Name: Generación de organoides pulmonares enteros en 3D a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar la biología y la enfermedad del desarrollo pulmonar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a generar organoides pulmonares 3D a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar el desarrollo y las enfermedades pulmonares humanas in vitro.

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Esta investigación fue apoyada por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

Este protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Programa de Protecciones de Investigación Humana de UCSD (181180).
1. Inducción definitiva del endodermo a partir de células madre pluripotentes inducidas (Día 1 - 3)
<ol><li>Descongele lentamente el medio de matriz de membrana basal reducida (GFR) sobre hielo 30 minutos antes de su uso. En dmEM/F12 frío, mezclar, diluir el medio de matriz BM GFR 1:1 de tal manera que constituya el 50% de este medio. Coloque las puntas de pipeta P1000 en el congelador para enfriarlas antes de usarlas.</li>
	<li>Cubra cada pocillo de una placa de 12 pocillos con 500 μL de medio de matriz de membrana basal GFR al 50% preparado en DMEM/F12 helado. Una vez que se haya recubierto el número deseado de pocillos, retire cualquier exceso de mezcla media y / o burbujas de los pozos y coloque la placa sobre hielo o refrigerador a 4 ° C durante 20 minutos para que cuaje. Luego, mueva la placa a la incubadora a 37 ° C durante la noche para gelificar y secar.</li>
	<li>Una vez que las hiPSC alcancen el 70-90% de confluencia, agregue 10 μM de inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632 una hora antes de la disociación. Aspire el medio y lave una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Disociar las hiPSCs añadiendo medio de desprendimiento celular (0,5 mL/pocillo de una placa de 12 pocillos) e incubar durante 20 min a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%.</li>
	<li>Retire las placas de la incubadora y agregue 0,5 ml/12 pocillos de medio de paso de células madre (Tabla 1) a los pocillos; triturar suavemente las células usando una punta P1000 para obtener la suspensión de una sola célula. Transferir células disociadas a un tubo centrífugo cónico de 15 ml; centrífuga durante 5 min a 300 x g.</li>
	<li>Aspire el medio y resuspenda el pellet celular con 1 ml de medio mTeSR Plus suplementado con un inhibidor de ROCK de 10 μM (Y-27632). Realice un recuento de celdas. Agregue 2.0 x 105 hiPSCs en 1 ml de mTeSR suplementado con el inhibidor de ROCK Y-27632 por pocillo de una placa recubierta de media membrana basal GFR de 12 pocillos. Incubar a 37 °C durante la noche. NOTA: El número de siembra de celdas debe optimizarse por línea celular. 24 h después del revestimiento, los pocillos deben ser 50% -70% confluentes.</li>
	<li>El día 1, aspire el mTeSR Plus y agregue medios de inducción de Endoderm Definitivo (DE) (Tabla 1) suplementados con 100 ng/ml de activina A humana y 5 μM de inhibidor de GSK3β/activador Wnt CHIR99021. NOTA: Los medios DE con inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR99021 deben retirarse dentro de las 20-24 h de la inducción del día 1 DE para una diferenciación exitosa.</li>
	<li>El día 2 y el día 3, cambie a medios de inducción DE suplementados con 100 ng / ml de activina A solamente. NOTA: La diferenciación de DE no debe exceder un total de 72 h, o la eficacia disminuirá. En el día 4, si se observa una muerte de células grandes, disminuya el tiempo total de exposición a los medios de DE en 6-12 h.</li>
	<li>Para analizar la eficiencia de DE, confirme una expresión superior al 90% de CXCR4 y/o cKit mediante citometría de flujo o análisis de inmunofluorescencia de FOXA2 y/o SOX17 (Figura 2a).</li>
</ol>2. Inducción del endodermo del intestino anterior (AFE) (Día 4 - 6)
<ol><li>El día 4, cambie el medio a medio basal libre sérico (SFBM) (Tabla 1) suplementado con 10 μM SB431542 y 2 μM de dorsomorfina para la inducción de AFE. Cambie los medios de AFE diariamente durante 3 días (día 4, día 5 y día 6).</li>
	<li>Para analizar la eficiencia de AFE, confirme la expresión robusta de SOX2, TBX1 y FOXA2 a través de la tinción por inmunofluorescencia (Figura 2b).</li>
</ol>3. Diferenciación de células progenitoras pulmonares (LPC) (Día 7 - 16)
<ol><li>El día 7, descongele el medio de matriz de membrana basal GFR en hielo. Aspire fuera del medio AFE y lave bien con 1x PBS. Añadir 1 ml de solución de desprendimiento celular e incubar durante 10 min a 37 °C.</li>
	<li>Añadir 1 ml de medio de enfriamiento (2% FBS en DMEM/F12) a los pocillos que contienen solución de desprendimiento celular. Mantenga las celdas como agregados mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo suavemente. Asegúrese de que todas las células se desalojen y se transfieran a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml. Centrífuga durante 5 min a 300 x g.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en medio de enfriamiento suplementado con 10 ng/mL de proteína morfogénica ósea recombinante humana-4 (BMP4), 0,1 μM de ácido retinoico trans (AR), 3 μM de inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR99021 y 10 μM de inhibidor de roca Y-27632.</li>
	<li>Realice un recuento de celdas. Agregue 2.5 x 105 células a 100 μL de medio de matriz de membrana basal GFR fría, mezcle bien y coloque gotas en un pozo de una placa de 12 pocillos. Incubar la placa a 37 °C durante 30-60 min para permitir que el medio polimerice. Agregue 1 ml de medio LPC suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632 por pozo, asegurando que la gota media esté completamente sumergida e incube a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>El día 8, 24 h después de la inducción de LPC, cambie el medio lpC para eliminar el inhibidor de ROCK Y-27632. Cambie el medio LPC cada dos días durante un total de 9-11 días. NOTA: Si el medio se vuelve amarillo dentro de las 24 h, cambie de medio todos los días.</li>
	<li>Para analizar la eficiencia de LPC, confirmar la expresión robusta del factor de transcripción intracelular NKX2-1 o realizar citometría de flujo para marcadores de superficie CD47hi/CD26low15 o CPM18 (Figura 2c). Grossly, los esferoides LPC deben ser redondos y transparentes (Figura 2c). NOTA: No proceda con la diferenciación organoide pulmonar si la eficiencia de NKX2-1 es inferior al 30%.</li>
</ol>4.3D inducción organoide pulmonar (Día 16 - 22)
<ol><li>El día 17, descongele el medio de matriz de membrana basal GFR en hielo. Aspirar el medio de inducción LPC. Luego agregue 2 μg / ml de dispasa (1 ml) al pozo y vuelva a suspender la mezcla de medio / dispasa con una pipeta P1000. Incubar a 37 °C durante 15 min. Triturar la mezcla de nuevo e incubar a 37 °C durante otros 15 min.</li>
	<li>Transfiera la dispasa y las células a un tubo centrífugo cónico de 15 ml. Use PBS refrigerado (2-3 ml) para lavar el pozo y volver a suspender la mezcla de dispasa/célula. Centrífuga durante 5 min a 400 x g. Retire manualmente el sobrenadante, teniendo cuidado de no distusar la capa de gránulos del medio/célula. Repita el lavado de PBS refrigerado y centrífique el tubo de centrífuga cónica durante otros 5 minutos a 400 x g.</li>
	<li>Retire manualmente el sobrenadante y luego agregue 2 ml de solución de disociación a base de tripsina al tubo de centrífuga cónica. Incubar a 37 °C durante 12 min.</li>
	<li>Después de la incubación, resuspenda las células con una punta de pipeta P1000. A continuación, agregue un volumen igual de medios de enfriamiento al tubo cónico de la centrífuga y gire hacia abajo a 400 x g durante 5 minutos. Aspirar las células sobrenadantes y resuspendidas en medio de enfriamiento + 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632. NOTA: La inducción organoide pulmonar exitosa ocurre cuando las células se incrustan como agregados, no como células individuales, ajuste el pipeteo en consecuencia.</li>
	<li>Realice un recuento de celdas. Calcule el volumen necesario para obtener 5.0-8.0 x 104 células por pozo. Alícuota la célula LPC se agrega en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y centrífuga durante 5 minutos a 400 x g. Retire el exceso de sobrenadante, teniendo cuidado de no agitar la bolita celular. Deje solo 10 μL de medios residuales.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet celular en 200 μL de medio de matriz de membrana basal GFR fría y agréguelo a los insertos de membrana de cultivo celular (6,5 mm de diámetro, poro de 0,4 μm, membrana de poliéster). Incubar la placa a 37 °C durante 30-60 min para permitir que el medio de matriz de membrana basal GFR se polimerice.</li>
	<li>Añadir 1 ml de medio de inducción organoide 3D (Tabla 1) suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR (3 μM), factor de crecimiento epidérmico (EGF) (10 ng/mL) y 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632 a la cámara basolateral del inserto de membrana. Cambie el medio cada dos días durante 6 días.</li>
</ol>5.3D Ramificación organoidea pulmonar (Día 23 - 28)
<ol><li>El día 23 cambio a medio de ramificación 3D (Tabla 1) suplementado con FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR99021 (3 μM), AR (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) / factor de crecimiento placentario (PlGF) (10 ng/mL). Cambie el medio cada dos días durante 6 días. NOTA: En el día 6 de la diferenciación de ramificación 3D, debe haber múltiples organoides ramificados (Figura 2).</li>
</ol>6.3D maduración organoide pulmonar (Día 29 - 34)
<ol><li>En el día 29, cambie a medio de maduración 3D (Tabla 1), que es el mismo que el medio de ramificación 3D pero con la adición de dexametasona (50 nM), cAMP (100 μM) y 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), un inhibidor de la fosfodiesterasa también denominado isobutilxantina (100 μM). Cambie el medio cada dos días durante 6 días. NOTA: Dentro de las 24 h posteriores a la maduración 3D, los organoides ramificados deben expandirse y transformarse en esferas transparentes.</li>
</ol>7.3D Inmunocitoquímica organoide pulmonar
<ol><li>Para el análisis organoide 3D de todo el pulmón, fije el medio de matriz de membrana basal GFR en los insertos de membrana con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 1 h a 4 °C. Incruste en cera de parafina y monte en diapositivas según los protocolos estándar publicados.</li>
	<li>Realizar la recuperación de antígenos antes de la tinción. Los marcadores de las vías respiratorias incluyen KRT5, MUC5AC y SCGB3A2. Los marcadores alveolares incluyen SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 y HOPX (Figura 3).</li>
</ol>8. Extracción de organoides pulmonares enteros del medio de matriz de membrana basal TFG para paso, FACS o criopreservación
<ol><li>Para disociar los organoides del medio de matriz de membrana basal TFG, retire los medios de la cámara basal y agregue 2 μg / ml de dispasa (1 ml) en la cámara apical.</li>
	<li>Triture suavemente la mezcla de medio / dispase con una pipeta P1000 y colóquela en la incubadora durante 15 min. Tritura suavemente la mezcla de nuevo e incuba durante otros 15 minutos.</li>
	<li>Añadir 1 ml de PBS refrigerado (4 °C) y transferir organoides con el medio de matriz a un tubo centrífugo cónico de 15 ml. Girar a 400 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante con cuidado, para no molestar la bolita celular.</li>
	<li>Lavar una vez más con 1 ml de PBS refrigerado y girar a 400 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante con cuidado, para no perturbar la mezcla de medio/célula.</li>
	<li>Agregue 1 ml de solución de desprendimiento celular al tubo de centrífuga cónica, triture suavemente resuspend el medio de matriz de membrana basal GFR/mezcla celular. Colocar en la incubadora durante 12 min para las células de paso como agregados o para la criopreservación), o 20 min para la suspensión de una sola célula.</li>
	<li>Agregue el mismo volumen de medios de enfriamiento y gire hacia abajo a 400 x g durante 5 minutos. Resuspend en medio de enfriamiento + 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632. NOTA: En este paso, no se debe ver ningún medio residual de membrana basal en el tubo. Si queda medio residual, repita los pasos 8.5 y 8.6.</li>
	<li>Realice un recuento de celdas. Calcule el volumen necesario para las aplicaciones posteriores.</li>
</ol>

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<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTII-280%2C+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li>
<li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2%2B+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li>
<li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293(2020).</li>
<li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li>
<li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells%3A+universal+donor+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La diferenciación exitosa de organoides pulmonares enteros (WLO) en 3D se basa en un protocolo de 6 semanas de varios pasos con atención al detalle, incluido el tiempo de exposición a factores de crecimiento y moléculas pequeñas, densidad celular después del pasaje y la calidad de las hiPSC. Para solucionar problemas, consulte la Tabla 2. Las hiPSC deben ser aproximadamente 70%-80% confluentes, con menos del 5% de diferenciación espontánea antes de la disociación. Este protocolo requiere el medio "mTeSR ...

El pulmón es un órgano complicado, heterogéneo y dinámico que se desarrolla en seis estadios distintos: maduración embrionaria, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar y microvascular1,2. Las dos últimas fases ocurren pre y postnatalmente en el desarrollo humano, mientras que las primeras cuatro etapas ocurren exclusivamente durante el desarrollo fetal, a menos que ocurra el parto prematuro3. La fase embrionaria comienza en la capa germinal endodérmica y concluye con la brotación de la tráquea y las yemas pulmonares. El desarrollo pulmonar ocurre en parte a través de la señalización entre las células epiteliales y mesenquimales4. Estas interacciones dan como resultado la ramificación pulmonar, la proliferación, la determinación del destino celular y la diferenciación celular del pulmón en desarrollo. El pulmón se divide en zonas conductoras (tráquea a los bronquiolos terminales) y zonas respiratorias (bronquiolos respiratorios a los alvéolos). Cada zona contiene tipos únicos de células epiteliales; incluyendo células basales, secretoras, ciliadas, de cepillo, neuroendocrinas e ionocitos en la vía aérea conductora5, seguidas de células alveolares tipo I y II en el epitelio respiratorio6. Todavía se desconoce mucho sobre el desarrollo y la respuesta a la lesión de los diversos tipos de células. Los modelos organoides pulmonares derivados de iPSC permiten el estudio de los mecanismos que impulsan el desarrollo pulmonar humano, los efectos de las mutaciones genéticas en la función pulmonar y la respuesta tanto del epitelio como del mesénquima a los agentes infecciosos sin la necesidad de tejido pulmonar humano primario.
Los marcadores correspondientes a las diversas etapas de la diferenciación embrionaria incluyen CXCR4, cKit, FOXA2 y SOX17 para el endodermo definitivo (DE)7, FOXA2, TBX1 y SOX2 para el endodermo del intestino anterior (AFE)8, y NKX2-1 para las células progenitoras pulmonares tempranas9. En el desarrollo pulmonar embrionario, el intestino anterior se divide en el esófago dorsal y la tráquea ventral. Las yemas de los pulmones derecho e izquierdo aparecen como dos bolsas externas independientes alrededor de la yema traqueal10. Durante la morfogénesis ramificada, el mesénquima que rodea el epitelio produce tejido elástico, músculo liso, cartílago y vasculatura11. La interacción entre el epitelio y el mesénquima es esencial para el desarrollo pulmonar normal. Esto incluye la secreción de FGF1012 por el mesénquima y SHH13 producida por el epitelio.
Aquí, describimos un protocolo para la diferenciación dirigida de hiPSCs en organoides pulmonares enteros tridimensionales (3D) (WLO). Si bien existen enfoques similares que incorporan el aislamiento de células progenitoras pulmonares a través de la clasificación en la etapa LPC para hacer organoides similares a los alveolares14,15 (distales) u organoides de las vías respiratorias16 (proximales), o generar esferoides del intestino anterior ventral-anterior para hacer organoides pulmonares humanos que expresan marcadores de células alveolares y mesenquimales y organoides progenitores de punta de yema17 , la fuerza de este método es la inclusión de los tipos de células epiteliales y mesenquimales pulmonares para modelar y orquestar la morfogénesis, maduración y expansión de la ramificación pulmonar in vitro.
Este protocolo utiliza moléculas pequeñas y factores de crecimiento para dirigir la diferenciación de las células madre pluripotentes a través del endodermo definitivo, el endodermo del intestino anterior y las células progenitoras pulmonares. Estas células se inducen a organoides pulmonares enteros en 3D a través de importantes pasos de desarrollo, incluida la ramificación y la maduración. El resumen del protocolo de diferenciación se muestra en la Figura 1a con imágenes representativas de campo brillante de diferenciación endodérmica y organoide que se muestran en la Figura 1b. La Figura 1c,d muestra los detalles de la expresión génica de la diferenciación endodérmica, así como la expresión génica de las poblaciones proximal y distal de las células epiteliales pulmonares después de completar la diferenciación.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 pocillos</td><td>Insertos Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>de 12 pocillos, 0,4um, translúcido</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 sin ácido retinoico</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA) Fracción V, solución al 7,5%</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Tecnologías</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Jamón' s F12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco modificado' s Medio (IMDM) + Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kit (10/caja)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pluma/estreptococo</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872 RPMI1640</td><td></td></tr><tr><td>+ Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Inhibidor de rocas)</td><td>R& D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Factores de crecimiento/Moléculas pequeñas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activina A R</td><td>& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico (RA) totalmente trans)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>R& D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>R& D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>VEGF/PIGF</td><td>R& D Systems</td><td>297-VP/CF</td><td></td></tr><<tr><td>fuerte>Anticuerpos primarios</fuerte></td><td></td><td></td><td><fuerte>Tasa de dilución</fuerte></td></tr><tr><td>CXCR4-PE</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170P</td><td>1:200 (F)</td></tr><tr><td>HOPX</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-398703</td><td>0.1805555556</td></tr><tr><td>HTII-280</td><td>Terrace Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>0.1458333333</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab52635</td><td>0.1805555556</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>0.25</td></tr><tr><td>NKX2-1-APC</td><td>LS-BIO</td><td>LS-C264437</td><td>1:1000 (F)</td></tr><tr><td>proSPC</td><td>Abcam</td><td>ab40871</td><td>0.215277778</td></tr><tr><td>SCGB3A2</td><td>Abcam</td><td>ab181853</td><td>0.25</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-014</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SOX9</td><td>R& D Systems</td><td>AF3075</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SPB (maduro)</td><td>7 Colinas</td><td>48604</td><td>1:1500 (F) 1:500 (W)a</td></tr><tr><td>SPC (maduro)</td><td>LS Bio</td><td>LS-B9161</td><td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td></tr></tbody></table>

generación de organoides pulmonares enteros en 3d a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar la biología y la enfermedad del desarrollo pulmonar

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

El desarrollo y la enfermedad pulmonar humana han sido difíciles de estudiar debido a la falta de sistemas modelo in vitro biológicamente relevantes. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) se pueden diferenciar paso a paso en organoides pulmonares multicelulares 3D, formados por poblaciones de células epiteliales y mesenquimales. Recapitulamos las señales del desarrollo embrionario introduciendo temporalmente una variedad de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para generar eficientemente el endodermo definitivo, el endodermo del intestino anterior y, posteriormente, las células progenitoras pulmonares. Estas células se incrustan en el medio de matriz de membrana basal reducida por factor de crecimiento (GFR), lo que les permite desarrollarse espontáneamente en organoides pulmonares 3D en respuesta a factores de crecimiento externos. Estos organoides pulmonares completos (WLO) se someten a etapas tempranas del desarrollo pulmonar, incluida la morfogénesis ramificada y la maduración después de la exposición a dexametasona, AMP cíclico e isobutilxantina. Los WLO poseen células epiteliales de las vías respiratorias que expresan los marcadores KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) y MUC5AC (cáliz), así como células epiteliales alveolares que expresan HOPX (alveolar tipo I) y SP-C (alveolar tipo II). Las células mesenquimales también están presentes, incluida la actina del músculo liso (AME) y el receptor A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα). Los WLO derivados de iPSC se pueden mantener en condiciones de cultivo 3D durante muchos meses y se pueden clasificar para marcadores de superficie para purificar una población celular específica. Los WLO derivados de iPSC también se pueden utilizar para estudiar el desarrollo pulmonar humano, incluida la señalización entre el epitelio pulmonar y el mesénquima, para modelar mutaciones genéticas en la función y el desarrollo de las células pulmonares humanas, y para determinar la citotoxicidad de los agentes infecciosos.

24 horas después del emplatado, día 1, las iPSC deben ser 50% -90% confluentes. En el día 2, el DE debe ser 90%-95% confluente. Durante la inducción de DE, es común observar una muerte celular significativa en el día 4, pero las células unidas conservarán una morfología de adoquines compacta (Figura 2b). Suspenda la diferenciación si la mayoría de las células adherentes se desprenden y considera acortar la exposición a los medios DE con activina A en 6-12 h. Durante la inducción de AFE, la m...

El artículo describe la diferenciación dirigida paso a paso de células madre pluripotentes inducidas a organoides pulmonares enteros tridimensionales que contienen células pulmonares epiteliales proximales y distales junto con mesénquima.

Generación de organoides pulmonares enteros en 3D a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar la biología y la enfermedad del desarrollo pulmonar

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Este protocolo utiliza células madre pluripotentes inducidas para diferenciarlas en células pulmonares con el fin de modelar la enfermedad pulmonar humana y el desarrollo en un plato. Este protocolo es significativo porque es difícil obtener y cultivar tejido pulmonar humano primario. Las principales ventajas de diferenciar las células pulmonares de las células madre pluripotentes es tener un suministro constante de células pulmonares específicas para estudiar el desarrollo y la enfermedad pulmonar humana.Estas células se pueden mantener en cultivo celular durante largos períodos de tiempo, se pueden criopreservar para aplicaciones futuras y se pueden manipular genéticamente para estudiar mutaciones genéticas. Demostrando el procedimiento estará Rachel McVicar, una candidata a doctorado de mi laboratorio. Antes de comenzar el experimento, descongele lentamente un medio de matriz de membrana basal reducido de factor de crecimiento, o GFR, en hielo, y diluirlo en un volumen igual de DMEM F12 frío.Coloque las puntas P1000 en el congelador para enfriar antes de usar. A continuación, cubra cada pocillo de una placa de 12 pocillos con 500 microlitros del medio de matriz de membrana basal 50% GFR, y elimine cualquier exceso de mezcla media y burbujas de los pozos. Coloque las placas del pozo sobre hielo húmedo o un refrigerador a cuatro grados Celsius para que se fije durante 20 minutos, luego mueva la placa a la incubadora de 37 grados Celsius durante la noche.Cuando los PSE altos alcancen el 70% de confluencia, agregue 10 inhibidores micromolares de ROCK Y27632 a las células madre pluripotentes inducidas por humanos y espere una hora antes de la disociación. Aspire los medios y lave las células una vez con PVS. Disociar las IPSC agregando 500 microlitros de medio de desprendimiento celular por pozo, e incubar durante 20 minutos a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.Después de la incubación, agregue 500 microlitros de medio de paso de células madre por pozo. Pipete suavemente las celdas usando una punta P1000 para obtener una suspensión de una sola celda. Luego transfiera las células disociadas a un tubo de 15 mililitros y centrífuga durante cinco minutos a 300 veces G.Después de la centrifugación, aspire el medio y resuspenda el pellet celular con un mililitro de medios mTeSR Plus complementado con un inhibidor de ROCK micromolar de 10.Después de contar las células, agregue dos veces 10 a las quintas IPSC a cada pocillo de una placa recubierta de medio GFR de 12 pocillos, e incube durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, aspire el mTeSR Plus antes de agregar medios de inducción endodermo definitivos, o DE. En los días dos y tres, cambie los medios de inducción DE.En el cuarto día, comience la inducción de AFE reemplazando los medios de inducción de DE con medio basal sin suero. Cambie el medio AFE diariamente durante tres días antes de analizar la eficiencia de AFE al final del sexto día. En el séptimo día, descongele el medio de matriz de membrana basal GFR en hielo para su uso posterior.Simultáneamente, proceda con la diferenciación de células progenitoras pulmonares aspirando los medios AFE y lavando los pozos con PVS. Agregue un mililitro de solución de desprendimiento celular al pozo e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, agregue un mililitro de medios de enfriamiento a los pozos que contienen la solución de desprendimiento celular.Mantenga las celdas como agregados canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Asegúrese de que todas las células estén desalojadas, pero para transferirlas a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación a 300 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en medios de inducción LPC.Cuente las células y agregue 2.5 veces 10 a las quintas células a 100 microlitros de medio de matriz de membrana basal de GFR fría y mezcle bien. Coloque una gota en un pozo de una placa de 12 pocillos e incube a 37 grados Celsius durante 30 a 60 minutos. A continuación, agregue un mililitro de medios LPC por pozo, asegurándose de que la gota media esté completamente sumergida e incube durante la noche a 37 grados centígrados.En el octavo día, cambie el medio LPC para eliminar el inhibidor de ROCK Y27632. Siga cambiando los medios cada dos días y analice la eficiencia de LPC al final del día 16. El día 17, lave los pozos y agregue 500 microlitros de dos microgramos por mililitro de dispasa.Pipetear la mezcla dispase con una pipeta P1000 e incubar durante 15 minutos, luego pipetear la mezcla e incubar durante otros 15 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro del medio de enfriamiento a los pocillos que contienen dispasa y transfiera las células a tubos cónicos. Centrifugar y volver a suspender el pellet en un mililitro de PVS refrigerado, luego repetir la centrifugación.Luego vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio de desprendimiento celular. Incubar las células a 37 grados Celsius durante 12 minutos, luego agregar un volumen igual de medios de enfriamiento y centrifugar nuevamente. Resuspend el pellet en un mililitro de medios de enfriamiento y 10 micromolares inhibidor de ROCK Y27632.Realice un recuento de células para calcular el volumen necesario para obtener ocho veces 10 a la cuarta celda por pozo. Luego, la alícuota requirió el volumen de agregados de células lpC en tubos de micro centrífuga de 1.5 mililitros, y centrífuga durante cinco minutos a 300 veces G.Retire el exceso de sobrenadante sin agitar el gránulo celular, dejando 10 microlitros de medios residuales. Resuspend el pellet celular en 200 microlitros de medio de matriz de membrana basal GFR frío y transfiera las células a insertos de membrana de cultivo celular.Incubar a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro de medio de inducción organoide 3D a la cámara basolateral del inserto y reemplácelo con medio fresco cada dos días durante seis días. El día 23, cambie el medio a un medio de ramificación 3D, luego cambie el medio cada dos días durante seis días.El día 29, cambie al medio de maduración 3D y continúe reemplazando el medio cada dos días durante los próximos seis días. En el cuarto día de inducción de DE, las células adheridas muestran una morfología de adoquines compacta. Se expresaron los marcadores endodermos definitivos CXCR4 y SOX17 superpuestos con núcleos, confirmando la diferenciación endodérmica.La inducción del intestino anterior se confirmó en el séptimo día con la morfología mostrando células más compactas, y los marcadores FOXA2 y SOX2 superpuestos con núcleos. La generación de células progenitoras pulmonares 3D se confirmó con esferoides 3D y la expresión endógena de NKX2-1 GFP en una línea celular reportera. Después de una diferenciación de tres semanas en organoides pulmonares enteros, los marcadores pulmonares se analizaron mediante inmunocitoquímica.Se observaron marcadores de morfogénesis ramificada SOX2 y SOX9 superpuestos por núcleos en los organoides. Los marcadores pulmonares proximales P63 y KRT5, ambos marcadores de células basales, se detectaron con éxito junto con SCGB3A2, que es un marcador para las células club. Los marcadores pulmonares distales indujeron marcadores Pro SPC y SPB para células alveolares tipo II.Y marcadores HOPX de células alveolares tipo I. Además, NKX2-1 y ZO1 se expresaron superpuestos con núcleos. Los marcadores de células pulmonares mesénquimas PGFR Alfa, un marcador para fibroblastos, coexpresado con SOX9, representaban el mesénquima distal.También se expresó vimentina y se dispersó por todo el pulmón. Después de este procedimiento, los organoides pulmonares se pueden invertir con células madre pluripotentes inducidas derivadas de células madre endoteliales e inmunes. El desarrollo pulmonar y la enfermedad se producen por una señalización entre las poblaciones de células epiteliales y mesenquimales, pero también de las células endoteliales y los macrófagos.Un sistema modelo de tejido pulmonar en 3D es clínicamente relevante para estudiar enfermedades humanas y terapéuticas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Generación de organoides pulmonares enteros en 3D a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar la biología y la enfermedad del desarrollo pulmonar (Video) | JoVE Journal

Generación de organoides pulmonares enteros en 3D a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar la biología y la enfermedad del desarrollo pulmonar

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