Name: Sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3D a partir de células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a generar tejidos retinianos 3D a partir de células madre pluripotentes humanas mediante un protocolo optimizado que cuantifica el tamaño de cuerpos embrioides y la densidad de siembra para mejorar la reproducibilidad y eficiencia de la inducción retiniana sin ácido retinoico.

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Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional Clave de I + D de China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), el Fondo de Proyectos de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (201803010078), el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Guangdong (2017B020230003), la Fundación de Ciencias Naturales (NSF) de China (81570874, 81970842), el programa de talentos Hundred de la Universidad Sun Yat-sen (PT1001010) y los Fondos de Investigación Fundamental del Laboratorio Estatal Clave de Oftalmología.

1. Cultura y expansión de las hPSCs
<ol><li>Cultura HPSC
	<ol>
<li>Recubrimiento de dos pozos de una placa de 6 pozos con matriz extracelular (ECM, matriz calificada hESC). Preparar 50 ml de una solución de ECM que contenga 8-12 μg/mL de ECM en el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco. En 49 ml de DMEM, agregue 1 ml de la solución de material ECM descongelada (50x). Agregue 1 ml de la solución de ECM a cada pozo de una placa de 6 pozos. Incubarlo durante 1 h en una incubadora a 37 °C y 5% CO2.</li>
		<li>Prepare el medio de mantenimiento hPSC (MM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Precalentación de MM a temperatura ambiente (RT) durante 30 min.</li>
		<li>Descongelar un vial criogénico de hPSCs (hiPSCs o hESCs) (aproximadamente 1 x 10 6 ) de un tanque de nitrógeno líquidomedianteincubación en un baño de agua a 37 °C durante 30 s.</li>
		<li>Saque el vial y desinfecte cuidadosamente con un aerosol de alcohol desinfectante al 75%. Póngalo en un gabinete de bioseguridad.</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular del vial a un tubo de 15 ml, agregue 5 ml de MM precalentados gota a gota al tubo con una pipeta de 5 ml. Mientras tanto, agite suavemente el tubo para mezclar las hPSC.</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 170 x g durante 5 min. Retire la mayor parte del sobrenadante con una pipeta de 1 ml con cuidado y deje atrás aproximadamente 50 μL de sobrenadante para evitar la pérdida de las células.</li>
		<li>Agregue 1 ml de MM al tubo y vuelva a colocar el pellet canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo una o dos veces con una pipeta de 1 ml. NOTA: La supervivencia de células individuales de hPSCs es baja. Se prefieren grupos de células pequeñas con 3-5 células para mantener las hPSC creciendo en colonias.</li>
		<li>Retire la ECM de los pozos precubiertos (paso 1.1.1), agregue 1.5 ml de MM a cada pozo y luego distribuya 0.5 ml de suspensión celular por pozo.</li>
		<li>Agite suavemente la placa para distribuir las hPSC de manera uniforme y coloque la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2. No mueva la placa durante al menos 24 h para promover la adherencia celular.</li>
		<li>Cambiar MM cada dos días y pasar las hPSCs cuando la confluencia ha alcanzado alrededor del 80%.</li>
	</ol></li>
	<li>Paso de hPSCs NOTA: El mantenimiento del estado indiferenciado en hPSCs es bastante crítico para futuras aplicaciones. Bajo las condiciones adherentes, las hPSC crecen en colonias con un borde bien definido. Las células deben pasar cuando la confluencia de hPSCs alcanza aproximadamente el 80%.<ol>
<li>Observe las células bajo un microscopio. Marque y elimine mecánicamente las células diferenciadas claramente visibles (<5%) antes de pasar.</li>
		<li>Prepare la placa recubierta de ECM como se describe en el paso 1.1.1.</li>
		<li>Solución salina tampón de fosfato (PBS) precalentado MM y 1x sin Ca2+ y Mg2+ en RT.</li>
		<li>Precalenta la solución de EDTA de 0,5 mM (en 1x PBS) en un baño de agua a 37 °C.</li>
		<li>Retire el medio de la placa de cultivo utilizando un sistema de aspiración al vacío, agregue 1 ml de 1 pbS en cada pozo para lavar las células con una pipeta de 1 ml y repita dos veces.</li>
		<li>Añadir 1 ml de solución de EDTA por poto para disociar las hPSC en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO2 durante 5 min. No exceda el tiempo de incubación recomendado para evitar la disociación a células individuales.</li>
		<li>Saque la placa y verifique si hay un desprendimiento de células bajo un microscopio. Las hPSC confluentes se aflojan y se puede ver cada borde celular, pero las células no pueden desprenderse fácilmente agitando suavemente la placa celular.</li>
		<li>Retire la solución de EDTA con una pipeta de 1 ml y agregue 1 ml de MM para detener la disociación. Pipetee suavemente las hPSC una o dos veces con una pipeta de 1 ml para resuspend las células. No hay necesidad de centrifugar para recoger las células. NOTA: Si la mayoría de las células se desprenden de la placa después de la incubación con EDTA, las células se pueden recolectar por centrífuga.</li>
		<li>Retire la ECM de los pozos precubiertos (paso 1.2.2) y agregue 1,5 ml de MM por pozo.</li>
		<li>Transfiera 150-200 μL de grupos celulares a cada pozo. En general, las hPSC se pueden pasar en una proporción de 1:6. Por ejemplo, las células de un pozo de una placa de 6 pozos se pueden distribuir a seis pozos nuevos.</li>
		<li>Agite suavemente la placa para distribuir las hPSC de manera uniforme y cultite las hPSC en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 durante al menos 24 h sin tocar la placa.</li>
		<li>Cambie MM cada dos días como se describe en el paso 1.1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Diferenciación retiniana de las hPSC
NOTA: Cuando las colonias alcanzan ~80% de confluencia(Figura 1B),se pueden guiar para diferenciar en organoides retinianas siguiendo el protocolo esquematizado en la Figura 1A. Para garantizar que las hPSC tengan alta calidad y buen rendimiento, evalúe regularmente la pluripotencia con marcadores moleculares como OCT4 o NANOG utilizando IFC o QPCR. Las HPSC deben descartarse si las células diferenciadas representan más del 5% del total de células. Compruebe si hay contaminación por micoplasma con un kit de detección de micoplasma de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice solo hPSC libres de micoplasma, ya que el micoplasma puede alterar la capacidad de diferenciación de las hPSC.
<ol><li>Preparar medios y reactivos
	<ol>
<li>Prepare el medio de inducción neural (NIM) mezclando lo siguiente: 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL de suplemento de N2 al 1%, 0,5 mL de heparina al 0,1% (2 mg/mL en 1x PBS) y 5 mL de aminoácidos no esenciales (NEAA) al 1% de MEM.</li>
		<li>Preparar medio de diferenciación retiniana (RDM) que contenga 300 mL de DMEM/F-12, 200 mL de DMEM básico, 10 mL de suplemento de B27 al 2%, 5 mL de Antimicótico Antibiótico al 1%, y 5 mL de 1% de MEM NEAA. NOTA: Tanto NIM como RDM no se filtran, pero se realiza una prueba de esterilidad. Sacar 1 ml de medio y añadirlo a un plato de 35 mm, y cultivar durante 3-7 días en una incubadora a 37 °C y 5% CO2. El medio se puede almacenar a 4 °C y debe utilizarse en un plazo de 2 semanas para garantizar la actividad de los componentes.</li>
		<li>Preparar 10 mM blebbistatina (1.000x) en DMSO. Añadir 1.710 μL de DMSO para disolver 5 mg de Blebbistatin para obtener una solución stock de 10 mM (1.000x), alícuota a 10 μL/tubo y almacenar a -20 °C. NOTA: Todos los medios y reactivos deben calentarse a RT durante 30 minutos antes de su uso, a menos que se mencione lo contrario.</li>
	</ol></li>
	<li>Formación de cuerpos embrónidos (EB)
	<ol>
<li>En el día 0 (D0), inicie la diferenciación. Saque un pozo de hPSC de una placa de 6 pomos, que ha crecido a ~ 80% de confluencia. Recoger las células con solución de disociación de EDTA como se describe en los pasos 1.2.1 a 1.2.6.</li>
		<li>Retire la solución de EDTA, agregue 1 ml de MM que contenga 10 μM de blebbistatina para detener la disociación celular y recoja las células con una pipeta de 1 ml. El tamaño de los grupos celulares es uno de los factores clave que afectan el rendimiento de los EBs. Aproximadamente, se prefieren cinco celdas por grupo para producir el tamaño correcto de EBs en D5 a D7. NOTA: Este es un paso clave. No pipetee las células demasiadas veces, ya que los agregados similares a EB son difíciles de formar a partir de células individuales de hPSC.</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular (aproximadamente 2 x 106 células) a una placa de Petri de fijación ultra baja de 100 mm y agregue 9 ml de MM que contengan 10 μM de blebbistatina a la placa.</li>
		<li>Agite suavemente el plato dos veces para distribuir las células de manera uniforme y coloque el plato en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2.</li>
		<li>En D1, después de que las células se cultan durante al menos 24 h, saque el plato y obsérvelo bajo el microscopio. Un gran número de los agregados de células pequeñas se formarán espontáneamente en este momento(Figura 1C).</li>
		<li>Preparar 12 mL de mezcla con MM y NIM en una proporción de 3:1 (9 mL de MM y 3 mL de NIM) en un tubo de 15 mL.</li>
		<li>Transfiera los cultivos celulares a un tubo centrífugo de 15 ml con una pipeta de 10 ml perpendicularmente y agregue 10 ml de la mezcla precalentada al plato.</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 60 x g durante 3 min para recoger los agregados, retirar el sobrenadante con una pipeta de 5 ml y dejar unos 500 μL para evitar la pérdida de células.</li>
		<li>Añadir 2 ml de la mezcla al tubo y transferir la suspensión al mismo plato (paso 2.2.7).</li>
		<li>Agite suavemente el plato para distribuir uniformemente los agregados celulares y vuelva a colocar el plato en la incubadora.</li>
		<li>En D2, prepare 12 ml de una nueva mezcla con MM y NIM en una proporción de 1:1 (6 ml de MM y 6 ml de NIM) en un tubo de 15 ml. Cambie el medio celular con la mezcla fresca preparada repitiendo los pasos de 2.2.5 a 2.2.10.</li>
		<li>En D3, cambie el medio celular con 15 ml de NIM como se describió anteriormente. Culta las células durante al menos 5 días en las condiciones de suspensión. NOTA: Durante D1 a D3, el medio debe cambiarse cada día, proporcionando suficiente nutrición. Desde D3, NIM se puede cambiar cada dos días. Además, los EBs se pueden dividir en varios platos para proporcionar una nutrición abundante.</li>
	</ol></li>
	<li>Sembrar los EBs NOTA: En D5 a D7, elija un punto de tiempo apropiado para enchazar los EBs en los platos recubiertos de ECM de acuerdo con el tamaño de los EBs. Los EBs con un diámetro aproximado de 200 μm son apropiados para la diferenciación retiniana. En general, un pozo de hPSC en una placa de 6 pomos puede producir alrededor de 300 a 1,000 EBs. La variación del rendimiento de EB varía según las líneas hPSC.<ol>
<li>En D4, prepare platos recubiertos de ECM para el cultivo adherente de EBs. Agregue 5 ml de ECM a cada plato de cultivo de tejidos de 100 mm (tratado en superficie) y colócalos en la incubadora durante la noche.</li>
		<li>En D5, retire el ECM de los platos precubiertos y agregue 10 ml de NIM precalentados a cada plato.</li>
		<li>Saque el plato que contiene EBs. Compruebe la calidad de los EBs bajo el microscopio y asegúrese de que sean bastante brillantes y de forma redonda. El tamaño de los EBs es de aproximadamente 200 μm de diámetro. Recoja todos los EBs en un tubo de 15 mL. Transfiera los EBs de los platos a un tubo de 15 mL con una pipeta de 5 mL. Deje que los EBs se asienten durante 5 minutos. Retire la mayor parte del sobrenadante, dejando atrás unos 2 ml de medio.</li>
		<li>Distribuya los EBs en los platos recubiertos que contienen 10 mL de NIM gota a gota con una pipeta de 1 mL. Sembrar los EBs a una densidad de aproximadamente 2-3 EBs por cm2. Por ejemplo, agregue alrededor de 120-180 EBs en un plato de 100 mm. Para juzgar aproximadamente el número eb, coloque una gota de suspensión EB en un codazo y cuente el número de EB bajo el microscopio. NOTA: La densidad de recubrimiento de los EBs es uno de los factores clave que afectan la eficiencia de la inducción retiniana. La densidad también se puede ajustar por cada línea hPSC.</li>
		<li>Agite suavemente los platos para distribuir los EBs de manera uniforme. Póngalos en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2. NOTA: No mueva los platos durante al menos 24 h para mejorar la adherencia de los EBs.</li>
	</ol></li>
	<li>Inducción de vesículas ópticas (OM) y epitelio pigmentario retiniano (EPR) en condiciones adherentes NOTA: Después de que los EBs se siembran en la superficie recubierta de ECM, las hPSC pueden desarrollar estructuras similares a OV, que se pueden observar ya D20 después de la diferenciación. En este protocolo, no se requieren factores de crecimiento específicos o moléculas de señalización para guiar las hPSC en el destino de la retina, excepto la adición de suplementos de N2 y B27 en los medios.<ol>
<li>En D8-D9, retire los platos y observe los EBs bajo el microscopio. Todos los EBs se adjuntarán y extenderán en los platos (Figura 1D). Añadir 10 ml de NIM fresco a cada plato de 100 mm que contenga 10 ml de medio viejo. Vuelva a colocarlos en la incubadora. NOTA: No retire el medio antiguo.</li>
		<li>En D12, cambie la mitad del medio con NIM usando una pipeta de 10 ml. Mantenga la cultura en la incubadora.</li>
		<li>En D16, retire todo el NIM de los platos utilizando un sistema de aspiración al vacío. Añadir 20 ml de RDM a cada plato. Siga cultivando en RDM y cambie la mitad del medio cada dos días.</li>
		<li>Durante D10-D30, observe los cambios morfológicos de las células dos veces por semana bajo un microscopio y evalúe la eficiencia de la diferenciación retiniana. NOTA: Desde D10, los dominios de campo ocular (EF) se autoorganizan en las zonas periféricas de los AB adherentes. Las estructuras tipo OV aparecen entre D20 y D25, sobresalen gradualmente del plato y autoforman una copa óptica, que está rodeada por el RPE pigmentado(Figura 1E). Los OV se pueden reconocer fácilmente con el anillo NR brillante, refractivo y grueso.</li>
	</ol></li>
	<li>Separar y cultivar OVs y RPE en suspensión para obtener organoides retinianas (ROs)
	<ol>
<li>En D28-D35, la mayoría de los OV aparecen en los platos. Use una aguja de tungsteno o una aguja con una jeringa de 1 ml para separar mecánicamente los OV morfológicamente identificables junto con el RPE adyacente. Cultivarlos en suspensión. NOTA: La apariencia y el rendimiento de los OV y RPE varían ampliamente en las diferentes líneas de hPSC. Por lo tanto, el punto de tiempo de separación de OV y RPE es flexible. Los OV obvios con el RPE adyacente se pueden separar y luego mover a un plato de cultivo de baja fijación que contenga RDM. Siga cultivando el resto de las células hasta que se levanten todos los OV y RPO.</li>
		<li>Coloque 50-60 OVs en cada plato de cultivo de baja fijación de 100 mm que contenga 15 mL de RDM para la formación de ROs (Figura 1F).</li>
		<li>Cambie RDM cada 2-3 días hasta D42, cuando los ROs tienen una forma bien redonda.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Desarrollo y maduración de la retina
NOTA: En este protocolo, se requiere suero para mantener las ORO creciendo y madurando para el cultivo a largo plazo.
<ol><li>
Laminación retiniana y especificación en ROs
	<ol>
<li>Preparar 10 mL de taurina de 100 mM (1,000x) en 1x PBS. Pesar 125 mg de taurina, y disolver en 10 ml de 1x PBS. Filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm. Alícuota a 500 μL/tubo y conservar a -20 °C.</li>
		<li>Preparar el medio de cultivo de retina 1 (RC1). Mezcle los siguientes componentes: 250 mL de DMEM/F-12, 175 mL de DMEM básico, 50 mL de suero fetal bovino, 10 mL de suplemento de B27 al 2%, 5 mL de Antibiótico Antimicótico al 1%, 5 mL de 1% DE MEM NEAA, 0,5 mL de taurina de 100 μM y 5 mL de 2 mM de L-alanil-L-glutamina.</li>
		<li>Preparar el medio de cultivo de retina 2 (RC2) que contenga 450 mL de DMEM/F-12, 50 mL de suero fetal bovino, 5 mL de suplemento de N2 al 1%, 5 mL de 1% antimicótico antibiótico, 0,5 mL de taurina de 100 μM, 5 mL de MEM NEAA al 1% y 5 mL de L-alnil-L-glutamina. NOTA: El RC1 y el RC2 no se filtran, sino que se someten a una prueba de esterilidad. Saque 1 ml de medio, agréguelo a un plato de 35 mm y cultúe durante 3-7 días en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2,para garantizar la esterilidad antes de su uso. El medio se puede almacenar a 4 °C y debe utilizarse en un plazo de 2 semanas para garantizar la actividad de los componentes. Todos los medios y reactivos deben calentarse previamente a RT durante 30 minutos antes de su uso.</li>
		<li>En D42, cambie el medio de cultivo de RDM a RC1.</li>
		<li>Incline los platos a unos 30° y deje que los ROs se asienten durante 30 s. Retire el RDM antiguo con una pipeta de 10 ml dejando aproximadamente 1 ml de medio para evitar la pérdida de ROs. Añadir 15 ml de RC1 fresco a cada plato.</li>
		<li>Agite suavemente los platos para distribuir los ROs de manera uniforme. Vuelva a poner los platos en la incubadora. Cambie todo el medio dos veces por semana a partir de entonces.</li>
		<li>Durante D50-D90, seleccione ROs de alta calidad para cultivo a largo plazo, que son de forma redonda con un NR grueso y brillante. Coloque 30-40 ROs en un plato de fijación baja de 100 mm con 20 ml de RC1, y cambie todo el medio dos veces por semana.</li>
		<li>Para el cultivo de suspensión a largo plazo de los RO, pipetee los RO para evitar la reencayes ro-RO utilizando una pipeta. Transfiera las ROs a nuevos platos de cultivo una vez al mes para evitar que las ROs se peguen a la superficie de los platos. NOTA: Bajo las condiciones de cultivo de suspensión, los OR son de forma redonda, con un anillo NR brillante y grueso unido con más o menos RPE en un lado. La retina neural laminada se desarrolla y los subtipos de células retinianas aparecen secuencialmente con células ganglionares retinianas generadas por primera vez, seguidas de células fotorreceptoras, células amacrinas y células bipolares.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maduración de fotorreceptores humanos con enriquecimiento de conos en RE
	<ol>
<li>Después de D90, cambie el medio de RC1 a RC2, que es adecuado para la maduración de fotorreceptores.</li>
		<li>Cambie el medio como se describe en los pasos 3.1.7 a 3.1.8. NOTA: Bajo esta condición de cultivo, los RU pueden crecer a largo plazo(Figura 1G),hasta D300 probado. Las células retinianas en los CO maduran, y todos los subtipos celulares de retina neural, incluidas las células gliales muller, los bastones y los conos también se adquieren. Sin ninguna adición de AR, los fotorreceptores de cono también son ricos en ROs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Carcamo-Orive, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transcriptional+variability+in+a+large+human+ipsc+library+reveals+genetic+and+non-genetic+determinants+of+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).</li>
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</ol>

Xiufeng Zhong es el inventor de patentes relacionado con la generación de células retinianas a partir de células madre pluripotentes humanas.

En este protocolo de inducción retiniana de varios pasos, las hPSC se guiaron paso a paso para obtener el destino de la retina y se autoorganizaron en organoides retinianas que contenían NR y RPE laminados. Durante la diferenciación, las hPSC recapitularon todos los pasos principales del desarrollo de la retina humana in vivo,desde EF, OV y RPE, hasta la laminación retiniana, generando todos los subtipos de células retinianas, incluidas las células ganglionares de la retina, las células amacrinas, las células bi...

Las enfermedades degenerativas de la retina (PR), como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la retinosis pigmentaria (RP), se caracterizan por la disfunción y la muerte de las células fotorreceptoras y, por lo general, conducen a una pérdida irreversible de la visión sin formas efectivas de curar1. El mecanismo subyacente a estas enfermedades es en gran parte desconocido en parte debido a la falta de modelos de enfermedades humanas2. En las últimas décadas, se han logrado avances significativos en la medicina regenerativa a través de la tecnología de células madre. Muchos investigadores, incluyéndonos a nosotros mismos, hemos demostrado que las células madre pluripotentes humanas (hPSC), incluidas las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), pueden diferenciarse en todos los tipos de células retinianas, incluso en tejidos mini-retinianas a través de diversos enfoquesde diferenciación3,4,5,6,7,8,9,10, 11, proporcionando un enorme potencial en el modelado de enfermedades y la terapia celular12,13,14.
Sin embargo, el proceso de inducción de las hPSC a las células de la retina es muy complicado y requiere mucho tiempo con baja repetibilidad, lo que requiere investigadores con una rica experiencia y altas habilidades. Durante el proceso de inducción complejo y dinámico, una serie de factores afectarán el rendimiento de los tejidos de la retina15,16,17. Además, los diferentes métodos de inducción a menudo varían considerablemente en el tiempo y la expresión robusta de los marcadores retinianas, lo que podría confundir la recolección de muestras y la interpretación de datos3. Por lo tanto, un protocolo directo de diferenciación retiniana de las hPSC con orientación paso a paso estaría en demanda.
Aquí, en base a nuestros estudios publicados18,19,20,21,se describe un protocolo de inducción retiniana optimizado para generar organoides retinianas (RO) con ricos fotorreceptores de cono a partir de hPSCs, que no requiere el suplemento de ácido retinoico (AR). Este protocolo se centra en la descripción del método de varios pasos para generar retina neural y RPE. La formación de EB es la parte esencial de la etapa de inducción temprana. Tanto el tamaño como la densidad de recubrimiento de los EBs están optimizados cuantitativamente, lo que mejora científicamente el rendimiento de los tejidos de la retina y promueve la repetibilidad. En la segunda parte de la inducción, las vesículas ópticas (OVs) se autoorganizan en el cultivo de adherencia y las ROs forman en el cultivo de suspensión; los cursos de tiempo y las eficiencias de esta parte varían considerablemente en las diferentes líneas de hPSC. La maduración y especificación de las células de la retina en las OR ocurren principalmente en la etapa media y tardía de la inducción. Sin la adición de AR, se pueden producir fotorreceptores maduros con conos y bastones ricos.
El propósito de este protocolo es describir cuantitativamente y detallar cada paso para que los investigadores inexpertos lo repitan. Varias líneas de hPSC han sido inducidas con éxito en ROs por este protocolo con un rendimiento robusto de tejidos retinianas ricos en conos y alta repetibilidad. Las ROs derivadas de HPSCs con este protocolo pueden recapitular los principales pasos del desarrollo de la retina in vivoy sobrevivir a largo plazo, lo que facilita las aplicaciones posteriores, como el modelado de enfermedades, la detección de medicamentos y la terapia celular.

<table><tbody><tr><td>(&menos;)-Blebbistatina</td><td>Sigma</td><td>B0560-5mg</td><td>ROCK-inhibidor 1</td></tr><tr><td>ml puntas</td><td>Kirgen</td><td>KG1313</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>10 ml Pipeta</td><td>Sorfa</td><td>3141001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Cultivo de tejidos</td><td>BIOFIL</td><td>TCD000100</td><td>100 mm Placa de Petri</td></tr><tr><td>100 mm Cultivo de tejidos</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm Placa de Petri</td></tr><tr><td>15 ml Tubos de centrífuga</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td>Tubos de centrífuga de</td></tr><tr><td>35 mm Placas de cultivo de tejidos</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>de 35 mm Placa de Petri</td></tr><tr><td>Pipeta de 5 ml</td><td>Sorfa</td><td>313000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de 50 ml Tubos de centrífuga</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td>Tubos de centrífuga</td></tr><tr><td>6 pocillos Placas de cultivo de tejidos</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Placas de cultivo</td></tr><tr><td>Anti-AP2&alpha; Anticuerpo</td><td>DSHB</td><td>3b5</td><td>Primario&nbsp; anticuerpo</td></tr><tr><td>ANTIBIÓTICO ANTIMICÓTICO 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Antibiótico-Antimicótico</td></tr><tr><td>Anti-ISL1 Anticuerpo</td><td>Boster</td><td>BM4446</td><td>Primario&nbsp; anticuerpo</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 Anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Primario&nbsp; anticuerpo</td></tr><tr><td>Anti-L/M opsina Regalo de anticuerpos</td><td>del Dr. jeremy</td><td>/</td><td>Primary&nbsp; anticuerpo</td></tr><tr><td>Anti-PAX6 Anticuerpo</td><td>DSHB</td><td>pax6</td><td>Primario&nbsp; anticuerpo</td></tr><tr><td>Anti-conejo 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td>Burro anti-Conejo IgG (H+L) Anticuerpo Secundario, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-Recoverina Anticuerpo</td><td>Millipore</td><td>ab5585</td><td>Primario&nbsp; anticuerpo</td></tr><tr><td>Anti-rodopsina Anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab5417</td><td>Primario&nbsp; anticuerpo</td></tr><tr><td>Anti-ovejas 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21436</td><td>Burro anti-ovejas IgG (H+L) Anticuerpo Secundario, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-SOX9</td><td>Abclonal</td><td>A19710</td><td>Primario&nbsp; anticuerpo</td></tr><tr><td>Anti-VSX2 Anticuerpo</td><td>Millipore</td><td>ab9016</td><td>Primario&nbsp; anticuerpo</td></tr><tr><td>B-27 suplemento W/O VIT A (50X)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>Suplemento</td></tr><tr><td>Cryotube</td><td>vial Thermo scientific-NUNC</td><td></td><td>375418 1,8 ml</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>DOJINDO</td><td>D532</td><td>4',6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato; múltiples proveedores</td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetilo (DMSO) Hybri-max</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td>Múltiples proveedores</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Medio</td></tr><tr><td>DMEM /F12</td><td>Gibco</td><td>C11330500BT</td><td>Medio</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>0.5 M PH 8.0</td></tr><tr><td>FBS</td><td>NATOCOR</td><td>SFBE</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Suero</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22&mu; m, filtro Millex estéril</td></tr><tr><td>GlutaMax, 100X</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-alanil-L-glutamina</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>2 mg/ml en PBS para usar</td></tr><tr><td>Matrigel, 100x</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matriz extracelular (ECM)</td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM NEAA</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEM CELL</td><td>85850</td><td>hPSCs medio de mantenimiento (MM)</td></tr><tr><td>Suplemento de N2</td><td>Gibco</td><td></td><td>17502048 Suplemento</td></tr><tr><td>Tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>GNM</td><td>GNM10010</td><td>Sin Ca+,Mg+,PH7.2&plusmn; 0.1 0.1M</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td>Suplemento</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de fijación ultra baja Placa de Petri de 100 mm, placa de</td><td>Petri Corning</td><td>CLS3262-20EA</td><td></td> de fijación baja</tr></tbody></table>

sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3d a partir de células madre pluripotentes humanas

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Las enfermedades degenerativas de la retina son las principales causas de ceguera irreversible sin un tratamiento eficaz. Las células madre pluripotentes que tienen el potencial de diferenciarse en todo tipo de células de la retina, incluso los tejidos mini-retinianas, tienen grandes promesas para los pacientes con estas enfermedades y muchas oportunidades en el modelado de enfermedades y la detección de fármacos. Sin embargo, el proceso de inducción de las hPSC a las células de la retina es complicado y requiere mucho tiempo. Aquí, describimos un protocolo de inducción retiniana optimizado para generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y eficiencia, adecuados para diversas células madre pluripotentes humanas. Este protocolo se realiza sin la adición de ácido retinoico, lo que beneficia el enriquecimiento de los fotorreceptores de cono. La ventaja de este protocolo es la cuantificación del tamaño de EB y la densidad de recubrimiento para mejorar significativamente la eficiencia y la repetibilidad de la inducción retiniana. Con este método, todas las principales células de la retina aparecen secuencialmente y recapitulan los principales pasos del desarrollo de la retina. Facilitará las aplicaciones posteriores, como el modelado de enfermedades y la terapia celular.

El proceso de inducción de la retina en este protocolo imita el desarrollo de la retina fetal humana. Para iniciar la diferenciación retiniana, las hPSC se disociaron en pequeños grupos y se cultivaron en suspensión para inducir la formación de EBs. En D1, se formaron los agregados celulares uniformados o EBs(Figura 1C). El medio de cultivo se transformó gradualmente en NIM. En D5, los EBs se colocaron en los platos de cultivo recubiertos de ECM. Las células migraron gradualmente fuera de lo...

Aquí describimos un sistema optimizado de inducción organoide retiniana, que es adecuado para varias líneas de células madre pluripotentes humanas para generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y eficiencia.

Sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3D a partir de células madre pluripotentes humanas

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

El proceso de inducción de las hPSC a las células de la retina es complicado y requiere mucho tiempo. Este protocolo optimizado puede generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y sin costo. La ventaja de este protocolo es la cuantificación del tamaño de EB y la densidad de recubrimiento para mejorar significativamente la eficiencia y repetibilidad de la inducción retiniana a partir de hPSC.Con este método, todas las principales células de la retina aparecen secuencialmente y recapitulan los principales pasos del desarrollo de la retina. Facilitará el modelado de enfermedades y la terapia celular para enfermedades degenerativas de la retina. Demostrando el procedimiento, estamos con Yuanyuan Guan, un estudiante de doctorado, y Bingbing Xie, un técnico del laboratorio.Comience preparando 50 ml de solución de ECM agregando 1 ml de la tercera solución de stock 50 veces a 50 ml de DMEM. Luego, agregue 1 ml de esta solución de ECM preparada a cada pozo de una placa de seis pozos e incube durante una hora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Prepare el medio de mantenimiento hPSC de acuerdo con las instrucciones del fabricante y precalentarlo a temperatura ambiente durante 30 minutos.Vierta un vial criogénico de hPSCs de un tanque de nitrógeno líquido incubándolo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 segundos. Desinfecte cuidadosamente con un aerosol de alcohol al 75% y colóquelo en un gabinete de bioseguridad. Transfiera la suspensión celular del vial a un tubo de 15 milímetros.Luego, agregue 5 ml de medio de mantenimiento precalentado gota a gota al tubo con una pipeta de 5 ml, mientras agita suavemente el tubo para mezclar las hPSC. Centrifugar el tubo a 170 veces G durante cinco minutos. Retire cuidadosamente la mayor parte del sobrenadante con una pipeta de 1 ml, dejando aproximadamente 50 microlitros de sobrenadante para evitar la pérdida de las células.Vuelva a suspender el pellet con 1 ml de medio de mantenimiento mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Retire el ECM de los pozos pre-recubiertos y agregue 1.5 mililitros de medio de mantenimiento a cada pozo. Luego distribuya 0.5 mililitros de suspensión celular en cada pozo.Agite suavemente la placa para distribuir las hPSC de manera uniforme. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante al menos 24 horas para promover la adherencia celular. Cambie de medio todos los días y pase hPSCs al 80% de confluencia.En el día 0, inicie la diferenciación eliminando el 80% de las células de confluencia de un pozo de la placa de seis pozos. Recoja las celdas con la solución de disociación EDTA como se describe en el manuscrito de texto. Retire la solución de EDTA y agregue 1 ml de medio de mantenimiento que contenga 10 fluvastatina micromolar para detener la disociación celular.Recoge las celdas con una pipeta de 1 ml. Transfiera la suspensión celular a una placa de Petri ultra baja de 100 milímetros y agregue 9 ml de medio de mantenimiento que contenga 10 fluvastatina micromolar a la placa. Agite suavemente el plato dos veces para distribuir las células de manera uniforme.Luego, colóselo en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de que las células se cultan durante al menos 24 horas, obsérese bajo el microscopio. Agregue 9 ml de medio de mantenimiento y 3 ml de NIM a un tubo de 15 ml.Transfiera los cultivos celulares a un tubo centrífugo de 15 ml y agregue 10 ml de la mezcla NIM precalentada al plato. Centrifugar el tubo a 60 veces G durante 3 minutos para recoger los agregados. Luego retire el sobrenadante con una pipeta de 5 ml, dejando aproximadamente 500 microlitros para evitar la pérdida de células.Agregue 2 ml de la mezcla al tubo y transfiera la suspensión a la misma placa de Petri. Agite suavemente el plato para distribuir uniformemente los agregados celulares. Luego, vuelva a colocar el plato en la incubadora.El día 5, retire el ECM de los platos precubiertos y agregue 10 ml de NIM precalentados a cada plato. Saque el plato que contiene Ebs y verifique la calidad de los EB bajo el microscopio, asegurándose de que sean brillantes y redondos. Recoge todos los EBs en un tubo de 15 mL y deja que se asienten durante 5 minutos.Luego, retire la mayor parte del sobrenadante, dejando atrás aproximadamente 2 ml de medio. Después de contar los EBs, sembrarlos gota a gota a una densidad de aproximadamente 2-3 EBs por centímetro cuadrado en platos recubiertos que contengan 10 mL de NIM. Agite suavemente los platos para distribuir los EBs de manera uniforme y colótelos en la incubadora durante al menos 24 horas.Use una aguja de tungsteno o una aguja con una jeringa de 1 ml para separar mecánicamente las vesículas ópticas morfológicamente identificables, junto con el epitelio pigmentario retiniano adyacente en los días 28 a 35. Cultivarlos en suspensión. Coloque 50-60 vesículas ópticas en cada plato de cultivo de baja fijación de 100 milímetros, que contenga 15 ml de RDM para la formación de organoides retinianas.Cambie el medio cada 2 a 3 días hasta el día 42. Para iniciar la diferenciación retiniana, las hPSC se disociaron en pequeños grupos y se cultivaron en suspensión, que formaron EBs desde el día 1. En el día 5, los EBs se colocaron en los platos de cultivo recubiertos de ECM y las células migraron gradualmente fuera de los EBs.En el día 16, el medio de inducción fue reemplazado por RDM, haciendo que los dominios de la retina neural se formaron y sobresaliendo gradualmente del plato, así como estructuras similares a vesículas ópticas formadoras de células rodeadas de células RPE. Durante los días 28 a 35, los organoides retinianas que consisten en la retina neural, unidos a una esfera de RPE. En un lado, se formaron células.A medida que avanzaba la diferenciación y especificación de la retina, las hPSC produjeron subtipos de retina neural que gradualmente se alinearon en capas, imitando las características arquitectónicas de una retina humana nativa. Las células ganglionares de la retina se generaron por primera vez a partir de progenitores retinianas y se acumularon en el lado basal de la neurotiniana. Con este protocolo, los organoides de la retina se convirtieron en fotorreceptores altamente maduros con bastones y conos ricos.Las células fotorreceptoras se localizaron en el lado apical, mientras que las células amacrinas, las células horizontales, las células bipolares y las células gliales muller se localizaron en la capa intermedia de la retina neural. Los puntos clave de este protocolo son crear Ebs de alta calidad y sembrarlos a la densidad correcta.

retinal-organoid-induction-system-for-derivation-3d-retinal-tissues

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La producción de células especializadas de la retina de células madre pluripotentes es un punto de inflexión en el desarrollo de la terapia basada en células madre para enfermedades de la retina. El presente trabajo describe un método sencillo para una generación eficiente de organoides de retina y epitelio pigmentado retiniano para investigación básica, traslacional y clínica.

Alimentador-libre las condiciones de cultivo para la generación de humanos derivados de iPSC de modelos de celulares de retina y definido sin Xeno

Aquí presentamos un protocolo paso a paso para generar organoides retinianos humanos maduros y utilizarlos en un ensayo de toxicidad de fotorreceptores para identificar candidatos farmacéuticos para la enfermedad degenerativa de la retina relacionada con la edad telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).

Pruebas de toxicidad en organoides retinianos humanos para el descubrimiento farmacéutico

Utilizando un método de autoorganización, desarrollamos un protocolo con la adición de COCO que podría aumentar significativamente la generación de fotorreceptores.

Inducción dirigida de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes humanas

Este protocolo describe un método eficiente para diferenciar las hiPSC en grupos de campo ocular y generar organoides neurorretinianos utilizando condiciones de cultivo simplificadas que involucran sistemas de cultivo adherentes y en suspensión. Otros tipos de células oculares, como el EPR y el epitelio corneal, también se pueden aislar de campos oculares maduros en cultivos de retina.

Generación de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes sanas y específicas de la enfermedad retiniana inducida por humanos

El presente protocolo describe un sistema de inducción neuronal de retina 3D optimizado que reduce la adhesión y fusión de organoides retinianos con alta repetibilidad y eficiencia.

Generación de retina neural a partir de células madre pluripotentes humanas

La microglía es una célula inmunitaria residente única en la retina que desempeña un papel crucial en diversas enfermedades degenerativas de la retina. La generación de un modelo de cocultivo de organoides retinianos con microglía puede facilitar una mejor comprensión de la patogénesis y el progreso del desarrollo de las enfermedades de la retina.

Ensamblaje de organoides de la retina con microglía

Este protocolo combina el aclaramiento óptico y el inmunomarcaje para obtener imágenes confocales de volumen completo de organoides de retina de montaje completo. Preserva la estructura 3D, lo que permite una visualización detallada de las vías neuronales clave, mejorando el estudio de la maduración de la retina, la organización espacial y sus posibles aplicaciones en el modelado de enfermedades y la medicina personalizada.

Visualización de organoides retinianos de montaje completo con resolución celular

El artículo describe una técnica simplificada para extirpar la córnea y la retina para destripar los tejidos del globo ocular de donantes cadavéricos humanos. La técnica descrita aquí ayudará a tejidos especiales de buena calidad para ser utilizadas para el trasplante, con fines quirúrgicos o de investigación, sin dañar otros tejidos del globo ocular.

Una técnica simplificada para<em&gt; In situ</em&gt; La escisión de la Córnea y la evisceración del tejido de la retina del globo ocular humano

El método se describe el aislamiento y caracterización de células humanas de la Pulpa Dental madre (hDPSCs) mediante el uso de cualquiera de los...

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Utilizamos muestras de la retina de retinectomía para un análisis transcriptomic de desprendimiento de retina. Hemos desarrollado un procedimiento que permite la conservación de RNA entre los bloques quirúrgicos y el laboratorio. Se estandarizó un protocolo para purificar el ARN mediante ultracentrifugación en cloruro de cesio para asegurar que los ARN purificados son adecuados para el análisis de microarrays.

Análisis Transcriptomic de especímenes quirúrgicos retina humana usando Diario

Aprenda a generar tejidos retinianos 3D a partir de células madre pluripotentes humanas mediante un protocolo optimizado que cuantifica el tamaño de cuerpos embrioides y la densidad de siembra para mejorar la reproducibilidad y eficiencia de la inducción retiniana sin ácido retinoico.

Sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3D a partir de células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal

Sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3D a partir de células madre pluripotentes humanas

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