Análisis de seguimiento de nanopartículas para la cuantificación y determinación del tamaño de vesículas extracelulares

Los resultados de NTA son muy propensos al sesgo del operador. Este protocolo demuestra los efectos de los parámetros NTA alterados sobre los resultados obtenidos. Un método estandarizado ayudará a aumentar el rigor y la reproducibilidad en el análisis de NTA.

El análisis de la muestra en una cubeta permite capturar una muestra estadísticamente aleatoria en cada video. Esto da como resultado datos más reproducibles y la visualización de partículas en una amplia gama de tamaños. Como obtener una muestra en el rango de concentración de partículas recomendado puede ser difícil, asegúrese de realizar una dilución en serie para identificar el factor de dilución ideal.

Demostrando el procedimiento estará Kungheng Cai, un estudiante de doctorado del laboratorio de Anthony Ferrante. Para preparar la cubeta para el análisis de seguimiento de nanopartículas, cubra el espacio de trabajo con un material libre de pelusa para evitar que las fibras entren en las cubetas. Usando guantes, coloque una cubeta que contenga una barra de agitación sobre la plantilla de cubeta magnética.

Utilice una herramienta de gancho para colocar el inserto en la cubeta con la muesca del inserto visible en la parte frontal de la cubeta. Use una pipeta para agregar lentamente de 400 a 500 microlitros de vesículas extracelulares purificadas en la cubeta a través del orificio en el inserto y mezcle la muestra pipeteando suavemente sin introducir burbujas de aire, luego cúbrala, golpeando las burbujas según sea necesario y use un paño sin pelusa para limpiar la superficie exterior de la cubeta. Para analizar la concentración de partículas del diluyente o una muestra, encienda la estación de trabajo y el instrumento de la computadora e inicie el programa de análisis de seguimiento de partículas.

Cuando se le solicite, haga clic en NTA y abra la pestaña de grabación. Siga las instrucciones en pantalla para completar toda la información de muestra necesaria. Para el análisis de seguimiento de EV, establezca el diluyente en PBS.

La salinidad se rellenará automáticamente al 9% Para obtener la concentración de diluyente o partícula de muestra, abra la tapa del instrumento y retire la tapa protectora que cubre donde se colocará la cubeta. Cargue la cubeta en el instrumento en la orientación correcta con la muesca del inserto mirando hacia la cámara y reemplace la tapa y la tapa del instrumento. Haga clic en la flecha de transmisión para encender la cámara y haga clic en la flecha de chevron para expandir la configuración de grabación.

Ajuste el enfoque hasta que las partículas relativamente pequeñas sean claramente visibles. Para establecer el análisis para una pequeña cuantificación de EV, establezca la velocidad de fotogramas en 30 fotogramas por segundo, la exposición a 15 milisegundos, el tiempo de agitación a cinco segundos, el tiempo de espera a tres segundos, las potencias del láser azul, verde y rojo a 210, 12 y 8 milivatios respectivamente, los fotogramas por video a 300 y la ganancia a 30 decibelios. Ajuste el enfoque hasta que las partículas relativamente pequeñas sean claramente visibles.

Aumentar el zoom y / o la ganancia puede ayudar con el enfoque de partículas. Pero si aumenta la ganancia, recuerde establecerla en 30 decibelios antes de grabar. Una vez que las partículas estén enfocadas, configure la configuración de zoom en 0.5X para ahorrar ancho de banda y evitar la pérdida de fotogramas y haga clic en grabar para comenzar a grabar el video.

Cuando aparezca un mensaje que indique que los videos se han grabado, haga clic en Aceptar para completar la grabación y seleccione la pestaña de proceso. Si las partículas muy grandes eran visibles en cualquier video durante la grabación, navegue hasta el directorio de videos grabados y elimine cualquier video problemático antes de procesarlo. Marque la casilla deshabilitar la anulación de detección de audio y establezca el diámetro de la función en 30.

Haga clic en proceso para iniciar el procesamiento de video y ver un gráfico de distribución en vivo. Cuando se complete el procesamiento, haga clic en Aceptar y seleccione la pestaña de trazado. Para los vehículos eléctricos, muestre el gráfico principal como sílice de contenedor de registro.

Otras características del gráfico, como cambiar el eje x para establecer el área para la integración de la figura producida, se pueden personalizar. Para crear un informe PDF de los resultados, haga clic en el botón informe. Se mostrarán la media, la mediana, el tamaño del modo y la concentración ajustada para el factor de dilución y el ancho de distribución.

El NTA del diluyente debe realizarse antes de cualquier muestra para que la concentración de este espacio en blanco se pueda restar de la concentración de partículas de la muestra EV. Para limpiar las cubetas después del análisis, vacíe la cubeta y llene completamente las cubetas de 10 a 15 veces con agua desionizada y las tres veces con 70 a 100% de etanol para eliminar cualquier muestra residual. Seque el exterior de las cubetas con un paño de microfibra sin pelusa y seque el interior con un plumero de aire comprimido.

Para limpiar los insertos y remover las barras, coloque los materiales en un vial de centelleo de vidrio que contenga de 70 a 100% de etanol y agite el vial vigorosamente. Luego enjuague los insertos y revuelva las barras en agua desionizada con agitación como se ha demostrado y séquelas con paños sin pelusa. Después del secado, coloque inmediatamente todos los componentes limpios en el almacenamiento hasta el siguiente análisis.

Antes de realizar un análisis, la calibración del instrumento se probó utilizando perlas de poliestireno para garantizar la validez de los datos adquiridos. Como se observó, el instrumento de seguimiento de partículas informó con precisión el tamaño de las cuentas de manodisperse de 100 nanómetros, pero solo informó de cerca el tamaño de las cuentas de 400 nanómetros. Por lo tanto, la configuración del instrumento para este protocolo fue más precisa para partículas más pequeñas, más cercanas a los 100 nanómetros de tamaño.

Utilizando estos ajustes, se informó de las escalas de concentración de partículas en consecuencia con el factor de dilución, lo que demuestra que el instrumento puede detectar con precisión la concentración de partículas en varias diluciones con poca variabilidad entre los replicantes técnicos. Se determinó que la dilución óptima para una muestra ev derivada de tejido de 4,41 veces 10 a 10 por mililitro de ratón entre 1.000 y 3.000. En este análisis, el aumento de la ganancia aumentó la sensibilidad de la cámara, lo que permitió un aumento en la visualización de un mayor número de partículas más pequeñas.

El aumento de la potencia del láser azul de 70 a 210 milivatios mientras se mantenía constante la potencia del láser verde y rojo cambió el tamaño promedio de partícula reportado de 122 a 105 nanómetros y aumentó la concentración total de partículas reportada de 1.1 veces 10 a la octava a 1.7 veces 10 a la octava. El aumento de la potencia del láser rojo aumentó el tamaño promedio de partícula reportado de 175 a 246 nanómetros y disminuyó la concentración total de partículas reportada. El aumento de la potencia del láser verde resultó en una disminución en el tamaño promedio de partícula reportado y un aumento en la concentración total de partículas reportada.

Encontrar la dilución correcta para colocar una muestra dentro del rango de detección óptimo puede tomar algunos intentos para cada muestra. La limpieza de la cubeta también requiere un manejo muy cuidadoso. Recomendamos aplicar más de un método ortogonal para las mediciones de tamaño y concentración de partículas EV.

La dispersión dinámica de la luz, la detección de pulsos resistivos, la microscopía electrónica de transmisión y la detección de imágenes de reflectancia interferométrica de una sola partícula también se pueden realizar para caracterizar los vehículos eléctricos.