Name: Las tuberías de cristalografía automatizadas en las instalaciones de EMBL HTX en Grenoble (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Aprende cristalografía automatizada de macromoléculas en el laboratorio HTX de EMBL Grenoble. Utiliza CrystalDirect y CRIMS para cosecha remota de cristales y determinación de estructuras proteicas con acceso global.

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Queremos agradecer al Grupo de Biología Estructural embL-ESRF (JSBG) por su apoyo en el uso y operación de las líneas de haz macromoleculares de ESRF. Agradecemos a Matthew Bowler por su apoyo con la recopilación de datos en la línea de haz MASSIF-1 de ESRF y Thomas Schneider y al equipo de EMBL Hamburg por su excelente apoyo con la recopilación de datos en P14 del sincrotrón PetraIII (DESY, Hamburgo, Alemania). La cosechadora CrystalDirect se desarrolla en colaboración con el equipo de instrumentación de EMBL Grenoble. Este proyecto fue apoyado por la financiación del Programa 2020 de la Comunidad Europea en el marco de los proyectos iNEXT (Grant No 653706) e iNEXT Discovery (Grant No 871037), así como de la Région Auvergne-Rhône-Alpes a través del programa Booster.

NOTA: El acceso financiado a estas tuberías para científicos de todo el mundo se apoya a través de una serie de programas de financiación. En el momento de escribir este manuscrito, se aceptan solicitudes de acceso a través del programa iNEXT Discovery (https://inext-discovery.eu), una red de instalaciones europeas para estimular la biología estructural traslacional20 financiada por el programa Horizon 2020 de la Comisión Europea o INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). Póngase en contacto con el autor correspondiente para conocer las modalidades y rutas actuales de acceso financiado en un momento determinado. Este protocolo describe el funcionamiento de la tubería de proteína a estructura e incluye pasos comunes a todas nuestras tuberías, mientras que las especificidades para las otras dos tuberías se discuten en la siguiente sección. Las instrucciones aquí se refieren a CRIMS V4.0.
1. Laboratorio de cristalización de alto rendimiento
<ol><li>Antes de comenzar, solicite el registro en el laboratorio HTX a través del sistema CRIMS https://htxlab.embl.fr/#/. Las credenciales de usuario proporcionan acceso remoto a todas las interfaces experimentales de diseño y evaluación.<ol>
<li>Inicie sesión en CRIMS a través de un navegador web (Firefox, Chrome y Safari son compatibles). El servidor web de CRIMs está encriptado para evitar que terceros accedan a los datos mientras viajan a través de la web. Una vez en CRIMS, una serie de menús a la izquierda del cribado ayudan a gestionar y crear muestras, solicitar experimentos de cristalización, gestionar y visualizar placas, etc. Una serie de tutoriales en video están disponibles en https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d. NOTA: Los usuarios que envíen muestras por mensajería deben registrar las muestras y los experimentos de cristalización solicitados a través de CRIMS antes de enviar la muestra para garantizar que se puedan procesar sin demora a su llegada. Por favor, envíe los detalles del envío a htx@embl.fr.</li>
	</ol></li>
	<li>Inicie sesión en CRIMS (https://htxlab.embl.fr) con un navegador web y haga clic en el menú Muestras. Esto abrirá una interfaz con herramientas de gestión de proyectos y ejemplos.</li>
	<li>Haga clic en el botón Nueva muestra y proporcione la información solicitada. CRIMS permite organizar muestras bajo diferentes proyectos, objetivos y construcciones. Asigne el ejemplo a los existentes o cree otros nuevos en este punto.</li>
	<li>Una vez introducida la información solicitada haga clic en Guardar y realizar solicitud. Seleccione el protocolo de cristalización, las pantallas de cristalización que se utilizarán, la temperatura de incubación y la fecha deseada para los experimentos.<ol>
<li>Utilice los campos de comentarios para proporcionar indicaciones sobre las muestras que son importantes para que los operadores de laboratorio de HTX las conozcan. También se pueden seleccionar pantallas personalizadas (ver más abajo). Después de enviar la solicitud de cristalización, será validada por el equipo de HTX Lab y la confirmación sobre la programación de los experimentos se enviará por correo electrónico. Asegúrese de seleccionar fechas de experimento que sean compatibles con los tiempos requeridos para el envío de muestras.</li>
	</ol></li>
	<li>Una vez que las muestras llegan a la instalación, los operadores del laboratorio HTX llevarán a cabo los experimentos según lo solicitado. Una vez que se configuran los experimentos de cristalización, la confirmación se enviará por correo electrónico y las bandejas de cristalización se transferirán a los procesadores de imágenes automatizados. CRIMS proporciona acceso a todos los parámetros experimentales y realizará un seguimiento automático de las nuevas sesiones de imágenes. Las notificaciones por correo electrónico se enviarán automáticamente cuando haya nuevas imágenes disponibles. Un experimento de evaluación de la calidad de30 muestras basado en termofluor basado en un protocolo desarrollado en la instalación25,26 se lleva a cabo con cada muestra en este punto y estará disponible a través de CRIMS.</li>
	<li>Las imágenes de los experimentos de cristalización junto con los resultados de la evaluación de la calidad de la muestra estarán disponibles en CRIMS poco después de que se configuren las bandejas de cristalización. Haga clic en el menú Thermofluor y navegue hasta la muestra para ver los resultados del experimento de evaluación de la calidad de la muestra.<ol>
<li>Haga clic en el menú Placas para ver las imágenes de las placas de cristalización. Desplácese hasta la muestra y haga clic en Ver para ver la última sesión de imágenes o en el símbolo + (expandir) para seleccionar una sesión de imágenes diferente. Una serie de herramientas ayudan a encontrar y navegar fácilmente a través de las muestras. Por ejemplo, al hacer clic en un cuadro de proyecto en la parte superior de las pantallas, se filtran ejemplos para ese proyecto y las funciones de búsqueda están disponibles para la mayoría de las columnas de la tabla.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice la interfaz vista de placas para ayudar a evaluar y calificar los resultados de los experimentos de cristalización. Permite la navegación a través de los diferentes pozos de las placas de cristalización, seleccionar tipos de imagen (es decir, Vis, UV), seleccionar resolución de imagen o puntuaciones de registro, por ejemplo. Esta interfaz también proporciona todos los parámetros experimentales utilizados para los experimentos de cristalización, incluida la composición de las soluciones de cristalización.</li>
	<li>Haga clic en el menú Refinamiento para diseñar pantallas de optimización de cristal basadas en las condiciones de éxito primarias identificadas a través de la proyección inicial. Los submenús de Productos Químicos y Soluciones de Stock permiten registrar y administrar las soluciones de stock de cristalización. El submenú Pantallas proporciona acceso a una interfaz para diseñar su propia optimización o pantallas personalizadas.<ol>
<li>Seleccione el tipo de placa, las soluciones de stock o las configuraciones de gradiente que mejor se adapten al diseño experimental. Es posible pedir a CRIMS que envíe un archivo directamente compatible con el Robot Formulador (Formulatrix) para pipetear automáticamente las pantallas en la placa o para emitir un documento imprimible con los volúmenes para la operación manual.</li>
	</ol></li>
	<li>Itera a través de los pasos 1.2-1.8 para llevar a cabo experimentos de optimización de cristales.</li>
	<li>Una vez que se identifiquen los cristales adecuados para los experimentos de difracción de rayos X, navegue hasta la interfaz de vista de placas y seleccione la imagen correspondiente a la gota de cristalización derecha. Las puntuaciones pre-almacenadas le ayudarán a hacer esto fácilmente.<ol>
<li>Haga clic en Crystal Harvesting para registrar un plan automatizado de cosecha de cristales para el robot cosechador CrystalDirect o en Manual Harvesting para el montaje manual de cristales tradicional, si utiliza CRIMS en una instalación que no está equipada con CrystalDirect. Ambas interfaces guiarán al usuario a través del proceso de recolección de cristales. CRIMS registrará y almacenará automáticamente la ubicación de los cristales cosechados en SPINE o Unipucks21.</li>
	</ol></li>
	<li>Seleccione el menú Crystal Manager en CRIMS. Haga clic en el submenú Cristales cosechados para inspeccionar las muestras congeladas. Cuando se utiliza la cosechadora CrystalDirect, se presentan imágenes del proceso de cosecha, incluidas imágenes de los pines con los cristales cosechados.</li>
	<li>Seleccione el menú Envíos para conectarse a los sincrotrones ESRF o Petra III y crear envíos de muestras para el análisis de difracción de rayos X. Haga clic en el botón Crear envío y seleccione el sincrotrón que desea usar y el número de equipaje (la contraseña de la bolsa en el sincrotrón es necesaria aquí). La siguiente serie de interfaces se utiliza para seleccionar los pukcs que se incluirán en el envío. El sistema permite proporcionar comentarios para apoyar la recopilación de datos y determinar los parámetros de recopilación de datos para líneas de haz automatizadas como MASSIF-1.</li>
	<li>Si la recopilación de datos se lleva a cabo en el laboratorio ESRF o Petra III HTX, los operadores transferirán las muestras a la línea de haz, la recopilación de datos en otros sincrotrones se realizará a expensas del usuario. Es posible recopilar datos viajando al sincrotrón, a través de la operación de línea de haz remota o en MASSIF-1. En este último caso, el proceso de recopilación de datos está totalmente automatizado. En el sincrotrón, las interfaces específicas en ISPyB29 permiten a los usuarios recuperar la información enviada por CRIMS y asociar discos de muestra a ella para que los resultados de la recopilación de datos se rastreen automáticamente. Para los experimentos aquí descritos, la recolección de datos en sincrotrones se llevó a cabo típicamente con el software MXcube31, mientras que el procesamiento de datos y el refinamiento de la estructura se llevaron a cabo con atuoPROC32,Staraninso33,BUSTER33,Pipedream32,33 y Coot35.</li>
	<li>Una vez que se han llevado a cabo los experimentos de recopilación de datos, CRIMS recupera información resumida junto con los resultados del procesamiento inicial de datos en el sincrotrón del sistema ISPyB29. Vaya al menú CRIMS Crystal Manager y haga clic en el submenú Crystal Diffraction Data. Toda la información y metadatos relacionados con la recopilación de datos de difracción están disponibles. También es posible descargar datos procesados del sincrotrón, así como imágenes de difracción sin procesar. Vea varias colecciones de datos o seleccione conjuntos de datos específicos. Las herramientas de administración de muestras permiten navegar y seleccionar muestras para construcciones de proyectos específicos. NOTA: Esta tubería proporciona una operación totalmente automatizada a través de Internet desde proteínas puras hasta resultados de difracción de rayos X y se puede operar con una o varias muestras al mismo tiempo. Se puede aplicar a diferentes contextos y tipos de proyectos en biología estructural.</li>
</ol>

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<li>Khajepour, M. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REACH%3A+Robotic+Equipment+for+Automated+Crystal+Harvesting+using+a+six-axis+robot+arm+and+a+micro-gripper%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).</li>
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<li>Papp, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+compact+and+precise+sample+holder+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).</li>
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<li>Martin-Malpartida, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+genome+wide+recognition+of+5-bp+GC+motifs+by+SMAD+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors.</a> Nature Communications. 8 (1), 2070(2017).</li>
<li>Aragón, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+distinct+roles+of+SMAD2+and+SMAD3+in+FOXH1+pioneer-directed+TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling.</a> Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).</li>
<li>Münzker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment%E2%80%90Based+Discovery+of+Non%E2%80%90bisphosphonate+Binders+of+Trypanosoma+brucei+Farnesyl+Pyrophosphate+Synthase%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase.</a> ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).</li>
</ol>

JAM es coautor de una patente sobre el sistema CrystalDirect

Las tuberías de cristalografía automatizada descritas aquí están disponibles para investigadores de todo el mundo a través de diferentes programas de financiación. Actualmente, el acceso financiado para experimentos de cristalización y la tecnología CrystalDirect se puede obtener aplicando al programa iNEXT Discovery e INSTRUCT-ERIC, mientras que el acceso a las líneas de haz de cristalografía macromolecular en el ESRF se admite a través del programa de acceso de usuarios esRF. Este enfoque minimiza el retraso entre el crecimiento de los cristales y la medición, acelerando la progresión de proyectos muy desafiantes que requieren una optimización basada en la difracción de la producción de proteínas y las condiciones de cristalización y libera a los científicos de operaciones complejas asociadas con la cristalización, el manejo de cristales y la operación de la línea de haz, lo que hace que la cristalografía sea más accesible para los grupos no expertos. También se puede utilizar para la exploración rápida de aditivos de cristalización, agentes de fase o para el cribado de compuestos a través de experimentos de cocristalización. Si bien la mayoría de los proyectos de cristalografía podrían beneficiarse potencialmente de este enfoque, algunas muestras pueden requerir protocolos especiales que no son susceptibles de automatización o de las tuberías presentadas aquí, por ejemplo, aquellos que requieren sistemas microfluídicos o dispositivos de cristalización altamente especializados o muestras que son extremadamente lábiles y no tolerarían el envío.
La tecnología CrystalDirect también permite el remojo automatizado decristales 17 para la caracterización de complejos moléculas-objetivo pequeñas. Para esto, se crea una pequeña abertura con el láser antes del proceso de cosecha y se agrega una gota de una solución que contiene los productos químicos deseados (es decir, agentes de fase o ligandos potenciales) en la parte superior, de modo que entra en contacto y se difunde en la solución de cristalización que finalmente llega al cristal. Las soluciones químicas se pueden formular en agua, DMSO u otros disolventes orgánicos. Después de un cierto tiempo de incubación, los cristales pueden ser cosechados y analizados por difracción como se describió anteriormente. Este enfoque se ha aplicado a la caracterización rápida de complejos ligando-proteína en el contexto del diseño de fármacos basados en la estructura, así como al cribado de compuestos y fragmentos a gran escala. En este último caso, las bibliotecas de fragmentos con cientos a más de mil fragmentos se pueden analizar rápidamente. Las interfaces CRIMS específicas que no se presentan aquí facilitan el diseño y el seguimiento automatizado de los experimentos de remojo de cristales, mientras que la integración entre el software CRIMS y el paquete de software Pipedream, desarrollado por Global Phasing Ltd (Reino Unido), permite el procesamiento automatizado de datos, la fase, la identificación de ligandos y el refinamiento de la estructura en cientos de conjuntos de datos en paralelo, agilizando el análisis y la interpretación de datos32,33 . Por ejemplo, esta tubería se aplicó recientemente a la identificación de fragmentos que se unen tanto al sitio activo como a varios sitios alostéricos de Trypanosoma brucei farnesil pirofosfato sintasa, una enzima clave del parásito que causa la tripanosomiasis africana humana.
Las tuberías presentadas aquí pueden contribuir a acelerar el ritmo de descubrimiento en biología estructural y hacer que la cristalografía macromolecular sea más accesible para un mayor número de grupos de investigación. Además, al facilitar el cribado de compuestos y fragmentos a gran escala, pueden contribuir a fomentar la investigación traslacional y acelerar el proceso de descubrimiento de fármacos, contribuyendo a facilitar el desarrollo de fármacos mejores y más seguros contra un mayor número de objetivos.

La automatización se ha introducido en todos los pasos del proceso experimental de cristalografía macromolecular, desde la cristalización hasta la recopilación y el procesamiento de datos de difracción1,2,3,4,5,6,7,8,9,incluida una serie de tecnologías para el montaje de muestras10,11,12 ,13,14,15,16,17. Esto no solo ha acelerado el ritmo al que se obtienen las estructuras cristalográficas, sino que ha contribuido a agilizar aplicaciones como el diseño de fármacos guiados porestructuras 18,19,20,21,22,23,24. En este manuscrito describimos algunos de los aspectos de las tuberías de cristalografía automatizada disponibles en el laboratorio HTX en Grenoble, así como las tecnologías subyacentes.
El laboratorio HTX en EMBL Grenoble es una de las instalaciones académicas más grandes para la detección de cristalización en Europa. Está ubicado en el campus europeo de fotones y neutrones (EPN) junto con la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF), que produce algunos de los haces de rayos X más brillantes del mundo y el Institut Laue Langevin (ILL), que proporciona haces de neutrones de alto flujo. Desde el inicio de las operaciones en 2003, el laboratorio HTX ha prestado servicios a más de 800 científicos y procesa más de 1000 muestras por año. El laboratorio HTX tiene un fuerte enfoque en el desarrollo de nuevos métodos en cristalografía macromolecular, incluidos los métodos para la evaluación de muestras y el control de calidad25,26 y la tecnología CrystalDirect, que permite el montaje y procesamiento de cristales totalmenteautomatizados 15,16,17. El laboratorio HTX también ha desarrollado el Sistema de Gestión de Información Cristalográfica (CRIMS), un sistema de información de laboratorio basado en la web que proporciona comunicación automatizada entre las instalaciones de cristalización y recolección de datos sincrotrón, lo que permite un flujo de información ininterrumpido durante todo el ciclo de la muestra, desde la proteína pura hasta los datos de difracción. A través de la combinación de las capacidades de la instalación HTX, la tecnología CrystalDirect y el software CRIMS, hemos desarrollado tuberías de proteína a estructura totalmente automatizadas que integran la detección de cristalización, la optimización de cristales, el procesamiento automatizado de recolección de cristales y el crioenfriamiento y la recopilación de datos de rayos X en múltiples sincrotrones en un flujo de trabajo único y continuo que se puede operar de forma remota a través de un navegador web. Estas tuberías se pueden aplicar para apoyar la determinación rápida de nuevas estructuras, la caracterización de complejos proteína-ligando y el cribado de compuestos y fragmentos a gran escala a través de la cristalografía de rayos X.
El laboratorio HTX está equipado con un robot de cristalización sin volumen (que incluye un módulo LCP que permite la cristalización de proteínas solubles y de membrana), granjas de cristales (a 5 ° C y 20 ° C), dos estaciones robóticas de manejo de líquidos para preparar pantallas de cristalización y dos cosechadoras de cristales CrystalDirect automatizadas con capacidad para producir y almacenar hasta 400 pines de muestra congelados por ciclo de operación. Los científicos envían sus muestras a las instalaciones por mensajería urgente, que luego son procesadas por técnicos dedicados en el laboratorio HTX. Los científicos pueden diseñar de forma remota experimentos de detección y optimización de cristalización a través de una interfaz web proporcionada por el sistema CRIMS. A través de esta interfaz, pueden elegir entre una amplia gama de parámetros y protocolos experimentales disponibles en la instalación para adaptarse a sus requisitos de muestra específicos. Los resultados junto con todos los parámetros experimentales se hacen disponibles para los usuarios en tiempo real a través de CRIMS. Todas las muestras recibidas se ensayo a través de un método específicamente desarrollado que permite estimar la probabilidad de cristalización de la muestra25,26,27. Sobre la base de los resultados de este ensayo, se hacen recomendaciones específicas a los usuarios con respecto a la temperatura óptima de incubación y los posibles experimentos de optimización de la muestra. Una vez que se configuran los experimentos de cristalización, los científicos pueden evaluar los resultados observando las imágenes de cristalización recopiladas en diferentes puntos de tiempo a través de la web. Cuando se identifican cristales adecuados para experimentos de difracción de rayos X, los científicos pueden usar una interfaz dedicada para establecer un plan de montaje de cristales que luego será ejecutado por el robot CrystalDirect.
La tecnología CrystalDirect se basa en el uso de una microplaca de cristalización por difusión de vapor modificada y un rayo láser para montar y crio-enfriar muestras de cristal en soportes compatibles con difracción cerrando la brecha de automatización existente entre la cristalización y la recolección de datos15,16,17. Brevemente, los cristales se cultivan en una placa de difusión de vapor modificada, la microplaca CrystalDirect. Una vez que aparecen los cristales, el robot de recolección CrystalDirect aplica automáticamente un rayo láser para extirpar una pieza de película que contiene el cristal, unirla a un pin de recopilación de datos de difracción estándar y crioenfriarla en una corriente de gas nitrógeno (ver Zander et al. 2016 y https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8). Esta tecnología tiene una serie de ventajas adicionales sobre los protocolos de montaje de cristal manuales o semiautomatizados. Por ejemplo, el tamaño y la forma de los cristales no es un problema, por lo que es igualmente fácil cosechar cristales grandes o microcristales, a menudo es posible evitar el uso de crioprotectores, debido a la forma especial en que opera la tecnología (ver referencia 17, Zander et al.), lo que hace que el análisis de difracción de rayos X sea mucho más sencillo. El rayo láser también se puede utilizar como una herramienta quirúrgica para seleccionar las mejores partes de una muestra cuando los cristales crecen en grupos o muestran un crecimiento epitaxial, por ejemplo. La tecnología CrystalDirect también se puede utilizar para experimentos de remojo automatizados17. Entrega de soluciones con moléculas pequeñas u otros productos químicos a cristales. Por lo tanto, permite admitir la detección de compuestos y fragmentos totalmente automatizada y a gran escala. Una vez que los cristales son cosechados y crioenfriados por el robot CrystalDirect, se transfieren a los discos SPINE o Unipuck que son compatibles con la mayoría de las líneas de haz de cristalografía macromolecular de sincronía en todo el mundo. El sistema puede cosechar hasta 400 pines (la capacidad del almacenamiento criogénico Dewar) de una manera totalmente autónoma. CRIMS se comunica con el robot cosechador durante el proceso y proporciona un seguimiento automatizado de las muestras de cristal (discos y pasadores). Los discos están marcados tanto con códigos de barras como con etiquetas RFID para facilitar la gestión demuestras21,28.
CRIMS proporciona una interfaz de programa de aplicación (API) que admite la comunicación automatizada con el sistema ISPyB que admite la gestión y el procesamiento de la recopilación de datos de rayos X en muchos sincrotrones en Europa y el mundo29. Una vez completada la recolección automatizada de cristales, los científicos pueden seleccionar muestras de cristal (pucks) y crear envíos de muestras para las líneas de haz de cristalografía macromolecular en los sincrotrones ESRF (Grenoble, Francia)7,8,9 o Petra III (Hamburgo, Alemania)18,19. CRIMS transfiere los datos correspondientes a las muestras de línea de haz seleccionadas al sistema de información de sincrotrón junto con los parámetros de recopilación de datos preseleccionados. Una vez que las muestras llegan a la línea de haz de sincrotrón seleccionada, la recopilación de datos de rayos X se lleva a cabo manualmente, a través de la operación de línea de haz remota o de manera totalmente automatizada (es decir, en la línea de haz MASSIF-1 del ESRF8 operada por el Grupo Conjunto de Biología Estructural conjunta EMBL ESRF (JSBG)). Después de la recopilación de datos, CRIMS recupera automáticamente información sobre los resultados de la recopilación de datos junto con los resultados iniciales del procesamiento de datos llevados a cabo por los sistemas de procesamiento de datos sincrotrón y la presenta al científico a través de una interfaz de usuario conveniente.
El laboratorio HTX aplica estas tuberías automatizadas para soportar tres aplicaciones diferentes, determinaciones rápidas de nuevas estructuras, caracterización rápida de complejos de proteínas-ligandos y cribado de compuestos y fragmentos a gran escala. A continuación describimos cómo usarlos y operarlos.

<table><tbody><tr><td>Cosechadora CrystalDirect</td><td>Arinax</td><td></td><td>Montaje automatizado de cristal y crioenfriamiento</td></tr><tr><td>CrystalDirect Placa de cristalización</td><td>Mitegen</td><td>SKU: M-XDIR-96-2</td><td>Microplaca de crisalización de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Formulator 16</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Para la preparación automática de pantallas de cristalización</td></tr><tr><td>Cristalización de mosquitos Robot</td><td>SPT Labtech</td><td></td><td>Para la preparación de experimentos de cristalización</td></tr><tr><td>Tecan Evo Estación de manejo de líquidos</td><td>Tecan</td><td></td><td>Para la preparación de soluciones de cristalización</td></tr><tr><td>Spine Pucks</td><td>Mitegen</td><td>SKU: M-SP-SC3-1</td><td>Discos criogénicos compatibles con SPINE para intercambiadores de muestras de sincrotrón automatizados</td></tr><tr><td>UniPucks</td><td>Mitegen</td><td>SKU: M-CP-111-021</td><td>Discos criogénicos universales para intercambiadores de muestras de sincrotrón automatizados</td></tr></tbody></table>

las tuberías de cristalografía automatizadas en las instalaciones de embl htx en grenoble

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

EMBL Grenoble opera el Laboratorio de Cristalización de Alto Rendimiento (HTX Lab), una instalación de usuario a gran escala que ofrece servicios de cristalografía de alto rendimiento a usuarios de todo el mundo. El laboratorio HTX tiene un fuerte enfoque en el desarrollo de nuevos métodos en cristalografía macromolecular. A través de la combinación de una plataforma de cristalización de alto rendimiento, la tecnología CrystalDirect para el montaje y crioenlace de cristales totalmente automatizado y el software CRIMS, hemos desarrollado tuberías totalmente automatizadas para cristalografía macromolecular que se pueden operar de forma remota a través de Internet. Estos incluyen una tubería de proteína a estructura para la determinación de nuevas estructuras, una tubería para la caracterización rápida de complejos de proteínas-ligandos en apoyo de la química medicinal y una tubería de detección de fragmentos automatizada a gran escala que permite la evaluación de bibliotecas de más de 1000 fragmentos. Aquí describimos cómo acceder y utilizar estos recursos.

La tubería de cristalografía automatizada descrita anteriormente se ha aplicado para apoyar un gran número de proyectos internos y externos con un éxito notable. Algunos aspectos destacados incluyen el proyecto de Djinović-Carugo y colaboradores de los Laboratorios Max Perutz (Viena) que se centra en el análisis estructural y funcional de una dipeptidil peptidasa esencial para el crecimiento de un patógeno bacteriano. La rápida sucesión de ciclos de cribado de cristalización, evaluación de difracción, optimización de cristales y recolección de datos de rayos X (hasta 8 iteraciones para este proyecto) permitió obtener modelos estructurales para tres estados conformacionales diferentes de la proteína en solo unas pocas semanas, lo que proporcionó una comprensión mecanicista clave sobre la función de esta clase de proteínas36 (ver Figura 1).
Otro ejemplo es el de Macías y compañeros de trabajo del Instituto de Investigación Biomédica (IRB, Barcelona) que combinaron herramientas bioinformáticas y enfoques estructurales para identificar nuevos motivos de unión al ADN para los factores de transcripción SMAD3 y SMAD4 implicados en la regulación del destino celular. Este trabajo ha producido 6 estructuras de alta resolución de SMAD3 y 4 en complejo con diferentes motivos de unión al ADN37,38 revelando una capacidad hasta ahora insospechada de estos factores de transcripción para reconocer y unirse a una diversa gama de secuencias de ADN, lo cual es clave para la interpretación de su función en diferentes contextos biológicos. Estas tecnologías también se han aplicado para apoyar la investigación patentada en el contexto de proyectos de diseño de medicamentos de grupos de investigación en compañías farmacéuticas y biotecnológicas. Por ejemplo, gracias a la rapidez aportada por estas tuberías, el análisis estructural de múltiples complejos ligando-diana se puede lograr en cuestión de días, lo que es de gran valor para apoyar las sucesivas rondas de optimización de la química medicinal en el contexto del desarrollo de fármacos. Finalmente también hemos aplicado esta infraestructura para el cribado de fragmentos a gran escala basado en rayos X39.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62491/62491fig01.jpg"> Figura 1: Tubería de cristalografía automatizada. La operación integrada del laboratorio EMBL HTX, incluida la tecnología CrystalDirect y el software CRIMS con la línea de haz MASSIF-1 en ESRF y la comunicación automatizada entre el software CRIMS e ISPyB, permiten admitir una tubería de proteína a estructura totalmente automatizada y controlada a distancia que integra la detección y optimización de cristalización, la recolección automatizada de cristales y el crioenfriamiento y la recopilación y procesamiento automatizados de datos. Los modelos estructurales corresponden a tres estados conformacionales diferentes de una proteasa procedente de una bacteria patógena identificada en un tiempo récord mediante la aplicación de estos pipeline36. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62491/62491fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, describimos cómo utilizar las tuberías automatizadas de cristalografía macromolecular para el análisis rápido de complejos de ligando-proteína y proteína de proteína a proteína y el cribado de fragmentos a gran escala basado en la tecnología CrystalDirect en el Laboratorio HTX en EMBL Grenoble.

Las tuberías de cristalografía automatizadas en las instalaciones de EMBL HTX en Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

El laboratorio HTX ofrece acceso en línea a proteínas totalmente automatizadas a tuberías estructuradas que se pueden aplicar para resolver nuevas estructuras y para llevar a cabo un cribado de fragmentos y leganes a mayor escala. A través de la combinación de la tecnología CrystalDirect para la recolección automatizada de cristales y el enfriamiento CRI en el software CRIM, donde los científicos pueden controlar todo el proceso de cristalografía a través de Internet. Comience abriendo e iniciando sesión en Crystal Graphic Information Management System en un navegador web y haga clic en el menú Muestras para abrir una interfaz con el proyecto en Sample Management Tools.Haga clic en nueva muestra y, en la ventana de muestra, introduzca la información solicitada y haga clic en Guardar y realizar la solicitud. En el Panel de solicitud, seleccione el protocolo de cristalización, la temperatura de incubación, las pantallas de cristalización que se utilizarán y la fecha deseada para los experimentos que deben ser compatibles con el tiempo requerido para el envío de la muestra. Utilice los campos de comentarios para proporcionar indicaciones sobre las muestras que son importantes para que los operadores de laboratorio HDX las conozcan.Después del envío, la solicitud de cristalización será validada por el equipo del Laboratorio de cristalización de alto rendimiento. Se enviará una confirmación sobre la programación del experimento por correo electrónico. A la llegada de la muestra a la instalación.El personal del laboratorio configurará el experimento, enviará la confirmación de la configuración por correo electrónico y transferirá las bandejas de cristalización a los procesadores de imágenes automatizados. CRIMS proporcionará acceso a todos los parámetros experimentales y realizará un seguimiento de las nuevas sesiones de imágenes en tiempo real. Cuando haya nuevas imágenes disponibles, las notificaciones por correo electrónico se enviarán automáticamente.Para ver las imágenes de las placas de cristalización, abra el menú Placas y navegue hasta la muestra. Haga clic en ver para ver la última sesión de imágenes o haga clic en el símbolo de expansión para seleccionar una sesión de imágenes diferente y comprobar el historial de caídas. Para filtrar muestras de un proyecto seleccionado.Haga clic en el cuadro del proyecto específico. Las funciones de búsqueda también están disponibles para la mayoría de las columnas de la tabla. Para evaluar y calificar los resultados de los experimentos de cristalización, seleccione la interfaz de vista de placas y navegue por las diferentes paredes de las placas de cristalización.Seleccione el tipo de imagen y seleccione la calidad de la imagen o grabe las puntuaciones. La interfaz de vista también proporciona todos los parámetros experimentales utilizados para los experimentos de cristalización, incluida la composición de la solución de cristalización. Para diseñar pantallas de optimización de cristales en función de las condiciones de acierto principales identificadas a través de la proyección inicial, abra el menú Refinamiento y seleccione el submenú Pantallas.Seleccione el tipo de placa, las soluciones de stock o las configuraciones de gradiente que mejor se adapten al diseño experimental. Es posible pedir a CRIMS que envíe un archivo directamente compatible con el robot formulatrix formulador para pipetear automáticamente las pantallas en la placa o para emitir un documento imprimible pero los volúmenes para la operación manual. Una vez que el cristal sea adecuado para los experimentos de difracción de rayos X, navegue hasta la interfaz de vista de placas y use las puntuaciones pre almacenadas para seleccionar la imagen correspondiente a la caída de cristalización correcta.Haga clic en la recolección de cristales para registrar un plan automatizado de recolección de cristales del robot de cosecha directa de cristales. CRIMS registrará y almacenará automáticamente la ubicación de los cristales cosechados en la columna vertebral o en los discos unitarios. A continuación, los operadores de nuestra instalación retirarán las placas con los planes de cosecha de los imagers y las transferirán al robot CrystalDirect.Una vez completada la recolección de cristales, los discos que contienen las muestras se colocan en un CX 100 Dewar o se transfieren al sincrotrón de su elección. Para inspeccionar las muestras crioenfriadas, abra el menú Crystal Manager y seleccione Cristales cosechados. Las imágenes del proceso de cosecha, incluidas las imágenes de los pines con los cristales cosechados estarán disponibles allí.Para crear envíos de muestra para el análisis de difracción de rayos X, abra el menú Envíos y haga clic en crear envío para seleccionar el sincrotrón de interés y el número de bolsa. También se pueden introducir comentarios para apoyar la recopilación de datos, así como parámetros predefinidos para la recopilación de datos en líneas de haz totalmente automatizadas. El laboratorio HDX también proporciona acceso a la detección de fragmentos a gran escala totalmente automatizada.Los recursos de CRIMS para el procesamiento automatizado de datos y la identificación de golpes basados en el software de fase global, Pipeline Pipe Dream, permiten evaluar y priorizar rápidamente los resultados en cientos o miles de conjuntos de datos en un solo proyecto. CRIMS se comunica con los sistemas de gestión de información de Sincrotrón y recupera información sobre los experimentos de difracción reales. Abra el menú crystal Manager y seleccione datos de difracción de cristal para ver la información resumida y los resultados del procesamiento de datos inicial en el sincrotrón.En este análisis representativo, se utilizaron las tuberías de cristalografía automatizada como se demostró, para la identificación estructural de diferentes proteínas. Como se observó, se identificaron tres estados de confirmación diferentes de una proteasa de una bacteria patógena en muy poco tiempo, gracias a la rápida sucesión de la optimización del cribado de cristales y las mediciones de difracción. Esta tubería también se aplicó recientemente a la identificación de fragmentos, uniéndose tanto al activo en varios sitios alastéricos de Trypanosoma brucei.Farnesil pirofosfato sintasa una enzima clave del parásito que causa la tripanosomiasis africana humana. Este proceso minimiza el retraso entre el crecimiento de los cristales y la medición, acelerando el progreso. También libera a los científicos de operaciones complejas como el manejo de cristales y la operación de línea de haz que la cristalografía sea más accesible para los no expertos.Este enfoque puede contribuir a fomentar la investigación traslacional y luego acelerar el proceso de descubrimiento de fármacos. Contribuir al desarrollo de medicamentos mejores y más seguros contra un mayor número de objetivos.

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Research

Investigación

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Bioquímica

El protocolo describe un método de alto rendimiento para la determinación de estructuras de proteínas de membrana con la crio-tomografía electrónica y procesamiento de imágenes 3D. Que cubre los detalles de la preparación de muestras, la recopilación de datos, procesamiento e interpretación de datos, y concluye con la producción de un objetivo representante para la aproximación, la pandemia del VIH-1 glicoproteína de la envoltura. Estos procedimientos de cálculo han sido diseñados de una manera...

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La determinación de la estructura de la solución de una proteína por un pequeño ángulo de dispersión de rayos X (SAXS) requiere muestras monodispersas. A continuación, se presentan dos posibilidades para asegurar un retraso mínimo entre la preparación de la muestra y de adquisición de datos: cromatografía de exclusión por tamaño en línea (SEC) y la cromatografía de intercambio iónico en línea (IEC).

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Este artículo presenta un protocolo para el procesamiento de imágenes cryo-EM utilizando la suite de software SPHIRE. El presente protocolo se puede aplicar para casi todos los proyectos EM de partículas individuales que apuntan a la resolución casi atómica.

Análisis de una sola partícula de alta resolución a partir de imágenes de crosmicroscopía electrónica usando SPHIRE

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Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

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Solución de la estructura de la proteína fluorescente Cerulean con MeshAndCollect

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Aquí, se describe cómo utilizar la selección automática y opciones de recopilación de datos disponibles en algunos beamlines del sincrotrón. Los científicos enviaran muestras de cryocooled el sincrotrón, las propiedades de difracción son evaluadas, los conjuntos de datos son recogidos y procesados y, cuando sea posible, una solución de la estructura se lleva a cabo, todo ello sin intervención humana.

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Los estudios estructurales de biomacromolecules por cristalografía requieren cristales de alta calidad. Aquí demostramos un protocolo que puede ser utilizado por OptiCrys (un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio) y / o botones de microdiálisis para el crecimiento de grandes cristales de alta calidad basados en el conocimiento del diagrama de fase de cristalización.

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