiva o sn. Este protocolo es aplicable para especímenes corticales humanos no necróticos, recién congelados, con diversas patologías y recolección de tejido postmortem recomendada dentro de las 24 h.

Los núcleos se recolectaron a partir de tejido neocorte temporal fresco (no fijo) congelado con un tiempo de recolección postmortem de 12 h. Después de la disociación tisular en suspensión de núcleos, las muestras se incubaron con anticuerpos contra NeuN, PAX6 y OLIG2, y se clasificaron de acuerdo con el cierre que se muestra en la Figura 1 y la Figura 2. Se recolectaron núcleos de poblaciones ordenadas por NeuN+, PAX6+NeuN-, y OLIG2+NeuN- (...

Hemos desarrollado un método que enriquece y aísla poblaciones de astrocitos humanos a partir de tejido fresco congelado para su uso en análisis moleculares posteriores.

Aislamiento de poblaciones adultas de astrocitos humanos de la corteza recién congelada utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Este protocolo puede ayudar a los científicos que están interesados en estudiar la función molecular de los astrocitos humanos en su nicho nativo. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento y enriquecimiento de un tipo celular específico, astrocitos adultos a partir de muestras de tejido cerebral humano a granel utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia. Esta metodología se puede aplicar para aislar otros tipos de células de la neocorteza humana, como las neuronas y las células progenitoras de oligodendrocitos utilizando otros anticuerpos conjugados fluorescentes apropiados.Comience a diseccionar aproximadamente de 200 a 400 miligramos de tejido de una muestra fresca de tejido de corteza adulta humana congelada. Coloque el tejido en un douncer de tejido de vidrio de siete mililitros que contenga cuatro mililitros de tampón de lisis helado sobre hielo y moler el tejido aproximadamente 50 veces. Transfiera el homogeneizado a un tubo de polipropileno ultracentrífuga de 12 mililitros.Use una pipeta de cinco mililitros para agregar 6,5 mililitros de tampón de sacarosa helada al fondo del tubo de la ultracentrífuga sin perturbar la interfa

isolation-adult-human-astrocyte-populations-from-fresh-frozen-cortex

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este video, describimos el método para obtener una preparación pura de astrocitos de ratones recién nacidos.

Aislamiento de astrocitos: un método para obtener la preparación pura de astrocitos corticales de ratón

El video muestra un método simple para cultivar astrocitos murinos aislados de otras células cerebrales. Durante el cultivo, mediante el uso de medios específicos de astrocitos e inhibiendo la adherencia de células no astrocíticas, el método cultiva astrocitos de forma selectiva. Estos astrocitos cultivados exhiben una morfología estrellada con procesos finos.

Una técnica sencilla para aislar y cultivar astrocitos murinos

Este video muestra el procedimiento para aislar y clasificar núcleos de tejido cerebral humano recién congelado utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS), que permite el estudio de diferentes poblaciones celulares para diversas aplicaciones neurológicas.

Aislamiento de poblaciones celulares del tejido cerebral mediante la clasificación de núcleos activados por fluorescencia

Los astrocitos se han reconocido para ser versátiles células que participan en los procesos biológicos fundamentales que son esenciales para el desarrollo normal del cerebro y la función, y la reparación del sistema nervioso central. Aquí presentamos un procedimiento rápido para obtener cultivos puros de astrocitos de ratón para estudiar la biología de esta clase importante de centrales células del sistema nervioso.

Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

El protocolo AWESAM descrito aquí es óptimo para el cultivo de astrocitos murinos en aislamiento de otras células del cerebro de una manera rápida, sencilla y de bajo costo. Los astrocitos AWESAM exhibición espontáneo Ca2 + señalización, morfología y gene expresión perfiles similares a los astrocitos en vivo.

Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

Aquí describimos un método in vitro de imágenes en vivo para visualizar el transporte intracelular de orgánulos y el tráfico de proteínas de membrana plasmática en astrocitos murinos. Este protocolo también presenta una metodología de análisis de imágenes para determinar los itinerarios de transporte de carga y la cinética.

Visualización y análisis del transporte intracelular de organelos y otros Cargos en astrocitos

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

Aquí describimos un protocolo detallado para generar cultivos altamente enriquecidos de astrocitos derivados de diferentes regiones del sistema nervioso central de ratones postnatales y su conversión directa en neuronas funcionales por la expresión forzada de factores de transcripción.

Aislamiento y reprogramación neuronal directa de astrocitos de ratón

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos y microglía purificados de la médula espinal de ratones adultos, lo que facilita aplicaciones posteriores como el análisis de ARN y el cultivo celular. Incluye métodos detallados de disociación celular y procedimientos diseñados para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las células aisladas.

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Aprende a aislar poblaciones de núcleos de astrocitos adultos de corteza cerebral humana congelada mediante clasificación de núcleos activada por fluorescencia (FANS). Este protocolo permite obtener astrocitos de alta pureza para análisis transcriptómicos y de accesibilidad cromatínica en estudios de neurociencia.

Aislamiento de poblaciones adultas de astrocitos humanos de la corteza recién congelada utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de poblaciones adultas de astrocitos humanos de la corteza recién congelada utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia

Explorar más videos