Name: Análisis de seguimiento de nanopartículas para la cuantificación y determinación del tamaño de vesículas extracelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprende a cuantificar y determinar el tamaño de vesículas extracelulares mediante análisis de seguimiento de nanopartículas. Este protocolo estandarizado reduce el sesgo del operador y mejora la reproducibilidad en la investigación de EVs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Reconocemos a Jeffrey Bodycomb, Ph.D. de HORIBA Instruments Incorporated por su ayuda en la calibración del instrumento.

<ol><li>Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li>
<li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+%28exosomes%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li>
<li>Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages%3A+for+good+or+for+bad%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li>
<li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2, 1800021(2018).</li>
<li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+%28EVs%29+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li>
<li>Erdbrügger, U., Lannigan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+challenges+of+extracellular+vesicle+detection%3A+A+comparison+of+different+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Extracellular+Vesicles%3A+General+Methodologies+and+Latest+Trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).</li>
<li>Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).</li>
<li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).</li>
<li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569(2017).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li>
<li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421(2012).</li>
<li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+Research%22%5BJournal%5D)">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li>
<li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li>
<li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li>
<li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li>
<li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li>
<li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li>
<li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).</li>
<li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+%28NTA%29+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li>
<li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016(2019).</li>
<li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li>
<li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li>
<li>Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li>
<li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohren%2C+CF+%22Absorption+and+Scattering+of+Light+by+Small+Particles%22">Absorption and Scattering of Light by Small Particles</a>. , John Wiley & Sons. (1983).</li>
</ol>

Todos los autores declararon que no hay conflictos de intereses.

Aquí, demostramos un protocolo para NTA de EV para medir la distribución de tamaño de una amplia gama de tamaños de partículas simultáneamente y medir la concentración total de EV en una muestra polidispersa. En este estudio, se utilizó tejido adiposo perigonadal de ratón y plasma humano como fuente de vehículos eléctricos. Sin embargo, los VEHÍCULOS eléctricos aislados de otros tejidos o fluidos biológicos como suero, orina, saliva, leche materna, líquido amniótico y sobrenadante de cultivo celular también se pueden usa...

Las vesículas extracelulares (VE) son pequeñas (0,03-2 μm) vesículas unidas a la membrana secretadas por casi todos los tipos de células1. A menudo se les conoce como "exosomas", "microvesículas" o "cuerpos apoptóticos" dependiendo de su mecanismo de liberación y tamaño2. Si bien inicialmente se pensó que los VEHÍCULOS eléctricos eran simplemente un medio para eliminar los desechos de la célula para mantener la homeostasis3,ahora sabemos que también pueden participar en la comunicación intercelular a través de la transferencia de material molecular, incluido el ADN, el ARN (ARNm, microARN), los lípidos y las proteínas4,5, y que son importantes reguladores de la fisiología normal, así como de los procesos patológicos1, 5,6,7,8.
Hay muchos métodos diferentes para aislar y cuantificar los vehículos eléctricos, que se han descrito en otra parte9,10,11,12. El protocolo de aislamiento utilizado, así como la fuente de los vehículos eléctricos, pueden afectar en gran medida el rendimiento y la pureza de los vehículos eléctricos. Incluso la centrifugación diferencial, considerada durante mucho tiempo el enfoque "estándar de oro" para el aislamiento de exosomas, puede estar sujeta a una variabilidad sustancial que posteriormente afecta a la población de EV obtenida y a los análisis posteriores13. Por lo tanto, las diversas metodologías diferentes para el aislamiento y cuantificación de EV dificultan la comparación, reproducción e interpretación de los resultados de los experimentos reportados en la literatura14. Además, la liberación de EV puede ser regulada por condiciones celulares o varios factores externos. Se ha sugerido que los EV desempeñan un papel en el mantenimiento de la homeostasis celular al proteger a las células contra el estrés intracelular15,ya que varios estudios han demostrado que el estrés celular estimula la secreción de EV. Por ejemplo, se ha reportado un aumento de la liberación de EV después de la exposición celular a la hipoxia, el estrés del retículo endoplásmico, el estrés oxidativo, el estrés mecánico, el extracto de humo de cigarrillo y lacontaminacióndel aire por partículas16,17,18 , 19,20,21,22. También se ha demostrado que la liberación de EV se modifica in vivo; los ratones sometidos a una dieta alta en grasas o en ayunas durante dieciséis horas liberaron más vehículos eléctricos de adipocitos23. Para investigar si un tratamiento o afección específica altera la liberación de EV, el número de EV debe determinarse con precisión. La evaluación de la distribución del tamaño de ev también puede indicar el origen subcelular predominante de los EV (por ejemplo, fusión de endosomas tardíos/cuerpos multivesiculares con la membrana plasmática frente a la brotación de la membrana plasmática)24. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos robustos para medir con precisión la concentración total y la distribución de tamaño de la preparación EV que se está estudiando.
Un método rápido y altamente sensible para la visualización y caracterización de vehículos eléctricos en solución es el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Una explicación detallada de los principios de este método y la comparación con métodos alternativos para la evaluación del tamaño y la concentración de EV se han descrito previamente25,26,27,28. Brevemente, durante la medición NTA, los vehículos eléctricos son visualizados por la luz dispersada cuando se irradian con un rayo láser. La luz dispersa es enfocada por un microscopio en una cámara que registra el movimiento de las partículas. El software NTA rastrea el movimiento térmico aleatorio de cada partícula, conocido como movimiento browniano, para determinar el coeficiente de difusión que se utiliza para calcular el tamaño de cada partícula utilizando la ecuación de Stokes-Einstein. NTA se aplicó por primera vez a la medición de vehículos eléctricos en una muestra biológica en 201125. Hasta hace poco, solo había dos compañías principales que ofrecían instrumentos NTA comerciales29 hasta la introducción del ViewSizer 3000 (en adelante, el instrumento de seguimiento de partículas) que utiliza una combinación de nuevas soluciones de hardware y software para superar las limitaciones significativas de otras técnicas NTA.
El instrumento de seguimiento de partículas caracteriza las nanopartículas en muestras líquidas mediante el análisis de su movimiento browniano y caracteriza partículas más grandes del tamaño de micras mediante el análisis de la sedimentación gravitacional. El sistema óptico único de este instrumento, que incluye iluminación multiespectral con tres fuentes de luz láser (a 450 nm, 520 nm y 635 nm), permite a los investigadores analizar una amplia gama de tamaños de partículas (por ejemplo, exosomas, microvesículas) simultáneamente. En la Figura 1se muestra un esquema de la configuración del instrumento.
Aquí, demostramos cómo realizar mediciones de distribución y concentración del tamaño de partícula de vehículos eléctricos aislados de ratones y humanos utilizando un nuevo instrumento NTA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> Figura 1: Sistema óptico del instrumento de seguimiento de partículas. El instrumento NTA ilumina partículas utilizando tres láseres con las siguientes longitudes de onda: 450 nm, 520 nm, 635 nm. La grabación de video de la luz dispersa de partículas individuales es detectada y rastreada por una cámara de video digital orientada a 90 ° desde la cubeta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>1X dPBS</td><td>VWR</td><td>02-0119-1000</td><td>Para diluir muestras</td></tr><tr><td>Estándar de perlas de 100 nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>3100A</td><td>Para probar la calibración de ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Estándar de perlas de 400 nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>3400A</td><td>Para probar la calibración de ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo</td><td>Amicon</td><td>UFC901024</td><td>Para filtrar el diluyente de PBS</td></tr><tr><td>Tubos de recolección, 2 mL</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td>Para el aislamiento de vesículas extracelulares de plasma humano</td></tr><tr><td>Espolvoreador de aire comprimido</td><td>DustOff</td><td>DPSJB-12</td><td>Para limpiar cubetas</td></tr><tr><td>Inserto de cubeta</td><td>HORIBA</td><td></td> <td>Scientific-Provisto con la compra de ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Plantilla de cubetas</td><td>HORIBA Scientific-Para</td><td></td> <td>alinear la barra de agitación magnética mientras se colocan los insertos dentro de la cubeta; Provisto con la compra de ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Agua desionizada</td><td>VWR</td><td>02-0201-1000</td><td>Para limpiar cubetas</td></tr><tr><td>Computadora de escritorio con monitor, teclado, mouse y todos los cables necesarios</td><td></td> <td>Dell-Provisto</td> <td>con la compra de ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Etanol (70-100%)</td><td>Millipore Sigma-Para</td><td></td> <td>limpiar cubetas</td></tr><tr><td>ExoQuick ULTRA</td><td>System Biosciences</td><td>EQULTRA-20A-1</td><td>Para el aislamiento de vesículas extracelulares de plasma humano</td></tr><tr><td>Viales de centelleo de vidrio con tapa</td><td>Thermo Scientific</td><td>B780020</td><td>Para limpiar cubetasHerramienta</td></tr> <tr><td>"Hook"</td><td>Excelta-Provisto</td><td></td> <td>con la compra de ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Paño de microfibra sin pelusa</td><td>Texwipe</td><td>TX629</td><td>Para limpiar cubetas y cubrir la superficie de trabajo</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td>Para el aislamiento de vesículas extracelulares de plasma humano Barra agitadora</td></tr><tr><td></td><td>Sp Scienceware</td><td>F37119-0005</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo Suprasil con tapón</td><td>Agilent Technologies</td><td>AG1000-0544</td><td>Inicialmente suministrado con la compra de ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>ViewSizer 3000</td><td>HORIBA Instrumento</td> de <td>seguimiento</td> <td>científico-nanopartículas</td></tr></tbody></table>

análisis de seguimiento de nanopartículas para la cuantificación y determinación del tamaño de vesículas extracelulares

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Los roles fisiológicos y fisiopatológicos de las vesículas extracelulares (EV) se han vuelto cada vez más reconocidos, lo que hace que el campo EV sea un área de investigación en rápida evolución. Existen muchos métodos diferentes para el aislamiento de vehículos eléctricos, cada uno con ventajas y desventajas distintas que afectan el rendimiento y la pureza posteriores de los vehículos eléctricos. Por lo tanto, la caracterización de la preparación ev aislada de una fuente dada por un método elegido es importante para la interpretación de los resultados posteriores y la comparación de los resultados entre laboratorios. Existen varios métodos para determinar el tamaño y la cantidad de vehículos eléctricos, que pueden verse alterados por estados de enfermedad o en respuesta a afecciones externas. El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) es una de las tecnologías prominentes utilizadas para el análisis de alto rendimiento de vehículos eléctricos individuales. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la cuantificación y determinación del tamaño de los vehículos eléctricos aislados del tejido adiposo perigonadal de ratón y el plasma humano utilizando una tecnología innovadora para NTA que representa importantes avances en el campo. Los resultados demuestran que este método puede proporcionar datos reproducibles y válidos de concentración total de partículas y distribución de tamaño para vehículos eléctricos aislados de diferentes fuentes utilizando diferentes métodos, como lo confirma la microscopía electrónica de transmisión. La adaptación de este instrumento para NTA abordará la necesidad de estandarización en los métodos de NTA para aumentar el rigor y la reproducibilidad en la investigación de EV.

Antes de esta demostración, la calibración del instrumento se probó por primera vez para garantizar la validez de los datos adquiridos mediante la medición de la distribución de tamaño de los estándares de perlas de poliestireno. Probamos la distribución de tamaño de cuentas de 100 nm y 400 nm utilizando los parámetros de grabación predeterminados y la configuración de procesamiento recomendada en este protocolo (Figura 8).
Para el estándar de perlas de poliestire...

Demostramos cómo utilizar un nuevo instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas para estimar la distribución del tamaño y la concentración total de partículas de vesículas extracelulares aisladas de tejido adiposo perigonadal de ratón y plasma humano.

Análisis de seguimiento de nanopartículas para la cuantificación y determinación del tamaño de vesículas extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Los resultados de NTA son muy propensos al sesgo del operador. Este protocolo demuestra los efectos de los parámetros NTA alterados sobre los resultados obtenidos. Un método estandarizado ayudará a aumentar el rigor y la reproducibilidad en el análisis de NTA.El análisis de la muestra en una cubeta permite capturar una muestra estadísticamente aleatoria en cada video. Esto da como resultado datos más reproducibles y la visualización de partículas en una amplia gama de tamaños. Como obtener una muestra en el rango de concentración de partículas recomendado puede ser difícil, asegúrese de realizar una dilución en serie para identificar el factor de dilución ideal.Demostrando el procedimiento estará Kungheng Cai, un estudiante de doctorado del laboratorio de Anthony Ferrante. Para preparar la cubeta para el análisis de seguimiento de nanopartículas, cubra el espacio de trabajo con un material libre de pelusa para evitar que las fibras entren en las cubetas. Usando guantes, coloque una cubeta que contenga una barra de agitación sobre la plantilla de cubeta magnética.Utilice una herramienta de gancho para colocar el inserto en la cubeta con la muesca del inserto visible en la parte frontal de la cubeta. Use una pipeta para agregar lentamente de 400 a 500 microlitros de vesículas extracelulares purificadas en la cubeta a través del orificio en el inserto y mezcle la muestra pipeteando suavemente sin introducir burbujas de aire, luego cúbrala, golpeando las burbujas según sea necesario y use un paño sin pelusa para limpiar la superficie exterior de la cubeta. Para analizar la concentración de partículas del diluyente o una muestra, encienda la estación de trabajo y el instrumento de la computadora e inicie el programa de análisis de seguimiento de partículas.Cuando se le solicite, haga clic en NTA y abra la pestaña de grabación. Siga las instrucciones en pantalla para completar toda la información de muestra necesaria. Para el análisis de seguimiento de EV, establezca el diluyente en PBS.La salinidad se rellenará automáticamente al 9% Para obtener la concentración de diluyente o partícula de muestra, abra la tapa del instrumento y retire la tapa protectora que cubre donde se colocará la cubeta. Cargue la cubeta en el instrumento en la orientación correcta con la muesca del inserto mirando hacia la cámara y reemplace la tapa y la tapa del instrumento. Haga clic en la flecha de transmisión para encender la cámara y haga clic en la flecha de chevron para expandir la configuración de grabación.Ajuste el enfoque hasta que las partículas relativamente pequeñas sean claramente visibles. Para establecer el análisis para una pequeña cuantificación de EV, establezca la velocidad de fotogramas en 30 fotogramas por segundo, la exposición a 15 milisegundos, el tiempo de agitación a cinco segundos, el tiempo de espera a tres segundos, las potencias del láser azul, verde y rojo a 210, 12 y 8 milivatios respectivamente, los fotogramas por video a 300 y la ganancia a 30 decibelios. Ajuste el enfoque hasta que las partículas relativamente pequeñas sean claramente visibles.Aumentar el zoom y / o la ganancia puede ayudar con el enfoque de partículas. Pero si aumenta la ganancia, recuerde establecerla en 30 decibelios antes de grabar. Una vez que las partículas estén enfocadas, configure la configuración de zoom en 0.5X para ahorrar ancho de banda y evitar la pérdida de fotogramas y haga clic en grabar para comenzar a grabar el video.Cuando aparezca un mensaje que indique que los videos se han grabado, haga clic en Aceptar para completar la grabación y seleccione la pestaña de proceso. Si las partículas muy grandes eran visibles en cualquier video durante la grabación, navegue hasta el directorio de videos grabados y elimine cualquier video problemático antes de procesarlo. Marque la casilla deshabilitar la anulación de detección de audio y establezca el diámetro de la función en 30.Haga clic en proceso para iniciar el procesamiento de video y ver un gráfico de distribución en vivo. Cuando se complete el procesamiento, haga clic en Aceptar y seleccione la pestaña de trazado. Para los vehículos eléctricos, muestre el gráfico principal como sílice de contenedor de registro.Otras características del gráfico, como cambiar el eje x para establecer el área para la integración de la figura producida, se pueden personalizar. Para crear un informe PDF de los resultados, haga clic en el botón informe. Se mostrarán la media, la mediana, el tamaño del modo y la concentración ajustada para el factor de dilución y el ancho de distribución.El NTA del diluyente debe realizarse antes de cualquier muestra para que la concentración de este espacio en blanco se pueda restar de la concentración de partículas de la muestra EV. Para limpiar las cubetas después del análisis, vacíe la cubeta y llene completamente las cubetas de 10 a 15 veces con agua desionizada y las tres veces con 70 a 100% de etanol para eliminar cualquier muestra residual. Seque el exterior de las cubetas con un paño de microfibra sin pelusa y seque el interior con un plumero de aire comprimido.Para limpiar los insertos y remover las barras, coloque los materiales en un vial de centelleo de vidrio que contenga de 70 a 100% de etanol y agite el vial vigorosamente. Luego enjuague los insertos y revuelva las barras en agua desionizada con agitación como se ha demostrado y séquelas con paños sin pelusa. Después del secado, coloque inmediatamente todos los componentes limpios en el almacenamiento hasta el siguiente análisis.Antes de realizar un análisis, la calibración del instrumento se probó utilizando perlas de poliestireno para garantizar la validez de los datos adquiridos. Como se observó, el instrumento de seguimiento de partículas informó con precisión el tamaño de las cuentas de manodisperse de 100 nanómetros, pero solo informó de cerca el tamaño de las cuentas de 400 nanómetros. Por lo tanto, la configuración del instrumento para este protocolo fue más precisa para partículas más pequeñas, más cercanas a los 100 nanómetros de tamaño.Utilizando estos ajustes, se informó de las escalas de concentración de partículas en consecuencia con el factor de dilución, lo que demuestra que el instrumento puede detectar con precisión la concentración de partículas en varias diluciones con poca variabilidad entre los replicantes técnicos. Se determinó que la dilución óptima para una muestra ev derivada de tejido de 4,41 veces 10 a 10 por mililitro de ratón entre 1.000 y 3.000. En este análisis, el aumento de la ganancia aumentó la sensibilidad de la cámara, lo que permitió un aumento en la visualización de un mayor número de partículas más pequeñas.El aumento de la potencia del láser azul de 70 a 210 milivatios mientras se mantenía constante la potencia del láser verde y rojo cambió el tamaño promedio de partícula reportado de 122 a 105 nanómetros y aumentó la concentración total de partículas reportada de 1.1 veces 10 a la octava a 1.7 veces 10 a la octava. El aumento de la potencia del láser rojo aumentó el tamaño promedio de partícula reportado de 175 a 246 nanómetros y disminuyó la concentración total de partículas reportada. El aumento de la potencia del láser verde resultó en una disminución en el tamaño promedio de partícula reportado y un aumento en la concentración total de partículas reportada.Encontrar la dilución correcta para colocar una muestra dentro del rango de detección óptimo puede tomar algunos intentos para cada muestra. La limpieza de la cubeta también requiere un manejo muy cuidadoso. Recomendamos aplicar más de un método ortogonal para las mediciones de tamaño y concentración de partículas EV.La dispersión dinámica de la luz, la detección de pulsos resistivos, la microscopía electrónica de transmisión y la detección de imágenes de reflectancia interferométrica de una sola partícula también se pueden realizar para caracterizar los vehículos eléctricos.

nanoparticle-tracking-analysis-for-quantification-size-determination

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se presenta un método para el aislamiento de exosomas de sangre total y su posterior análisis mediante el seguimiento de nanopartículas utilizando un instrumento semiautomático. La tecnología presentada proporciona un método extremadamente sensible para visualizar y analizar partículas en suspensión líquida.

Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

Vesículas extracelulares juegan papeles importantes en procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la coagulación, respuestas inmunitarias, y el cáncer o como agentes terapéuticos potenciales en la administración de fármacos o la medicina regenerativa. Este protocolo presenta métodos para la cuantificación y caracterización de tamaño de las vesículas extracelulares aisladas y no aisladas en diversos fluidos utilizando sintonizable de detección de pulso resistiva.

Cuantificación y Tamaño-perfiles de extracelular vesículas Usando Tunable resistiva Pulso Sensing

En este protocolo, se describe el flujo de trabajo completo para el aislamiento rápido de vesículas extracelulares de sangre humana y caracterización de marcadores específicos por análisis de seguimiento de nanopartículas basada en fluorescencia. Los resultados presentados muestran un alto nivel de reproducibilidad y pueden regularse en sobrenadantes de cultivo celular.

Caracterización basada en fluorescencia rápida de solo vesículas extracelulares en la sangre humana con el análisis de seguimiento de nanopartículas

El protocolo describe un método reproducible diseñado para uso con sobrenadantes de cultivo celular para detectar epítopos superficiales en pequeñas vesículas extracelulares (EV). Utiliza específica inmunoprecipitación EV usando granos juntados con los anticuerpos que reconocen antígenos de superficie CD9, CD63 y CD81. El método está optimizado para el análisis de citometría de flujo aguas abajo.

Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo

El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) es un método ampliamente utilizado para caracterizar vesículas extracelulares. Este artículo destaca los parámetros y controles experimentales de NTA, además de un método uniforme de análisis y caracterización de muestras y diluyentes necesarios para complementar las pautas propuestas por MISEV2018 y EV-TRACK para la reproducibilidad entre laboratorios.

Mejorar la reproducibilidad para cumplir con la información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 Directrices en el análisis de seguimiento de nanopartículas

La última generación de herramientas de caracterización de EV es capaz de realizar un solo análisis de EV a través de múltiples parámetros simultáneamente. La citometría de nanoflujo mide todas las partículas biológicas mayores de 45 nm sin etiquetado e identifica características específicas de subpoblaciones mediante una variedad de técnicas de etiquetado fluorescente.

Caracterización de proteínas transmembrana de vesícula extracelular única mediante citometría de nanoflujo

Este artículo propone una nueva generación de plataformas analíticas multiparamétricas con mayor rendimiento para la caracterización de subconjuntos de vesículas extracelulares. El método se basa en una combinación de métodos de biodetección multiplexada con análisis metrológicos y morfomecánicos por microscopía de fuerza atómica, junto con espectroscopia Raman, para calificar objetivos vesiculares atrapados en un biochip de microarray.

Plataforma analítica multimodal en un chip de resonancia de plasmón de superficie multiplexada para el análisis de subconjuntos de vesículas extracelulares

Este protocolo proporciona un método de aislamiento rápido y específico del tamaño para pequeñas vesículas extracelulares al optimizar el tamaño de la boquilla de pulverización de aire, la presión del fluido de la vaina, la presión del flujo de muestra, el voltaje, la ganancia y los parámetros del umbral de activación.

Optimización de los parámetros de clasificación por citometría de flujo para el aislamiento y purificación de alto rendimiento de pequeñas vesículas extracelulares

Este artículo describe una metodología para el aislamiento, caracterización y cuantificación de vesículas extracelulares (EV) derivadas del plasma humano y presenta un flujo de trabajo para el análisis sin etiquetas del proteoma EV utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

Aislamiento, caracterización y análisis proteómico de vesículas extracelulares derivadas del plasma para el descubrimiento de biomarcadores cardiovasculares

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aprende a cuantificar y determinar el tamaño de vesículas extracelulares mediante análisis de seguimiento de nanopartículas. Este protocolo estandarizado reduce el sesgo del operador y mejora la reproducibilidad en la investigación de EVs.

Análisis de seguimiento de nanopartículas para la cuantificación y determinación del tamaño de vesículas extracelulares

Explorar más videos