Name: In situ Exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprende a analizar la ultraestructura de megacariocitos en médula ósea de ratón mediante microscopía electrónica de transmisión. Este protocolo permite identificar etapas de maduración in situ con alta resolución.

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Los autores desean agradecer a Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), la Unión Europea a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y por la Subvención ANR-17-CE14-0001-01 a H.d.S.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre la Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). El protocolo se muestra esquemáticamente en la Figura 1.
1. Recolección y fijación de médula ósea ( Figura 1A)
PRECAUCIÓN: Este procedimiento incluye sustancias cancerígenas, mutagénicas y / o tóxicas y se realiza bajo una campana de extracción química. Use el equipo de protección adecuado, como guantes y gafas de protección.
<ol><li>Preparar la solución fijadora que consiste en glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato (ver Archivo Complementario).</li>
	<li>Recolección de médula ósea<ol>
<li>Use ratones adultos C57BL / 6 de cualquier sexo de 12 a 18 semanas de edad. Sacrificar a los ratones por asfixia de CO2 y luxación cervical.</li>
		<li>Con un par de tijeras delgadas, corte la piel alrededor del muslo y use pinzas para pelar la piel. Retire la extremidad de la pata y luego corte entre la cadera y el muslo. Separe la tibia del fémur cortando la articulación de la rodilla y elimine el tejido adherente en las tibias y los fémures mediante el uso de un bisturí.</li>
		<li>Retire las epífisis con una cuchilla de afeitar afilada. Mientras sostiene el fémur con pinzas, use una jeringa de 5 ml llena de tampón de cacodilato con una aguja de 21 G para enjuagar la médula ósea en un tubo de 15 ml lleno de tampón de cacodilato de 2 ml. Para hacerlo, inserte el bisel de la aguja en la abertura de la médula ósea y presione lentamente el émbolo hasta que se expulse la médula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fijación de la médula ósea por inmersión rápida en fijador.<ol>
<li>Inmediatamente después del lavado, use una pipeta de plástico para transferir el cilindro de médula ósea a 1 ml de solución fijadora de glutaraldehído fresco (previamente preparada en 1.1) durante 60 min a temperatura ambiente. NOTA: Para preservar el tejido, asegúrese de que todo el proceso, desde la disección ósea hasta la etapa de fijación, se complete en menos de 10 minutos. Para la fijación, asegúrese de que la solución fijadora esté a temperatura ambiente para evitar el choque térmico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Incrustación de médula ósea en agarosa
NOTA: El tejido de la médula no está lo suficientemente cohesionado para mantener su integridad durante los diferentes pasos de lavado y el material se puede perder fácilmente. Para superar este problema, la médula se cubre con un gel de agar antes de la deshidratación.
<ol><li>Prepare la solución de agarosa como se describe en el Archivo Complementario.</li>
	<li>Lave la médula fija de la sección 1.3 en tampón de cacodilato y transfiérala cuidadosamente a un portaobjetos de vidrio con una pipeta de plástico. Usando una pipeta tibia, aplique rápidamente una gota de agar líquido al 2% en el cilindro de médula ósea. NOTA: El agar se solidifica rápidamente mientras se enfría. Para asegurar una cubierta homogénea de la médula ósea, la solución de agar debe mantenerse caliente hasta que se deposite en el portaobjetos.</li>
	<li>Coloque rápidamente el tobogán rápidamente sobre hielo hasta que el agar se solidifique (1-2 min).</li>
	<li>Bajo un microscopio, use una cuchilla de afeitar afilada para cortar y desechar las extremidades del cilindro de la médula ósea debido a la posible compresión del tejido en estas áreas. Transfiera los bloques de médula en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contengan 1 ml de tampón de cacodilato.</li>
</ol>3. Incrustación de médula ósea en resina
PRECAUCIÓN: Los componentes de resina son tóxicos; algunos son cancerígenos y deben manipularse con cuidado bajo una campana de extracción química. Use el equipo de protección adecuado, como guantes y gafas de protección. El tetróxido de osmio es altamente volátil a temperatura ambiente y sus vapores son muy dañinos para los ojos, la nariz y la garganta. Antes de ser desechado, el tetróxido de osmio al 2% debe neutralizarse agregando el doble de su volumen de aceite vegetal.
<ol><li>Preparar la resina epoxi como se describe en el Archivo Complementario.</li>
	<li>Incrustación de resina NOTA: Mantenga las muestras en los mismos tubos de microcentrífuga durante las incubaciones en baños sucesivos de osmio, acetato de uranilo y etanol. Aspirar los sobrenadantes con una pipeta Pasteur. El volumen de solución utilizado para cada baño debe ser igual al menos 10 veces el volumen de la muestra.<ol>
<li>Después de fijar los bloques con 1% de osmio en tampón de cacodilato durante 1 h a 4 °C, lavar una vez en tampón de cacodilato y luego una vez en agua destilada.</li>
		<li>Manche con acetato de uranilo al 4% en agua destilada durante 1 h, lave dos veces en agua destilada.</li>
		<li>Deshidratar a través de una serie graduada de etanol en agua destilada: 4 veces en etanol al 75% durante 5 min, seguido de 3 veces en etanol al 95% durante 20 min y luego 3 veces en etanol al 100% durante 20 min. En este paso, saque una jeringa de resina epoxi del congelador. NOTA: El protocolo se puede pausar en etanol al 100% durante 1 h.</li>
		<li>Para obtener una infiltración y polimerización uniformes de resina epoxi dentro de la médula, incube primero los bloques en 2 baños sucesivos de óxido de propileno durante 15 min.</li>
		<li>Añadir una mezcla 1:1 de óxido de propileno 100% y resina epoxi e incubar durante 1 h. Coloque las muestras en un agitador rotativo lento a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añadir resina epoxi 100% dejar la muestra para incubación durante la noche bajo agitación.</li>
		<li>Añadir resina epoxi 100% durante 2 h de incubación, aún bajo agitación.</li>
		<li>Bajo un microscopio, coloque los bloques de médula en moldes planos de silicona. Orientar las muestras para permitir la posterior seccionamiento transversal de toda la médula ósea. Llenar los moldes con resina epoxi y colocarlos a 60 °C durante 48 h. NOTA: Todas las soluciones (excepto el etanol y el óxido de propileno) se filtran a través de un filtro de 0,22 μm para evitar la contaminación de las muestras. Para garantizar una polimerización adecuada de la resina, evite las burbujas mientras llena los moldes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Seccionamiento ultrafino (Figura 1B)
NOTA: La EM de transmisión requiere secciones de tejido delgadas a través de las cuales los electrones pueden pasar generando una imagen de proyección del interior de las células, la estructura y la organización de los orgánulos internos (gránulos, retículo endoplásmico, Golgi) y la disposición de las membranas celulares intracelulares.
<ol><li>Monte el bloque de muestra en un soporte de ultra-microtomo. Póngalo en el soporte de la muestra. Recorte las muestras a 45° para eliminar el exceso de resina alrededor del tejido con un cortador de fresado giratorio de diamante o tungsteno.</li>
	<li>Monte las muestras en el ultramicrotomo con una hoja de cuchillo de diamante equipada con un tanque de agua. Corte de secciones transversales de espesor de 500 nm y 100 nm para análisis histológicos y TEM, respectivamente. Recoge secciones flotantes en la superficie del agua con un bucle.</li>
	<li>Deposite la sección de 500 nm de espesor en un portaobjetos de vidrio y las secciones de 100 nm de espesor en rejillas de cobre de barra delgada de malla 200 con un filtro de papel debajo. Prepare cinco cuadrículas para una condición: manche dos rejillas primero y mantenga las tres cuadrículas restantes como respaldo si es necesario.</li>
</ol>5. Tinción azul de toluidina para histología
NOTA: Las secciones de tinción para histología son importantes por tres razones: 1) para asegurarse de que el tejido esté realmente cortado y no la resina, 2) para verificar la calidad de la inclusión, y 3) para evaluar rápidamente la muestra de médula. Si esto no es correcto, corte más profundamente en el bloque.
<ol><li>Seque las secciones semifinas sobre una placa de calor (60 °C).</li>
	<li>Añadir 1% de azul de toluidina filtrado/borato de sodio al 1% en agua destilada en los portaobjetos y calentar en una placa caliente (60 °C) durante 1-2 min. Lave los portaobjetos con agua destilada y déjelo secar en la placa de calor.</li>
	<li>Monte secciones en la cubiertas con una gota de medio de montaje de poli(metacrilato de butilo-cometilo metacrilato) y examine bajo un microscopio de luz.</li>
</ol>6. Tinción de metales pesados para la observación tem (Figura 1C)
NOTA: Para el contraste, la parte superior de las rejillas se invierte en gotas de 100 μL de cada baño sucesivo con un bucle. Antes de su uso, cada solución se filtra a 0,22 μm. Retire el exceso de líquido entre cada baño contactando suavemente el lado de la rejilla en un papel de filtro.
<ol><li>Tinción con acetato de uranilo al 4% en agua destilada durante 5 min.</li>
	<li>Lavar 3 veces en agua destilada durante 5 min.</li>
	<li>Manchar con citrato de plomo durante 3 min.</li>
	<li>Lavar 3 veces en agua destilada durante 5 min.</li>
	<li>Deposite las rejillas por el lado inferior en contacto con el papel de filtro para dejarlas secar. NOTA: Los metales pesados reaccionan en presencia de dióxido de carbono. Para minimizar los precipitados, evite el desplazamiento del aire durante el contraste, no hable, mantenga el ambiente tranquilo y apague el aire acondicionado.</li>
</ol>7. TEM (Figura 1E)
NOTA: Las secciones se introducen en un microscopio TEM y se examinan a 120 kV.
<ol><li>Primero examine las secciones a bajo aumento (< 500x) para apreciar el aspecto general de la preparación (ausencia de agujero en la resina, pliegues / compresión en las secciones, precipitados debido a la tinción).</li>
	<li>Luego examine las secciones con un aumento más alto (~ 2000x que permite distinguir la etapa de maduración). Contar manualmente los megacariocitos de cada etapa de maduración en secciones transversales enteras (ver Resultados representativos sobre cómo identificar visualmente cada etapa). NOTA: Cada cuadrado de las rejillas se define como un área para el examen (que equivale a 16000 μm2 para 200 rejillas de cobre de malla).</li>
	<li>Para evaluar el número de megacariocitos, cuantifique solo los cuadrados que están completamente cubiertos con una sección. Para ello, utilice un modelo basado en el cribado de rangos. Observe un primer rango de cuadrados de una extremidad de la sección a otra, luego otro rango de la misma manera, etc. Utilizando este procedimiento, evalúe completa y sistemáticamente toda la sección transversal de la médula cuadrado por cuadrado.</li>
	<li>Para cada cuadrado, puntúe el número de megacariocitos en estadio I, II o III. NOTA: Se requieren aumentos más altos para analizar los gránulos, la organización del DMS, el tamaño de los territorios citoplasmáticos y el núcleo polilobulado.</li>
</ol>

<ol><li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incredible+journey%3A+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li>
<li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9(1989).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+%28DMS%29+in+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li>
<li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+megakaryocytes+to+platelets%3A+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets+and+Megakaryocytes%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061(2018).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024(2020).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+%CE%B1-Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li>
<li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emperipolesis%2C+entosis+and+cell+cannibalism%3A+Demystifying+the+cloud%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92(2017).</li>
<li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El examen directo de los megacariocitos en su entorno nativo es esencial para comprender la megacaripoyesis y la formación de plaquetas. En este manuscrito, proporcionamos un método de microscopía electrónica de transmisión que combina el lavado de la médula ósea y la fijación por inmersión, lo que permite diseccionar in situ las características morfológicas de todo el proceso de morfogénesis de megacariocitos que tiene lugar en la médula ósea.
El lavado de la médula ósea es un paso c...

Los megacariocitos son células poliploides grandes especializadas, localizadas en la médula ósea, responsables de la producciónplaquetaria 1. Se originan a partir de células madre hematopoyéticas a través de un intrincado proceso de maduración, durante el cual los precursores de megacariocitos aumentan progresivamente de tamaño, mientras sufren extensos cambios morfológicos concomitantes en el citoplasma y el núcleo2. Durante la maduración, los megacariocitos desarrollan una serie de elementos estructurales distinguibles que incluyen: un núcleo polilobulado, invaginaciones de la membrana superficial que forman el sistema de membrana de demarcación (DMS), una zona periférica desprovista de orgánulos rodeada por la red citoesquelética basada en actina y numerosos orgánulos que incluyen gránulos α, gránulos densos, lisosomas y múltiples complejos de Golgi. A nivel ultraestructural, una modificación importante observada es la compartimentación citoplasmática en regiones discretas delimitadas por el DMS3. Este extenso suministro de membranas alimentará la extensión de largos procesos citoplasmáticos en la fase inicial de la producción de plaquetas, que luego se remodelarán en plaquetas dentro de la circulación. Cualquier defecto durante la diferenciación y maduración de megacariocitos puede afectar la producción de plaquetas en términos de recuento de plaquetas y / o función plaquetaria. 
La microscopía electrónica de transmisión de capa delgada (TEM) ha sido el enfoque de imagen de elección durante décadas proporcionando una ultraestructura de alta calidad de megacariocitos que han dado forma a nuestra comprensión de la fisiología de la trombopoyesis4,5. Este artículo se centra en un método TEM estandarizado que permite capturar el proceso de biogénesis plaquetaria que ocurre in situ dentro del microambiente de la médula ósea nativa, que también podría servir como base para analizar cualquier tipo de célula de la médula ósea. Proporcionamos ejemplos ultraestructurales del desarrollo de megacariocitos desde inmaduros hasta completamente maduros, que extienden los procesos citoplasmáticos en la microcirculación de sinusoides6. También describimos un procedimiento fácil para cuantificar las diferentes etapas de maduración de los megacariocitos, instruyendo sobre la regeneración y la capacidad de producción de plaquetas de la médula ósea.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-Tri(dimetilaminometil)fenol (DMP-30)</td><td>Ladd Research Industries, EE. UU.</td><td>21310</td><td></td></tr> Agar de bajo <tr><td>punto de fusión LM-3 de agarosa</td> Ciencias de <td>la microscopía electrónica, EE. UU.</td><td>1670-B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Cloruro de calcio hexahidratado</td><td>Merck, Alemania</td><td>2083</td><td></td></tr><tr><td>Rejillas de cobre 200 malla delgada Instrumento</td><td>Oxford, Agar Scientifics, Inglaterra</td><td>T200-CU</td><td></td></tr><tr><td>Ácido dimetilarsínico sal sódica trihidrato</td><td>Merck, Alemania</td><td>8.20670.0250</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido succínico de dodecenil (DDSA)</td><td>Ladd Research Industries, EE. UU.</td><td>21340</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de acero inoxidable de doble filo</td><td>Microscopía electrónica Sciences-EMS, EE. UU</td>. <td>EM-72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>VWR International, Francia</td><td>20821296</td><td></td></tr><tr><td>Filtro papel, 90 mm de diámetro</td><td>Whatman, Inglaterra</td><td>512-0326</td><td></td></tr><tr><td>Molde de silicona de incrustación plana</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientific, Inglaterra</td><td>G3533</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído 25%</td><td>Microscopía electrónica Sciences-EMS, EE. UU</td>. <td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Placa de calor Leica EMMP</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>705402</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante Histo 45&deg;</td><td>Diatomea, Suiza</td><td>1044797</td><td></td></tr><tr><td>JEOL 2100 Plus Microscopio TEM</td><td>JEOL, JAPÓN</td><td>EM-21001BU</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de plomo - Ultrostain 2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>70 55 30 22</td><td></td></tr><tr><td>Resina LX-112</td><td>Ladd Research Industries, EE. UU.</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma, Francia</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje - Poli(metacrilato de butilo-co-metacrilato de metilo)</td><td>Microscopía electrónica Sciences-EMS, EE. UU</td><td>. 15320</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido de metilo nádico (NMA)</td><td>Ladd Research Industries, EE. UU</td>. <td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio 2%</td><td>Merck, Alemania</td><td>19172</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno (1.2-epoxipropano)</td><td>Sigma, Francia</td><td>82320-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina inyectable 0.9% NaCl</td><td>C.D.M Lavoisier, Francia</td><td>MA 575 420 6</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí Hoja de acero quirúrgico</td><td>Swann-Morton,</td> <td>Inglaterra.0508</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de sodio - Bórax</td><td>Sigma, Francia</td><td>B-9876</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Merck, Alemania</td><td>84100-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 0.2&micro; m</td><td>Pall Corporation, EE. UU.</td><td>514-4126</td><td></td></tr><tr><td>Azul de toluidina</td><td>Ladd Research Industries, EE. UU.</td><td>N10-70975</td><td></td></tr><tr><td>Recortadora EM TRIM2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>702801</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo Ultracut UCT</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>656201</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Ladd Research Industries, EE. UU</td>. <td>23620</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

La diferenciación y maduración de los megacariocitos se producen en estrecha asociación con los componentes celulares y extracelulares de la médula ósea. Estos procesos se caracterizan por la aparición gradual de estructuras esenciales en el citoplasma de megacariocitos, como un núcleo poliploide y polilobulado, una red de membrana interna llamada sistema de membrana de demarcación (DMS) y los gránulos densos y alfa que se encontrarán en las plaquetas circulantes. En este artículo, describimos un protocolo estandarizado para el estudio ultraestructural in situ de megacariocitos murinos utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), que permite la identificación de características clave que definen su etapa de maduración y densidad celular en la médula ósea. Las médulas óseas se enjuagan, se fijan, se deshidratan en etanol, se incrustan en resina plástica y se montan para generar secciones transversales. Las secciones semidelgado y delgado se preparan para observaciones histológicas y TEM, respectivamente. Este método se puede utilizar para cualquier célula de la médula ósea, en cualquier instalación de EM y tiene la ventaja de utilizar tamaños de muestra pequeños que permiten la combinación de varios enfoques de imagen en el mismo ratón.

Histología de la médula ósea La observación de la histología azul de toluidina de la médula ósea bajo un microscopio de luz es clave para analizar rápidamente la arquitectura general del tejido en términos de, por ejemplo, la compacidad del tejido, la continuidad del microvaso y el tamaño y la forma de los megacariocitos (Figura 1D). Se realiza antes de secciones ultrafinas para determinar la necesidad de cortar más profundamente en el bloqueo de la médul...

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la ultraestructura de los megacariocitos in situ utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las médulas óseas murinas se recogen, se fijan, se incrustan en resina epoxi y se cortan en secciones ultrafinas. Después de la tinción por contraste, la médula ósea se observa bajo un microscopio TEM a 120 kV.

In situ Exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

El objetivo general de este procedimiento es observar la ultraestructura de los megacariocitos ubicados dentro de la médula ósea del ratón y cuantificar las diferentes etapas de maduración utilizando microscopía electrónica de transmisión de alta resolución. La principal ventaja es el examen directo de los megacariocitos en el medio nativo, que difiere de los megacariocitos cultivados in vitro que como sabemos no alcanzan el nivel completo de maduración. Después de cosechar la tibia y los fémures de ratones C57BL / 6 de 12 a 18 semanas de edad de acuerdo con los protocolos estándar, use una cuchilla de afeitar afilada para eliminar las epífisis de cada hueso.Sosteniendo cada hueso con pinzas, inserte una aguja de calibre 21 conectada a una jeringa de cinco mililitros llena de tampón de cacodilato en un extremo del hueso y enjuague la médula ósea en un tubo de recolección de 15 mililitros que contenga dos mililitros de tampón de cacodilato fresco. Inmediatamente después del lavado, use una pipeta de plástico para transferir los cilindros de médula ósea en un mililitro de solución fijadora de glutaraldehído fresco para una incubación de 60 minutos a temperatura ambiente. Para incrust

in-situ-exploration-murine-megakaryopoiesis-using-transmission

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El presente protocolo describe un nuevo método de identificación de una población de enucleación eritroblastos ortocromáticas por el flujo de imágenes multiespectrales citometría, proporcionando una visualización del proceso de enucleación eritroblastos.

Identificación de un murino eritroblasto subpoblación Enriquecido en enucleación Eventos Multi-espectral Imaging Citometría de Flujo

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Los monocitos son importantes mediadores de la Arteriogénesis en el contexto de la enfermedad arterial periférica. Utilizando una matriz similar a la membrana del sótano y microscopia intravital, este protocolo investiga monocito recalada y relacionados con el tumor angiogénesis después de la inyección de monocitos en el modelo murino de la ligadura de la arteria femoral.

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

Presentamos un protocolo para estudiar la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático en células enteras después de la modificación genética utilizando microscopía electrónica correlativa de luz y volumen incluyendo ascorbato peroxidasa 2 y tinción de peroxidasa de rábano picante, seccionamiento en serie de células con y sin el gen objetivo en la misma sección, y la toma de imágenes en serie a través de microscopía electrónica.

Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Describimos aquí el método para obtener imágenes de megacariocitos y proplatados en la médula del hueso del cráneo de ratones vivos utilizando microscopía de dos fotones.

In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

Aquí, presentamos una estrategia de inmunofenotipificación para la caracterización de la diferenciación de megacariocitos, y mostrar cómo esa estrategia permite la clasificación de megacariocitos en diferentes etapas con un clasificador de células activado por fluorescencia. La metodología se puede aplicar a tejidos primarios humanos, pero también a megacariocitos generados en cultivo in vitro.

Inmunofenotipado Y Clasificación Celular De MKs Humanos De Fuentes Primarias Humanas O Diferenciados In Vitro De Progenitores Hematopoyéticos

Aquí se presenta un procedimiento de herida punzante para la formación de trombos hemostáticos. Los trombos formados son grandes y tienen cientos de micras de diámetro. Por lo tanto, los enfoques de imágenes de volumen son apropiados. Sugerimos la microscopía electrónica de transmisión de área amplia montada como un enfoque de alta resolución disponible para muchos y detallamos un protocolo preparativo.

Hemostasia de heridas punzantes y preparación de muestras para el análisis de microscopía electrónica de área amplia montada

Aprende a analizar la ultraestructura de megacariocitos en médula ósea de ratón mediante microscopía electrónica de transmisión. Este protocolo permite identificar etapas de maduración in situ con alta resolución.

In situ Exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión

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